CN104480118B - 花生lrr‑rlk基因及在烟草抗青枯病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种花生青枯病抗性相关LRR类受体蛋白激酶类基因AhRLK6及其超表达载体的构建，更涉及到了该花生AhRLK6基因在烟草抗青枯病基因工程中的应用，属于植物基因工程技术领域。该基因含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。构建超表达载体转化翠碧一号烟草，通过分子检测对转基因植株进行青枯菌接种，其在烟草中超表达可显著提高转基因烟草对青枯病的抗性，表明AhRLK6可能参与植物对青枯菌的防御反应，这将为植物青枯病抗病遗传育种奠定了基础，将大力促进烟草抗青枯病基因工程的发展与应用。

Description

花生LRR-RLK基因及在烟草抗青枯病中的应用

技术领域

本发明涉及一种花生青枯病抗性相关LRR类受体蛋白激酶类基因AhRLK6及其超表达载体的构建，更涉及到了该花生AhRLK6基因在烟草抗青枯病基因工程中的应用，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的青枯病是世界范围内最为广泛的细菌性病害之一，能侵染54个科的450余种植物。作为一种土传性病害，花生青枯病危害十分严重，会造成花生减产甚至绝收，严重威胁花生产量和品质。通过常规的化学药剂和生物防治并不能有效的防治该病的发生，通过合理轮作、间作和套作也不能真正有效的解决病害的流行和传播，最有效的手段还是培育抗病品种，但是传统杂交育种方法选育出的抗病品种存在抗性与高产优质负相关的问题，抗病相关基因的克隆以及利用基因工程将抗病相关基因转化花生获得高产优质抗青枯病花生品种是有效解决花生受青枯病侵染的有效途径。

植物在长期的进化过程中不断受到外界环境和细胞内部的刺激，进而产生一系列的信号转导对这种刺激做出应答，从而引发植物产生病原相关分子模式(pathogen-ssociated molecular patterns，PAMPs)引发的免疫反应（pattern triggered immunityPTI）以及效应子引发的免疫反应(effectortriggered immunity ETI)，而作为识别信号的质膜受体的蛋白激酶则通过可逆磷酸化调控机制参与信号转导，蛋白激酶的参与在细胞的信号传递过程中发挥着重要的作用。因这类蛋白激酶在结构和分子功能上和动物上发现的受体蛋白激酶 (receptor protein kinase，RPK) 相似，但是大多数的PRK还未发现其配体，故称它们为类受体蛋白激酶。目前已从植物中鉴定得到多个与动物受体蛋白激酶同源的基因,由于这类基因产物的受体功能还未得到证实,大多数受体蛋白的天然配体还未被发现,故称它们为类受体蛋白激酶( receptor-like protein kinase,RLK)。富亮氨酸重复的类受体蛋白激酶(1eucine-rich repeat receptor-like kinase，LRR-RLK)是目前在植物中鉴定最多的一类RLK。LRR-RLK 典型的结构包括胞外的LRR结构域，胞内的激酶区和一个跨膜区。其中LRR结构域具有保守的L-x-x-L-x-L-x-x-N基序，在病原菌侵染植物寄主产生的PTI免疫反应中参与识别病原菌的PAMPs，再通过C端的激酶区激活下游的信号转导，进而使植物产生防御免疫反应。LRR-RLK编码产物除了参与植物的生长发育调控、激素的信号转导、生物非生物胁迫等，还参与植物的抗逆抗病防御反应。水稻的抗白枯病基因Xa21具有典型的LRR-RLK的结构特征，21个LRR结构域能够识别病原菌的配体，在胞内激酶的作用下引发水稻的抗白枯病防御反应。ERECTA是拟南芥上一个能抗青枯病LRR-RLK基因，通过胞外激酶区磷酸化调控下游基因对青枯病的防御反应，另外ERECTA在拟南芥中对坏死性真菌(Plectosphaerella cucumerina)的抗性反应。FLS2也是属于亮氨酸重复序列的受体蛋白激酶（LRR-RLK，FLS2是从对flg22不敏感的拟南芥突变体中图位克隆得到，其序列在植物中高度保守，编码1173个氨基酸，可以细菌的鞭毛蛋白flg22互作诱发植物产生抗病反应。随着基因组学研究的深入，越来越多LRR-RLK将会被克隆，其参与的植物抗病抗逆作用机理以及植物与病原菌互作的机制也将会被阐释。

本发明针对以上背景技术，根据花生抗感青枯病品种接种青枯菌后mRNA与花生生物非生物胁迫测序构建的基因芯片杂交结果在抗病品种上获得一个受青枯菌诱导上调表达2倍的LRR-RLK基因，通过RACE技术获得其全长cDNA序列，该基因含有8个与青枯菌受体结合的LRR基序，蛋白保守域分析具有典型的LRR-RLK类受体蛋白激酶结构特征。亚细胞定位于细胞膜上，在抗感花生品种接种青枯菌后抗病品种能够持续上调表达，而感病品种则变化不大，构建过量表达载体通过农杆菌介导转化烟草表现对青枯病的抗性。通过对转基因烟草接种青枯菌后防御相关基因的分析，推测AhRLK6可能参与植物对青枯菌的防御反应。这就为植物抗青枯病的分子机理提供理论基础。

发明内容

本发现提供了一种受青枯菌诱导上调表达花生LRR-RLK基因AhRLK6及其在烟草抗青枯病基因工程中的应用，将大力促进烟草抗青枯病基因工程的发展与应用。

本发明首先提供了一种LRR类受体蛋白激酶类基因，命名为AhRLK6基因，该基因含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。所述AhRLK6基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。花生AhRLK6基因能够显著提高烟草青枯病的抗性能力，这为花生抗青枯病的分子机理提供理论基础。

本发明的花生AhRLK6基因主要通过抗青枯病花生品种在接种青枯菌和非接种的mRNA与其杂交获得了大量的基因表达差异的信息，对青枯菌诱导差异表达上调2倍的LRR-RLK基因进行全长cDNA的克隆，克隆全长基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了包含所述花生LRR类受体蛋白激酶类基因的超表达载体；以及，所述超表达载体的构建方法：酶切连接替换植物表达载体pBI121-GUSA中的GUS基因，构建CaMV 35S启动子驱动AhRLK6基因的植物表达载体pBI121-AhRLK6-OE。

最后，本发明提供了所述的花生LRR类受体蛋白激酶类基因或所述的超表达载体在烟草抗青枯病基因工程中的应用。

本发明的花生AhRLK6基因功能鉴定是通过酶切连接替换植物表达载体pBI121-GUSA中的GUS基因，构建CaMV 35S启动子驱动AhRLK6基因植物表达载体pBI121-AhRLK6-OE，将其转化EHA105 农杆菌，通过叶盘法将其导入翠碧一号烟草上，对转基因烟草进行青枯菌的接种，进而对其进行抗性鉴定，结果证明提高了该转基因对烟草的抗青枯病性。

本发明的花生AhRLK6基因超表达烟草相比野生型烟草对青枯病抗病能力显著提高，表明该基因在植物抗青枯病基因工程中具有十分重要的应用价值。

附图说明

图1为RACE获得AhRLK6基因的3’未知序列和5’未知序列以及全长cDNA的电泳图；

图2为S-TKc区多序列比较：Medicago truncatula为苜蓿GenBank登录号为:AY769943.1，Lotus japonicus为百脉根GenBank登录号为:AJ495843.1，Glycine max为大豆, GenBank登录号为: ACM89591.1，Vitis vinifera为葡萄GenBank登录号为: XM_002279527.1；

图3为AhRLK6亚细胞定位结果；

图4为AhRLK6在抗、感青枯病花生品种中的表达差异；*，**分别表明两两均值差异显著（P<0.05）和差异极显著（P<0.01）。

图5为AhRLK6超表达载体和在转基因烟草中超表达对青枯病侵染的抗性；其中a.pBI-AhRLK6-OE超表达载体的图示; b. AhRLK6超表达转基因烟草接种青枯菌的表型。

具体实施方式

【实施例1】RACE获得AhRLK6基因3’未知序列和5’未知序列

根据花生非生物和生物胁迫454测序的转录组合成花生的表达谱基因芯片（罗氏公司合成），利用抗青枯病品种接种前后芯片杂交筛选青枯菌诱导前后基因的差异表达获得候选基因片段，设计一对基因引物PRRS _6_F（5’-ACGAGATTCGCTTCATGACGAGCCTC-3’）和PRRS_6-R（5’-TCTAAGCATTCCTACCACCTCCTCTG-3’）；再根据模板单链cDNA合成过程所加的接头序列RACE-F（AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCAT）和RACE-R（ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd(T)30N-1N-3'），利用PRRS_6-R引物和RACE-F引物以及PRRS _6_F引物和RACE-R引物配对分别进行5′和3′- RACE反应，5′-RACE反应条件是94℃5min→(94℃ 30s→57℃ 30s→72℃ 2min)30 cycles→72℃10min；3′-RACE反应条件是94℃ 5min→(94℃ 30s→72℃ 2min)5cycles →(94℃ 30s→64℃ 30s→72℃ 2min)30cycles→72℃10min；根据生物信息学预测的目的条带基因的大小对PCR产物有目的的回收连接进行T-A克隆，阳性克隆送华大基因有限公司测序。将获得的5′和3′未知序列经拼接后获得其全长cDNA序列，根据全长cDNA序列设计全长cNDA引物AhRLK6- FL-F（5’-AAATTAAGGAAGAACAAATGCATACCT-3’）和AhRLK6-FL-R（5’-GCAACAACATATATTATCTTTTATACAAAAC-3’）引物从单链cDNA扩增获得全长cDNA序列，对PCR产物有目的的回收连接进行T-A克隆，阳性克隆送华大基因有限公司测序并保存质粒。AhRLK6基因的3’未知序列和5’未知序列以及全长cDNA克隆的电泳图如图1所示；其全长cDNA序列如SEQ ID No.1所示，该基因的cDNA序列全长3352bp，暂命名AhRLK6(LRR Receptor likeKinase)，经分析该基因编码992个氨基酸，5‘非翻译区长约为122 bp，3’端非翻译区长为251bp，包含有31bp的Poly(A)尾巴。从GenBank中，找到四条已知蛋白序列，分别来自苜蓿、百脉根、大豆、葡萄。利用Clustal W多序列比对软件，对蛋白激酶催化区域（S_TKc）进行多序列同源性比对分析。如（图2）所示，虽然来自不同的科属，蛋白激酶催化区域（PKc）却相当保守。

【实施例2】AhRLK6基因表达产物的亚细胞定位

对于亚细胞定位载体，通过AhRLK6-SL-F（5’-ATTAGGATCCACCATGAGAACCTCATTGTGTTGTAG-3’）和AhRLK6-SL-R（5’-ATTAGGCGCGCCAGAGATTAATTAGGTTATGATGGGT-3’）这对引物从具有完整读码框的质粒中扩增得到不包括终止密码的AhRLK6基因cDNA，5′端3′端分别带有BamH1和Asc1酶切位点，对本实验室构建的pBI-GFP和扩增得到的AhRLK6基因同时用BamH1（购自NEB公司）和Asc1（购自NEB公司）双酶切，经过连接和转化构建p35S::AhRLK6::GFP载体。通过液氮冻融法转化农杆菌GV3101，以p35S::GFP作对照，农杆菌渗入法转化本氏烟草，25℃培养48h后用荧光显微镜观察绿色荧光（激发光波长为488nm，发射光波长为532nm）。结果显示AhRLK6基因的编码产物定位在细胞膜上（图3所示）。

【实施例3】AhRLK6在抗、感青枯病花生青枯菌处理后的表达模式分析

为了分析AhRLK6基因在抗、感青枯病花生品种接种青枯菌表达上的差异，本研究采取实时荧光定量PCR方法对抗、感青枯病花生材料粤油92(YY 92）和新会小粒(XH)剪叶法接种青枯菌处理后，在不同时间点分析该基因的表达情况。采用CTAB法提取花生和烟草叶片的总RNA，根据PrimeScript™ Reverse Transcriptase逆转录酶（购自TAKARA公司）说明书进行逆转录合成单链cDNA，将单链cDNA稀释10倍，2µL为模板，以Ahactin，Ntactin为内参基因，采用Eppendorf Mastercycler ep realplex 实时荧光定量PCR仪进行定量PCR反应，按照TAKARA公司SYBR® Premix Ex Taq™试剂盒方案操作，20µL的反应体系包括10 µL 2×SYBR Premix Ex-Taq buffer，正反引物各0.5µL，补水到20µL。qRT-PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃ 15s， 60℃ 15 s，72℃ 30s，40个循环。相对表达量采用2^-△△Ct(Livak)法计算。其中△△Ct= (CT_gene - CT_actin)_处理 - (CT_gene - CT_actin)_对照。结果显示在抗病品种粤油92（YY92）上，接种后48h内表达基本没变化，接种后72h基因表达上调2倍，而在感病品种新会小粒中，接种后3h该基因相对表达就上调2.5倍，随着接种时间的延续，该基因的相对表达量也持续增加，到接种后72h基因表达上调16倍多（图4所示）

【实施例4】AhRLK6超表达载体构建与验证

通过AhRLK6-OE-F（5’-ATTAGGATCCACCATGAGAACCTCATTGTGTTGTAG-3’）和AhRLK6-OE-R（5’-ATTTAGGCGCGCCTAGAGATTAATTAGGTTATGATGGGT-3’）这对引物从具有完整读码框的质粒中扩增得到包括终止密码的AhRLK6基因cDNA开放阅读框，5′端3′端分别带有BamH1和Asc1酶切位点，对本实验室构建的由2×CaMV 35S启动子驱动的pBI121-GUSA和扩增得到的AhRLK6目的片段同时用BamH1和Asc1双酶切，回收目的片段，用T4连接酶16℃过夜连接，转化到大肠杆菌DH5α菌株，构建p35S::AhRLK6-OE超表达载体，经过PCR验证以及酶切验证确定其载体构建的正确性（图5a）。通过液氮冻融法转化农杆菌EHA105以备烟草转基因用。

【实施例5】烟草的遗传转化和转基因烟草的PCR鉴定

采取根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草，把分别带有质粒p35S::AhRLK6-OE超表达载体的农杆菌通过叶盘法转化烟草品种翠碧一号（CB-1），用100mg/L卡那霉素（Kan）筛选叶芽及根系生长，在培养过程中用500 mg/L头孢霉素（Cef）来抑制农杆菌的生长，培养条件温度25℃±2℃，光照每天14h白天/10h黑夜。共培养培养基：MS培养基+0.1mg/L NAA（a-萘乙酸）+ 1mg/L 6-BA（6-苄氨基嘌呤），诱导筛选培养基：MS培养基+0.1mg/L NAA+1mg/L 6-BA+ 100 mg/L kan +500mg/L Cef，生根培养基：MS培养基+50mg/L Kam +500mg/L Cef。NAA，6-BA，kan和Cef购自Sigma公司。

根据35S启动子和AhRLK6基因序列设计一对引物引物35S-F(5’-TGATGTGATATCTCCACTGACGTAAG-3’)和AhRLK6-R（5’-ACTCAGAGTAACTCTCAGGAATCTC-3’），CTAB法提取转基因与非转基因烟草DNA，以两种转基因植株的DNA为模板，未转化烟草DNA为对照，利用设计的35S-F和AhRLK6-R进行PCR扩增。PCR反应体系为：10×buffer 2.0µl，dNTP1.5µl，35S-F 0.5µl，AhRLK6-R 0.5µl，Taq酶0.1µl，ddH2O 14.4µl，模板DNA 1.0µl，总体积为20µl。反应程序为：94 ℃ 5 min→（94 ℃ 30 s→58℃ 30 s→72 ℃ 60 s）40 cycles→72 ℃ 10min→ hold at 4℃。

【实施例6】AhRLK6超表达转基因烟草的青枯病抗性鉴定

将获得的转基因烟草T0代抗病株系进行套袋自交收获T1代转基因种子，利用T2代转基因种子进行转基因烟草表型分析与功能鉴定。将T2代转基因株系的种子（pBI-AhRLK6- OE）以及野生型成熟种子（WT-CB-1）分别种子无菌水浸泡24h，75%酒精30s，10%过氧化氢10min,无菌水清洗5-6次，播种MS培养上，十五天后，移栽于育苗盘，一个月后选取大小一致的苗移栽于小花盆中培养9周后，对烟草小苗进行青枯菌叶脉注射接种处理，在转基因烟草接种烟草青枯菌7d后过表达烟草植株出现明显的坏死斑，而对照组WT-CB-1出现萎蔫和死亡的症状，15d后转基因烟草抗性明显表现比野生型CB-1强，相同试验至少重复三次以上，均有同一趋势结果。结果发现，AhRLK6转基因烟草对青枯病菌明显强于野生型对照(图5b)，说明AhRLK6参与了植物对青枯病菌的抗性作用。

<110> 福建农林大学

<120> 花生LRR-RLK基因及在烟草抗青枯病中的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3352

<212> DNA

<213> 花生（Arachis hypogaea ）

<400> 1

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ccataggttg gttagagtat tgtatcagag atagaagaaa caaagggaac tgtgaaacaa 120

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aaagataata tatgttgttg caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 3352

<210> 2

<211> 992

<212> PRT

<213> 花生（Arachis hypogaea）

<400> 2

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1 5 10 15

Ile Trp Leu Asn Asn Val Thr Val Thr Val Leu Gly Ser Ser Phe Ser

20 25 30

Asp Leu Asp Thr Leu Leu Lys Leu Lys Glu Ala Met Lys Gly Ser Lys

35 40 45

Ala Lys Pro Asp Ala Leu Gln Asp Trp Lys Phe Ser Thr Ser Ile Ser

50 55 60

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65 70 75 80

Val Val Ala Leu Asn Val Ser Phe Val Pro Leu Phe Gly Ser Ile Pro

85 90 95

Pro Glu Ile Gly Leu Leu Asp Lys Leu Glu Ser Leu Thr Leu Ser Ser

100 105 110

Asp Asn Leu Thr Lys Glu Leu Pro Met Glu Leu Ala Asn Leu Thr Ser

115 120 125

Leu Arg Leu Leu Asn Ile Ser His Asn Leu Phe Ser Gly Arg Phe Pro

130 135 140

Gly Asp Ile Thr Val Ala Met Thr Glu Leu Glu Thr Leu Asp Ile Tyr

145 150 155 160

Asp Asn Ser Phe Ser Gly Thr Leu Pro Glu Glu Phe Val Arg Leu Glu

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180 185 190

Pro Glu Ser Tyr Ser Glu Phe Glu Ser Leu Glu Val Leu Asn Leu Ala

195 200 205

Thr Asn Ser Leu Thr Gly Lys Ile Pro Arg Ser Leu Val Lys Leu Lys

210 215 220

Lys Leu Lys Arg Leu Ser Leu Gly Tyr Asp Asn Ser Tyr Ser Asp Val

225 230 235 240

Val Pro Thr Glu Phe Gly Ser Phe Glu Ser Leu Gln Leu Leu Asp Leu

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

Thr Asn Leu Thr Leu Ile Asn Phe Phe His Asn Lys Leu Arg Gly Asn

325 330 335

Ile Pro Pro Phe Val Gly Asp Leu Pro Asn Leu Glu Thr Phe Gln Val

340 345 350

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355 360 365

Ala Arg Phe Leu Tyr Phe Asp Val Thr Asn Asn His Phe Thr Gly Glu

370 375 380

Leu Pro Arg Asp Leu Cys Lys Ser Gly Arg Leu Arg Thr Phe Leu Ala

385 390 395 400

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405 410 415

Val Ser Leu Glu Lys Ile Arg Ile Ser Asp Asn Phe Leu Gln Gly Gln

420 425 430

Val Pro Pro Gly Ile Phe Lys Leu Pro Ala Val Gln Ile Ile Glu Met

435 440 445

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450 455 460

Ser Leu Ser Ile Leu Thr Leu Ser Thr Asn Asn Phe Ala Gly Arg Ile

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485 490 495

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Asn Asn Asn Phe Ile Gly Arg Val Pro Thr Gly Gly Gln Phe Val Ala

595 600 605

Phe Asn Asp Lys Ser Phe Ala Gly Asn Pro Asn Leu Cys Ser Pro His

610 615 620

Gln Pro Tyr Cys Pro Ser Ser Val Asn Thr Ala Ser Gly Lys Ser His

625 630 635 640

Asn Pro Leu Ser Ser Lys Ser Thr Lys Val Val Ile Ile Val Ile Gly

645 650 655

Ile Ser Thr Ala Val Leu Leu Ala Met Val Thr Val Tyr Ile Met Arg

660 665 670

Lys Arg Lys His Gln Lys Glu Met Ser Trp Lys Leu Thr Ala Phe Gln

675 680 685

Ser Thr Leu Lys Met Lys Ala Glu Glu Val Val Glu Cys Leu Lys Glu

690 695 700

Glu Asn Ile Ile Gly Lys Gly Gly Ala Gly Ile Val Tyr Arg Gly Thr

705 710 715 720

Thr Pro Lys Gly Thr Glu Val Ala Ile Lys Arg Leu Val Gly Gln Gly

725 730 735

Ser Gly Arg Asn Asp Tyr Gly Phe Lys Ala Glu Ile Glu Thr Leu Gly

740 745 750

Lys Ile Arg His Arg Asn Ile Met Arg Leu Leu Gly Tyr Val Ser Asn

755 760 765

Lys Asp Thr Asn Leu Leu Leu Tyr Glu Tyr Met Pro Asn Gly Ser Leu

770 775 780

Gly Glu Trp Leu His Gly Ala Lys Gly Gly His Leu Thr Trp Glu Met

785 790 795 800

Arg Tyr Arg Ile Ala Val Glu Ala Ala Lys Gly Leu Cys Tyr Leu His

805 810 815

His Asp Cys Ser Pro Leu Ile Ile His Arg Asp Val Lys Ser Asn Asn

820 825 830

Ile Leu Leu Asp Glu Asp Phe Glu Ala His Val Ala Asp Phe Gly Leu

835 840 845

Ala Lys Phe Leu Gln Asp Pro Gly Ala Ser Gln Ser Met Ser Ser Ile

850 855 860

Ala Gly Ser Tyr Gly Tyr Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Thr Leu Lys

865 870 875 880

Val Asp Glu Lys Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Leu Leu Glu

885 890 895

Leu Ile Val Gly Arg Lys Pro Val Gly Glu Phe Gly Asp Gly Val Asp

900 905 910

Ile Val Gly Trp Val Asn Lys Thr Met Ser Glu Leu Ser Gln Pro Ser

915 920 925

Asp Ala Ala Ser Val Leu Ala Val Val Asp Pro Arg Leu Asn Gly Tyr

930 935 940

Pro Leu Gly Ser Val Ile His Met Phe Asn Ile Ala Met Met Cys Val

945 950 955 960

Arg Glu Ile Gly His Ala Arg Pro Thr Met Arg Glu Val Val Tyr Met

965 970 975

Leu Thr Asn Pro Pro Gln Ser Thr Thr His His Asn Leu Ile Asn Leu

980 985 990

Claims (5)

1.一种花生LRR类受体蛋白激酶类基因，命名为AhRLK6基因，该基因序列如SEQ IDNo.1所示。

2.根据权利要求1所述的花生LRR类受体蛋白激酶类基因，其特征在于：所述的AhRLK6基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.包含如权利要求1所述花生LRR类受体蛋白激酶类基因的超表达载体。

4.一种如权利要求3所述超表达载体的构建方法，其特征在于：酶切连接替换植物表达载体pBI121-GUSA中的GUS基因，构建CaMV 35S启动子驱动AhRLK6基因的植物表达载体pBI121-AhRLK6-OE。

5.一种如权利要求1所述的花生LRR类受体蛋白激酶类基因或权利要求3所述的超表达载体在烟草抗青枯病基因工程中的应用。