CN111690665A - 一种分离自砂梨的具有抗黑斑病功能的基因PpHSP21及其应用 - Google Patents

一种分离自砂梨的具有抗黑斑病功能的基因PpHSP21及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分离自砂梨的具有抗黑斑病功能的基因PpHSP21及其应用，属于基因工程技术领域；所述基因PpHSP21及其编码蛋白的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明通过构建基因PpHSP21的植物超表达载体和沉默载体，将其利用农杆菌介导的遗传转化方法导入植株中，显示在植物中超表达PpHSP21，可显著提高植物的抗黑斑病的能力。本发明所述基因PpHSP21的发现及鉴定，为植物抗逆分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。

Description

一种分离自砂梨的具有抗黑斑病功能的基因PpHSP21及其 应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种分离自砂梨的具有抗黑斑病功能的基因PpHSP21及其应用。
背景技术
梨是世界上产量最高的水果之一，起源于中国西部和西南部的山区。随着全球气候变暖，极端气候事件的频繁发生导致梨越来越受到生物和非生物胁迫的影响。其中，黑斑病是影响其生长、发育、产量和果实品质的主要生物胁迫之一。叶片发病，病斑初期呈米粒大小的黑色斑点，而后病斑面积不断扩大，呈圆形或近圆形，病斑颜色逐渐加深，呈灰黑色至黑褐色。果实发病，果实表面有圆形或椭圆形斑点，病斑的颜色通常为黑色或深棕色，果实表面略微凹陷，病果腐烂严重，容易掉落。枝条发病，枝条表面会形成椭圆形或不规则的明显凹陷，并且在病健交界处经常会出现裂纹，尖端容易断裂或死亡，因此黑斑病严重影响梨果实产量和品质。
砂梨是种植广泛品种，对黑斑病具有较强抗性，是研究木本植物抗病性及克隆有关抗病基因的理想材料。因此，克隆砂梨中与抗病相关基因是抗病基因工程的关键和基础。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种分离自砂梨的具有抗黑斑病功能的基因PpHSP21及其应用，为植物抗逆分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种分离自砂梨的具有抗黑斑病功能的基因PpHSP21，所述基因PpHSP21的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了所述基因PpHSP21的编码蛋白，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
优选的，所述编码蛋白包含226个氨基酸，等电点为9.4，分子量为24.92KDa。
本发明提供了一种扩增上述基因PpHSP21的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种表达上述基因PpHSP21的超表达载体，所述超表达载体以pCAMIBA1300为基础载体，将所述基因PpHSP21***到所述基础载体的Xbal I和BamH I多克隆位点之间。
本发明还提供了上述基因PpHSP21或上述超表达载体在植物抗黑斑病遗传改良中的应用。
所述植物包括梨或拟南芥。
本发明还提供了一种提高植物黑斑病抗性的方法，在植物的基因组中超表达基因PpHSP21，所述基因PpHSP21的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了一种分离自砂梨的具有抗黑斑病功能的基因PpHSP21及其编码蛋白，且基因序列如SEQ ID NO.1所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。利用qRT-PCR技术分析在黑斑病病原处理下植株所述基因PpHSP21的时间表达模式，结果表明所述基因PpHSP21受黑斑病诱导，且随处理时间延长，所述基因PpHSP21的表达量也逐渐增加，3d表达量达到峰值，随后缓慢降低，说明基因PpHSP21对于黑斑病胁迫有十分强烈的响应，表明PpHSP21是一个潜在的抗黑斑病基因。通过构建基因PpHSP21的植物超表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将基因PpHSP21导入植株中，使梨抗黑斑病基因PpHSP21在植物中超表达(流程如图1所示)，可显著提高植物的抗黑斑病的能力。本发明所述基因PpHSP21的发现及鉴定，为植物抗逆分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。
附图说明
图1为本发明的技术流程图；
图2为不同黑斑病菌株生长状况；
图3为不同黑斑病菌株致病性强弱；
图4为筛选部分湖熟基地的抗病感病品种；
图5为308份梨品种抗黑斑病评价结果；
图6为所述基因PpHSP21相应黑斑病时间表达模式示意图；其中，图6A是PpHSP21在黑斑病胁迫下的相对表达，图6B是PpHSP21在抗病和感病品种中黑斑病胁迫下的相对表达；
图7为转PpHSP21拟南芥阳性鉴定及PpHSP21基因的沉默效果；
图8为转PpHSP21拟南芥离体叶片接种黑斑病菌株发病症状及叶绿素含量分析；其中A是21天苗龄的拟南芥叶片在黑斑病处理4天后的表型；B和C分别是21天苗龄的拟南芥叶片在黑斑病处理4天后的叶绿素提取及叶绿素测定；D是60天大的杜梨叶片在黑斑病处理5天后的表型；E和F分别是60天苗龄的杜梨叶片在黑斑病处理5天后的叶绿素提取及叶绿素测定；
图9为超表达PpHSP21的拟南芥叶片和沉默PpHSP21的杜梨叶片接种黑斑病H2O2含量测定(A和C)及H2O2的DAB染色实验结果(B和D)。
具体实施方式
本发明提供了一种分离自砂梨的具有抗黑斑病功能的基因PpHSP21，所述基因PpHSP21的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述基因PpHSP21为对黑斑病响应强烈的热激蛋白编码基因。
发明提供了所述基因PpHSP21的编码蛋白，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。本发明所述编码蛋白优选包含226个氨基酸，等电点为9.4，分子量为24.92KDa。
本发明提供了一种扩增上述基因PpHSP21的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如PpHSP21-F1(SEQ ID NO.3)所示：ATGGCTTCAACATTGGCTTTGTC，所述下游引物的核苷酸序列如PpHSP21-R1(SEQ ID NO.4)所示：CTGAATTGCAACGTCAATAACC。
本发明利用上述引物对克隆所述基因PpHSP21时，优选的以砂梨cDNA为模板，利用PCR技术克隆得到上述基因PpHSP21的cDNA全长序列，PCR程序优选包括：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸5min。
本发明还提供了一种表达PpHSP21 CDS的超表达载体，所述超表达载体以pCAMIBA1300为基础载体，将所述基因PpHSP21***到所述基础载体的Xbal I和BamH I酶切位点之间。本发明对所述超表达载体的构建方法并没有特殊限定，利用本领域的常规载体构建方法即可。
本发明还提供了上述基因PpHSP21或上述超表达载体在植物抗黑斑病遗传改良中的应用。本发明所述植物优选包括梨或拟南芥。
本发明还提供了一种提高植物黑斑病抗性的方法，在植物的基因组中超表达基因PpHSP21，所述基因PpHSP21的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述超表达优选包括：利用利用同源重组技术，将SEQ ID NO.1所示的基因连接到超表达载体pCAMIBA1300，然后转化DH5α感受态细胞，涂板，摇菌，然后将菌液送生工生物公司测序，将测序结果正确的大肠杆菌，用AxyPrep质粒DNA小量提取试剂(Axygen,USA)盒提取质粒，将35S::P1300-PpHSP21/CDS转入农杆菌感受态细胞(GV3101)，再利用菌液侵染所述植物。
下面结合实施例对本发明提供的分离自砂梨的具有抗黑斑病功能的基因PpHSP21及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
梨Pp H SP21基因全长cDNA的克隆、超表达载体及基因沉默载体的构建
通过梨黑斑病转录组筛选得到对黑斑病响应强烈的热激蛋白编码基因，命名为PpHSP21，基因ID号Pbr040066.1，根据其核苷酸序列，设计扩增该基因全长和非保守片段同源重组引物为：
基因全长同源重组引物：
PpHSP21-F2(SEQ ID NO.5):5’-gagaacacgggggactctagaATGGCTTCAACATTGGCTTTGTC-3’；
PpHSP21-R2(SEQ ID NO.6):5’-gcccttgctcaccatggatccCTGAATTGCAACGTCAATAACC-3’；
以砂梨cDNA为模板，采用高保真酶进行扩增，扩增体系为50μL体系：Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase 1μL，2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTP Mix(10mMeach)1μL，正向引物和反向引物各2μL，模板DNA 1μL，ddH2O补足50μL。扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸5min。
双酶切体系：Xbal I/BamH I 10μL，10×Buffer 1μg，质粒1μL，ddH2O补足50μL。
重组体系：线性化载体1000ng，***片段80ng，5×CE II Buffer4μL，Exnase II 2μL，ddH2O补足20μL。
采用AxyPrep-96 DNA凝胶回收试剂盒(Axygene,USA)回收纯化基因全长及片段，利用同源重组技术，将基因CDS分别连接到超表达载体pCAMIBA1300和基因瞬时沉默载体pTRV2，然后转化DH5α感受态细胞，涂板，摇菌，然后将菌液送生工生物公司测序，将测序结果正确的大肠杆菌，用AxyPrep质粒DNA小量提取试剂(Axygen,USA)盒提取质粒，分别将35S::P1300-PpHSP21/CDS和pTRV2-PpHSP21/CDS入农杆菌感受态细胞(GV3101)，-80℃保存备用。
实施例2
拟南芥的遗传转化及阳性鉴定
一、拟南芥遗传转化
1)取农杆菌菌株P1300-PpHSP21/CDS，在相应抗生素(含50mg/L Kanamycin+50mg/L Rifampicin)的LB固体培养基上划线，28℃培养2～3天。
2)挑单克隆，在LB液中振荡培养，28℃，220rpm，16～24h。
3)按照1：100扩培，28℃过夜振荡培养。
4)5000g，20min室温离心，收集菌体。
5)菌体重悬于等同菌液体积的转化介质中(1/2MS，5％蔗糖，10μL/L6-BA，pH＝5.7)。
6)将待转化拟南芥(一般抽薹10cm高时)，剪去角果和已开放的花。
7)将待转化介质中加入Sillwett-77至终浓度0.025％。
8)把拟南芥花序浸泡菌液中，抽真空至380mmHg，浸泡10～20min。
9)用保鲜膜保湿，22℃暗处放置过夜。
10)取出植株，正常培养，收取种子，待筛选。
二、转PpHSP21拟南芥阳性苗筛选
各转基因材料按照每个处理100粒种子进行筛选，分别于7d、20d后统计抗性苗数。筛选步骤如下：
1)种子消毒：拟南芥种子T1，75％酒精表面消毒1min，灭菌水清洗2～3次，然后10％次氯酸钠消毒5min，灭菌水清洗3～5次。
2)将灭菌的种子接种于1/2MS固体培养基(含50mg/L潮霉素、100mg/L特美汀和250mg/L羧变)。
3)4℃冰箱暗处理2天，转移至培养箱(光照16小时/黑暗8小时，光照强度8000Lux，温度23℃)。
4)观察种子生长情况。非转基因幼苗会变黄而逐渐死亡，而转基因植株则生长。
5)绿苗长至4片子叶，转移至营养土中培养。
重复以上步骤连续筛选，得到T3代PpHSP21纯和转基因拟南芥用于功能验证。
三、转基因拟南芥分子检测
转基因拟南芥叶片DNA提取，步骤如下：
1)取少量拟南芥叶片放入1.5mL离心管中，液氮研磨至粉末状，加入600μL CATB提取液，CTAB提取液配制方法见表1；
2)充分混匀后放入65℃水浴锅水浴90min，期间每30min颠倒混匀一次；
3)水浴完成后，加入700μL 24:1(氯仿：异戊醇)混合抽提液，剧烈颠倒混匀，常温下12000r/min离心15min，吸取上层清液(约500μL)转移至新的1.52mL离心管中；
4)加入与上清等体积的预冷异丙醇，上下颠倒混匀后，放于-20℃冰箱沉淀(沉淀时间可延长)；
5)沉淀完成后取出，12000r/min离心10min。倒掉上清，加入1mL预冷的75％乙醇，清洗3～5两次，弃酒精，于通风橱内风干；
6)每管加入20～30μL ddH2O溶解DNA，溶解好的DNA保存-20℃冰箱。
浓度检测，每个样品取1μL，于NanoDrop2000超微量分光光度计(Thermo，USA)测量，其OD260/OD280比值为1.8～2.0范围内时，DNA纯度较高。同时也通过凝胶电泳检测。
表1 CTAB提取液配方
Figure BDA0002609790260000071
以上述所提取DNA为模板，以基因的特异性引物进行PCR鉴定获得了多株阳性植株(图7中A)，引物序列为PpHSP21-F1(SEQ ID NO.3)所示：ATGGCTTCAACATTGGCTTTGTC，PpHSP21-R1(SEQ ID NO.4)所示：CTGAATTGCAACGTCAATAACC。另对获得的阳性植株PpHSP21基因进行半定量分析，以拟南芥AtActin为内参，内参引物序列为AtActin-F(SEQ IDNO.7)：5’-GGTGTCATGGTTGGTATGGGTC-3’；AtActin-R(SEQ ID NO.8)：5’-CCTCTGTGAGTAGAACTGGGTGC-3’，半定量引物序列为PpHSP21-F3(SEQ ID NO.9):5’-TCTCCTTTTGGTATTGCAGGTCT-3’；PpHSP21-R3(SEQ ID NO.10):5’-GGCATGTCGAACCGCATTTT-3’。结果显示在内参亮度一致的条件下，阳性株系#5、#6、#14的PpHSP21表达量较高(图7中B和C)，选取其用于后续实验功能验证。
实施例3
308份梨品种的接种黑斑病的田间评价
将从江苏省农科院收集的不同的黑斑病菌种接种到PDA的平板上(图2)，每日观察其形态并测量其病斑直径，统计至第六天，筛选出致病性强的黑斑病菌株6-4及8-7(图3)，用于后期的接种实验。将叶片用5％NaClO消毒1分钟，并用无菌水洗涤5次。将叶片放在带有消毒和湿润纱布的瓷盘上。用无菌针头在叶子上打上六个孔，然后用保鲜膜将其弄湿，整夜恢复。将黑斑病菌株在PDA培养基上于28℃培养6天。将黑斑病菌柄贴在叶片上，将叶片在28℃培养箱中培养6天，在2天后除去菌饼，统计第六天叶片的病斑直径，根据江苏省叶片抗病等级分级标准表2，筛选出60份(占总数20％)抗黑斑病和59份(占总数19％)高感黑斑病品种(图4，5)，用于后期实验。
表2 叶片抗病等级分级标准
Figure BDA0002609790260000081
实施例4
黑斑病处理下PpHsP21基因的qRT-PCR分析
对秋子梨叶片接种黑斑病菌株，且在处理前及处理后0.5d、3d、5d、7d分别取样，进行相对表达量分析，结果显示：在处理3d时PpHSP21基因对黑斑病响应强烈，随着处理时间延长表达量降低(如图6A)。前期通过对湖熟田间308份梨品种进行黑斑病抗性鉴定，筛选出60份抗黑斑病和59份高感黑斑病品种(图5)，对其中的七月红香梨(HX，抗，种间杂交)以及威宁香面梨(XM，高感，砂梨品种)接种黑斑病菌株，取样时间为0h、12h、36h、96h、144h，进行相对表达量分析，结果显示：处理36小时后，抗病、感病品种中的PpHSP21基因均对黑斑病响应强烈，PpHSP21在抗黑斑病品种中表达量比高感品种中表达量高(如图6B)。进行RNA提取采用福际植物总RNA提取试剂盒，cDNA第一链的合成参照TransGen反转录试剂盒的操作手册进行(全式金，中国)。
定量PCR反应程序为：95℃3min；95℃3s，60℃10s，72℃30s，45个循环；95℃5s；65℃1min。
实施例5
转PpHSP21拟南芥抗黑斑病分析
为进一步验证转P1300-PpHSP21/CDS基因拟南芥对黑斑病抗性，用营养土培养拟南芥野生型(以下简称WT)和超表达株系5、6、14(以下简称OE-5、OE-6、OE-14)，每株各选取8片生理状态一致的叶片，对其进行离体叶片法接种黑斑菌株，48h后观察表型，结果显示：相对于WT，OE-5、OE-6、OE-14接种黑斑病菌株后发病较轻(如图8中A)，说明PpHSP21能够增强植物对黑斑病的抗性。通过对植物叶片叶绿素的测定能够评价植物的抗逆能力，当植物遭受外界胁迫时，该参数明显降低。因此，黑斑病处理4d后，对WT和OE-5、OE-6、OE-14的叶绿素分析表明,OE-5、OE-6、OE-14的叶绿素显著高于WT(图8中B和C)，说明PpHSP21增强了植物对黑斑病的抵抗能力。
用二氨基联苯胺(DAB)对野生型和转基因拟南芥材料进行组织化学染色，定性分析H2O2的积累，结果显示，黑斑病处理4天后，OE-5、OE-6、OE-14的H2O2含量明显低于WT(图9中A)，黑斑病处理4天后，测定野生型和转基因拟南芥H2O2含量(过氧化氢提取试剂盒，南京建成)，野生型过氧化氢含量高于转基因系(图9中B)，显示PpHSP21参与了活性氧的清除，增强了植株对胁迫的耐受性。综上表明，PpHSP21具有增强植物黑斑病抗性的功能。
实施例6
VIG S材料鉴定及黑斑病抗性分析
一、杜梨用瞬时法转化
分别培养pTRV1和pTRV2农杆菌，收集pTRV1和pTRV2二次划线后的菌斑，用侵染液(配方如表3所示)将两种液体的OD值分别调节到1.0，将含有比例为1:1的pTRV1和pTRV2基因混合物的农杆菌加入100mM/L的AS(乙酰丁香酮)注射入60天苗龄梨(Pyrusbetulaefolia)叶片中使PpHSP21基因在梨中沉默。注射后杜梨要在室温下避光2～3天，保持一定湿度。
表23侵染液的配方
Figure BDA0002609790260000101
二、基因沉默杜梨株系分子检测
DNA提取方法同实施例2。
三、RNA的提取及半定量分析
对PpHSP21基因沉默的杜梨株系进行进行沉默效果分析，以梨的Tubulin为内参，内参引物序列为Tubulin-F(SEQ ID NO.11)：5’-TGGGCTTTGCTCCTCTTAC-3’；Tubulin-R(SEQID NO.12)：5’-CCTTCGTGCTCATCTTACC-3’，半定量引物序列为PpHSP21-F3(SEQ ID NO.9):5’-TCTCCTTTTGGTATTGCAGGTCT-3’；PpHSP21-R3(SEQ ID NO.10):5’-GGCATGTCGAACCGCATTTT-3’。结果显示：在内参亮度一致情况下(图7中D)，基因沉默株系#1，#2，#3(以下简称TRV2-1、TRV2-2、TRV2-3)的PpHSP21沉默效果最好(图7中E)，选取其用于后续实验功能验证。
为进一步验证TRV2-1、TRV2-2、TRV2-3对黑斑病抗性，用营养土培养杜梨(WT、TRV2-1、TRV2-2、TRV2-3)，每株各选取6片生理状态一致的叶片，对其进行离体叶片法接种致病性强的黑斑病菌种6-4，5天后观察表型，结果显示，相对于WT，PpHSP21基因沉默株系WT、TRV2-1、TRV2-2、TRV2-3接种黑斑病菌株后发病较重(如图8中D)，说明PpHSP21能够增强植物对黑斑病的抗性。通过对植物叶片叶绿素的测定能够评价植物的抗逆能力，当植物遭受外界胁迫时，该参数明显降低。因此，黑斑病处理5d后对WT和基因沉默株系TRV2-1、TRV2-2、TRV2-3叶绿素分析表明，基因沉默株系TRV2-1、TRV2-2、TRV2-3的叶绿素含量明显低于WT(图8中E和F)说明沉默PpHSP21基因降低了植物对黑斑病的抵抗能力。黑斑病处理5天后，用二氨基联苯胺(DAB)对杜梨叶片进行组织化学染色，定性分析H2O2的积累，结果显示：黑斑病处理后，基因沉默株系(TRV2-1、TRV2-2、TRV2-3)的H2O2含量明显高于WT(图9中C)，同时测定WT和基因沉默株系(TRV2-1、TRV2-2、TRV2-3)H2O2含量(过氧化氢提取试剂盒，南京建成)，WT过氧化氢含量低于沉默株系(图9中D)，说明沉默PpHSP21降低了植株对黑斑病胁迫的耐受性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种分离自砂梨的具有抗黑斑病功能的基因PpHSP21及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 681
<212> DNA
<213> Pyrus pyrifolia
<400> 1
atggcttcaa cattggcttt gtcttcttcg tcacctttgc tttcaaacaa agcaaggtct 60
tcaatcacag caaacgccac tctgccatcc tcggccgcct ttccgttgcg gcggaatagg 120
ctgccggtgg tgagagctca ggccggtgga gacggcaagt tggacgtgca agtcaatcag 180
ggcaaccaag ggactgatgt ggagaggagg ccaaagagat tggctgtgga catttctcct 240
tttggtattg caggtctatt agatcccatc tccccagtga gaacaatgcg gcaaatgctg 300
gacacagtcg accggctttt cgaagacacg gtggcattcc cgggaagaaa cagagcagca 360
ggggaagtgc gcgcgccttg ggacatcaaa gacgacgaac acgaaatcaa aatgcggttc 420
gacatgccgg ggctttcgaa ggaggacgtg aaggtgtcgg tcgaggacga tgtgctagtt 480
ataaagggag agcagaagaa ggaagaaggc ggcgacgatt cgtggtcgag caggagcttt 540
agctcctaca atacccgcct tcagctaccg gataattcgg agaaggacaa gatcaaggcg 600
gagttcaaga atggtgttct ctacatagcc attcctaaga ccaaagttga acgcaaggtt 660
attgacgttg caattcagtg a 681
<210> 2
<211> 226
<212> PRT
<213> Pyrus pyrifolia
<400> 2
Met Ala Ser Thr Leu Ala Leu Ser Ser Ser Ser Pro Leu Leu Ser Asn
1 5 10 15
Lys Ala Arg Ser Ser Ile Thr Ala Asn Ala Thr Leu Pro Ser Ser Ala
20 25 30
Ala Phe Pro Leu Arg Arg Asn Arg Leu Pro Val Val Arg Ala Gln Ala
35 40 45
Gly Gly Asp Gly Lys Leu Asp Val Gln Val Asn Gln Gly Asn Gln Gly
50 55 60
Thr Asp Val Glu Arg Arg Pro Lys Arg Leu Ala Val Asp Ile Ser Pro
65 70 75 80
Phe Gly Ile Ala Gly Leu Leu Asp Pro Ile Ser Pro Val Arg Thr Met
85 90 95
Arg Gln Met Leu Asp Thr Val Asp Arg Leu Phe Glu Asp Thr Val Ala
100 105 110
Phe Pro Gly Arg Asn Arg Ala Ala Gly Glu Val Arg Ala Pro Trp Asp
115 120 125
Ile Lys Asp Asp Glu His Glu Ile Lys Met Arg Phe Asp Met Pro Gly
130 135 140
Leu Ser Lys Glu Asp Val Lys Val Ser Val Glu Asp Asp Val Leu Val
145 150 155 160
Ile Lys Gly Glu Gln Lys Lys Glu Glu Gly Gly Asp Asp Ser Trp Ser
165 170 175
Ser Arg Ser Phe Ser Ser Tyr Asn Thr Arg Leu Gln Leu Pro Asp Asn
180 185 190
Ser Glu Lys Asp Lys Ile Lys Ala Glu Phe Lys Asn Gly Val Leu Tyr
195 200 205
Ile Ala Ile Pro Lys Thr Lys Val Glu Arg Lys Val Ile Asp Val Ala
210 215 220
Ile Gln
225
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggcttcaa cattggcttt gtc 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgaattgca acgtcaataa cc 22
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagaacacgg gggactctag aatggcttca acattggctt tgtc 44
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcccttgctc accatggatc cctgaattgc aacgtcaata acc 43
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtgtcatgg ttggtatggg tc 22
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cctctgtgag tagaactggg tgc 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tctccttttg gtattgcagg tct 23
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggcatgtcga accgcatttt 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgggctttgc tcctcttac 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccttcgtgct catcttacc 19

Claims (8)

1.一种分离自砂梨的具有抗黑斑病功能的基因PpHSP21，其特征在于，所述基因PpHSP21的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述基因PpHSP21的编码蛋白，其特征在于，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述编码蛋白，其特征在于，所述编码蛋白包含226个氨基酸，等电点为9.4，分子量为24.92KDa。
4.一种扩增权利要求1所述基因PpHSP21的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.一种表达权利要求1所述基因PpHSP21的超表达载体，其特征在于，所述超表达载体以pCAMIBA1300为基础载体，将所述基因PpHSP21***到所述基础载体的Xbal I和BamH I多克隆位点之间。
6.权利要求1所述基因PpHSP21或权利要求5所述超表达载体在植物抗黑斑病遗传改良中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述植物包括梨或拟南芥。
8.一种提高植物黑斑病抗性的方法，其特征在于，在梨的基因组中超表达基因PpHSP21，所述基因PpHSP21的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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