CN114854749B - 一种水稻胚乳特异性表达启动子pEnd2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻胚乳特异性表达启动子pEnd2及其应用，属于生物技术和植物基因工程技术领域。所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该启动子是通过设计引物，以水稻基因组DNA为模板，利用PCR方法从水稻中分离得到的pEnd2启动子，通过其在水稻中的表达特异性，发现该启动子使β‑葡糖苷酸酶报告基因只在水稻种子胚乳中特异性表达，说明该启动子可以启动外源基因在植物的胚乳中特异性表达，适用于种子含胚乳的单子叶植物或胚乳型双子叶植物。该启动子对于水稻胚乳相关的研究具有重要的理论及实际意义，可以与对胚乳具有改善功能的基因配合使用，达到改善水稻胚乳的各方面性状。

Description

一种水稻胚乳特异性表达启动子pEnd2及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域，特别是涉及一种水稻胚乳特异性表达启动子pEnd2及其应用。

背景技术

水稻是世界上最主要的粮食作物之一，其产量对维护国家粮食安全和社会稳定有着举足轻重的作用，因此利用各种方法来提高水稻单产、改良稻米品质，有着极其重要的意义。而水稻种子主要由种皮、胚和胚乳三部分构成，其中胚乳所占比重最大。同时胚乳又是粮食作物营养的最重要组成部分，分离胚乳特异性强表达启动子对植物品质的改良具有重要的意义。

植物种子胚乳是植物营养物质运输与储存的场所，还可以作为生物反应器，利用种子作为生产空间，在胚乳中大量表达目的蛋白及其他生物活性物质。其中，以水稻胚乳为生物反应器具有显著的技术优势，如水稻产量较高，蛋白质含量介于8％～19％，有利于大规模富集；水稻胚乳可以提供相对稳定的内环境，便于蛋白质的储存且所表达的蛋白具有较好的亲和性、低敏性；由于水稻严格自交，保证了转基因在生态环境上的安全性等。然而由于控制外源基因理想表达部位、表达方式、表达时期和表达水平的限制，现已公开的相关技术实际能够应用到研发和生产种的胚乳特异性启动子很少，不能满足需求。为了控制外源基因在转基因水稻中具有一致性的表达，亟需筛选水稻胚乳中特异性表达的启动子以及调控外源基因表达的基因序列，进一步的通过设计实验利用启动子特异性调控外源基因的表达模式和调控机理，为筛选水稻胚乳特异性表达启动子提供新的途径。

基因转录起始位点上游包含顺式作用元件的DNA序列被称作为启动子，在转录水平上是一个重要的调控元件。随着分子生物学和遗传转化技术不断发展，具有不同特性的启动子相应成为研究热点。基于功能和特性分析，启动子分为三种类型，组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。其中，组织特异性启动子能够精确地控制目的基因按照人们所期望的定时、定位甚至定量地表达。目前，从植物中已经分离得到了不同类型的组织特异性启动子，如拟南芥根特异表达启动子Pyk10；拟南芥种皮特异性启动子MUM4；拟南芥α-L-***糖苷酶基因启动子；百合雄配子特异表达启动子LGC1；番茄果实特异性表达启动子2A11；水稻醇溶蛋白4a基因启动子；谷蛋白基因启动子；26kDa的球蛋白启动子；水稻醇溶谷蛋白基因Os12g16890；水稻胚乳pENP1启动子；水稻糊粉层p-NF-YB1启动子；过敏蛋白RA5基因Os07g11510等。

现有技术中利用基因工程技术改造水稻品质已有相关研究，而筛选具有组织专一性和高表达水平的启动子，是控制外源基因在水稻种子胚乳中高效特异性的表达并积累基因产物的关键因素。尽管目前已经发现了一些组织特异性启动子，但是还远远不能满足利用基因工程技术改良稻米品质的需求。因此，分离到的胚乳特异性表达的启动子对水稻品质的改良有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻胚乳特异性表达启动子pEnd2及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该启动子能驱动外源基因在水稻胚乳中特异性表达，弥补了现有技术中用于水稻基因工程研究的组织特异性表达启动子数目不足的缺陷。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种水稻胚乳特异性表达启动子，序列为来源于日本晴水稻(Oryzasativa L cv.Nipponbare)；核苷酸序列如下所示任一项：

(1)如SEQ ID NO:1所示的序列；

(2)与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少70％同源性且具有相同功能的序列；

(3)SEQ ID NO:1所示序列中添加、取代、***或者缺失一个及以上碱基且具有相同功能的序列。

本发明还提供包含所述的水稻胚乳特异性表达启动子的重组载体。

本发明还提供包含所述的重组载体的宿主细胞。

本发明还提供所述的水稻胚乳特异性表达启动子，或者所述的重组载体，或者所述的宿主细胞在培育转基因植物中的应用。

优选的是，所述转基因植物在种子胚乳中特异性表达外源基因。

优选的是，所述外源基因包括GUS基因。

本发明还提供利用所述的水稻胚乳特异性表达启动子培育转基因植物的方法，包括：将外源基因连接到所述水稻胚乳特异性表达启动子的下游，之后转入植物中，筛选种子胚乳中特异性表达所述外源基因的植株，即为转基因植物。

上述水稻胚乳特异性表达启动子的下游还连接有调控基因表达的调控元件；所述外源基因为蛋白编码基因和/或非蛋白编码基因；所述蛋白编码基因为品质改良基因；所述非蛋白编码基因为正义RNA基因和/或反义RNA基因。

优选的是，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

本发明公开了以下技术效果：

本发明的植物胚乳特异性表达启动子是通过设计引物，以水稻基因组DNA为模板，利用PCR方法从水稻中分离得到pEnd2启动子。通过其在水稻中的表达特异性实验，表明该启动子使β动葡糖苷酸酶(GUS)报告基因只在水稻种子胚乳中特异性表达。可见，本发明的启动子可以启动外源基因在植物的胚乳中特异性的表达，适用于任何种子具有胚乳的植物，即单子叶植物或胚乳型双子叶植物。

利用本发明的启动子可提高外源基因在植物胚乳中的表达和累积水平，可改良种子品质、将具有生理活性的蛋白或短肽导入种子中创制保健型功能新品种、利用种子作生物反应器生产有用的外源蛋白或可食性疫苗，增加农产品科技附加值等。本发明的启动子为利用生物技术改良种子品质、分子医药农场等研究奠定了基础，具有极大的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的技术路线图；

图2为利用qRT-PCR的方法来分析pEnd2在基因组中所驱动的基因(基因号：Os01g0276300)的时空表达模式，以玉米UBQ作为内参基因；

图3为表示双元载体pCAMBIA1305.1结构示意图；

图4为切掉35S启动子后的pCAMBIA1305.1载体(35S-free-GUS)；LB、RB分别为pCAMBIA1305.1中T-DNA的左边界和右边界；hyg为潮霉素抗性筛选基因；gus为报告基因GUS；MCS表示多克隆位点；箭头方向表示基因或启动子表达的方向；

图5为构建好的以pCAMBIA1305.1为骨架的pEnd2-GUS表达载体简图；LB、RB分别为pCAMBIA1305.1中T-DNA的左边界和右边界；hyg为潮霉素抗性筛选基因；gus为报告基因GUS；pEnd2表示启动子；箭头方向表示基因或启动子表达的方向；

图6为35S-free-GUS转化植株的各个组织的GUS染色；A为根；B为茎；C为叶片；D为穗；E为种子(含胚和胚乳)。

图7为由pEnd2驱动GUS基因转化植株的各个组织的GUS染色；A为根；B为茎；C为叶片；D为穗；E为种子(含胚和胚乳)。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

如图1所示，首先从华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室水稻全生育期表达谱芯片数据库CREP(http://crep.ncpgr.cn)(Wang et al.,2010)上发现了一个可能是胚乳特异表达的候选基因，在美国国立生物研究所网站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上获得该基因的序列，如SEQ ID No:2所示，共1069bp，以这1069bp序列设计qRT-PCR反应引物RT-F:5’-CGGCGACGGAGAACATCTA-3’、RT-R:5’-CTCCGGCATCGTCATCTTCT-3’，通过qRT-PCR分析进一步确定其表达谱，扩增体系与程序如下：

a).反应体系：

b).反应程序(两步法)：在荧光定量PCR仪设置96℃，30s；95℃，5s；55℃，30s，40个循环；95℃，5s；60℃，1分钟；95℃，15s。

c).计算方法：用2^-△△CT法计算。实验和计算时用水稻泛素融合蛋白基因Ubiquitin(LOC_Os03g13170)为内参基因。

qRT-PCR结果显示(如图2所示)该基因仅在胚乳中表达。

在此基础上用特异性引物以PCR的方法从水稻日本晴基因组中扩增得到一个被命名为pEnd2的启动子候选片段，将该启动子候选片段pEnd2装载到双元载体pCAMBIA1305.1(如图3所示)上，装配成pEnd2-GUS载体(如图5所示)，将切掉35S启动子后的pCAMBIA1305.1载体命名为35S-free-GUS，作为阴性对照(如图4所示)，再通过农杆菌介导的遗传转化方法，将pEnd2-GUS和35S-free-GUS转入水稻受体ZH11中。获得转基因植株后通过GUS组织化学染色分析，考察该启动子在水稻各个组织中的表达变化，进而验证和克隆该启动子。检测结果表明：在转35S-free-GUS的阳性植株中水稻各个组织均无GUS表达(如图6所示)，而在转pEnd2-GUS的阳性植株中GUS基因仅在转化植株的胚乳中大量表达，在其他组织如叶片、茎秆、根、幼穗中均不表达(图7)。

﹥SEQ ID No:2

tccaagaagc agagagcgaa gcaagctcga atcgatttcc aacccagagg atttgattag

ctttgacgca gaccaagatc atctgatcaa tggcgtccat gcagaagagc cgcgaggagc

gcgcggaggc ggcggcgcac agggcggccg acgagctcca cgccgccagg cgggacgagc

ctggcggcgg cggaggcggc atgctgggca ccgtgcagga gagcgcgcgg tccctcctcg

gcgccgtccg cgacaagatc cccgggcccg gcagcggcgg cgctggcgca ggcgcagccg

ccggggaggg gaaggccgcc gaggcgaagg gcttcgcggc ggacaaggcg gagggcgcgc

ggcgcgcgct cgcgggatcc gcggcggcga ggaagggcga gacggacgag tccgcgtggc

agcacgggga ggacgtgcgg cggcgcgccg cggagaaggc cgaggaggcg cggcggcgga

gcgagcctca gccgtcgtcg gaggagaagt agccgtcgcc tcggctcgcc gccatttctc

tctgttcttg aaagcttctt cctactcggc tcacctgacc ggagtccggg acgtgtcgtg

ctcgtgcgca gggggaggtc ggcgacggag aacatctacg ggtcggcggc gagcgcggcg

gaggcgttca ggcagaagat gacgatgccg gaggacgtgg tggagcagaa gcgcgccgag

gctgccgccg gcgggaacaa gggaacagcc gccgcgacgg cgacggcgac gaacaccggc

ggggaggcgg cggcggagga ggtgatgatg cgggtgaagg cggcggacca gatgacgggg

caggcgttca acgacgtggg caagatgggg gaggagggca ccggcatggc ggccggagat

ggtgggcgcc gccgctgaga tcgccggagc cgaccgcgcg gcgccacgcc acggtgtttt

tgctcgtcgc gttttgtact aatctcagta taatctgtaa tgtaaatatg taatgcggca

gttaaaagta ataaaatatc ccctaatcac ttgtccaaag cagagaaca。

实施例2启动子的获得

(1)水稻种子胚乳特异性表达基因的筛选

荧光定量PCR筛选在水稻种子胚乳特异性表达的基因，具体如下：

选取日本晴水稻根、茎、叶片、幼穗及不同发育时期的水稻种子胚乳(5、10、15、20、25、30天)，分别提取RNA，反转录合成cDNA(TOYOBO,Rever Tra Ace,FSK-101)，通过荧光定量PCR鉴定水稻胚乳特异性表达基因(基因号：Os01g0276300)在不同组织及发育时期的表达谱，确定该基因在水稻胚乳中特异性表达。

(2)水稻种子胚乳特异性表达启动子片段的克隆

提取水稻日本晴(Oryza sativa L.公众可从中国水稻研究所获得)叶片基因组DNA作为模板，用引物1:5'-CCATGATTACGAATTCTATCCTTACAAGTTTGTTT-3'(下划线部分为接头)和引物2：5'-CTCAGATCTACCATGGTGATCAGATGATCTTGGTC-3'(下划线部分为接头)进行PCR扩增，得到2250bp的PCR产物。

PCR扩增的体系：KOD FX buffer 25μl、dNTP 6μl、基因组DNA(Nipponbare)4μl、Forward primer 2μl、Reverse primer 2μl、KOD FX 1μl、ddH₂O 10μl，PCR扩增程序如下：95℃2min；98℃30s，58℃30s，68℃2.5min，35个循环；68℃5min。

产物经过测序，该PCR具有序列表中SEQ ID No:1所示的核苷酸，将其命名为pEnd2。

﹥SEQ ID No:1

ccatgattac gaattctatc cttacaagtt tgtttcgaca tgtttttaca taaaaatatt

cttaaatatg tatcaaagag ctttcaacat ttaaattcgg tgactattga tctatgtata

gatggcgttc ctctcaaagg ttgctaattg gaacatactc atcaatggga acatgataca

tgtggtcaaa agagataaat ggggcctgat aagtcagagg gtcgagagtc cctgataagt

gaggcccaca cctatgggcc cataagtcag agagacacgt ccctttgacg tacgtgagag

gagccccacc gggacataac ataataatag cactcaaaat cttttttctt cacttggaaa

aatatcaatt gtagtttgat caaattatat tttgaatgtt atgtacttat gaccaaatca

ccgaaggaag ggaggatgac atttcacatt ttgttttgat agcacgtgtt tgttacttta

tatcagacta gatttataaa gtctaataaa tcttaattga ttatgaaagt ttctttaaga

caaatatact aataatattt ttattatttt aactaaaatg tatcattcat caaagtttta

aaattttgat tgatcttacc caaacattga aattttgtga tagaaaggag gaactagctc

acacattggt ttatcttaga aacgtgcatt ttttatcctc aagacgagaa acattttgta

gggtgtttaa gatgctagaa ggatagggag ttgccaatta gtcacaatct gaaaaagcta

aatttcttag cttgctgcta ctagtttgtt ttttacacta tataaatact tatttcaaaa

ccaggaataa aaatcaaggt cgagaatggg tagctgacgg atgttcctta aatataacat

atttggcgtg tttccgaaga taatgccagc gcattgcgaa aaaaaaattc aaaatgctaa

ggaatatatt tacagtttgg ttaattatat caatgccatt ataaatttat caattttgaa

aaataccact actatcacat aattaaaatc atgtgctgca aaacatcaaa attccacatt

atacgtctaa aacacattat gaatcgtttt gtgactactc tattttttat tttttatgga

ctaaaataaa atcgtctctt acaactcaaa gaacaacaac actatccttc ctcctgccaa

ctccacaatt ggatgcttta gttctaatca aaattttcaa tctaacattt gacatcgcta

ccacaacaaa ctgctaccac ttcaccattc ataattcgtg tacaaaataa ttgaatgaat

atcatataaa aaactacata ggaaaaaaag agaaaaataa ttgggtggtg gaggagccag

gtcgccgttc acgaccattg gcatcgctcg tcggcatgga ggggtcgccg tccacgaccg

ctcaagtcgg ctagctggca ctcattgcca gcaccagcac cattagcttg gtgctcatcg

gcgcctagac tgcgtatcgt agctgtcgaa cgtgtcgtcc tagaccttac tgcctccacc

agtgctaggt ctgctcatgt tgagctcgcc gtcgccagaa ccgactttgc gcaacctaga

tcgaaacttc atcgttaccg tgcgccgcca ctgcatatgc ttgtgtcgag agcaagcttt

gtatttagct agtcgtcact tgccgccggc gtcgtcgctg ctgattggcg ctccccacgt

tggcaagatt aggtgatcga tttggctatg gtcgttggat ttgaggttag ggttaaaagg

agacataaaa atacagtagg aaagaaaaat tcaaaacgcg tatatggatc aaattatata

aattgtaaag atatttttta aaacagatga ttttttcaat ttgcaatggc aatgatccca

ttaaccccct cccccgcttt gaggaagaag cgaacacact ccatgcgccc ccgcagcaca

cgtatgcatg gtacgtgtcc gccggcgtca cacgcggcgt gcagcgcgac gcccgcggcg

catctcggcg gccgcccgcg ccgccgcctc atccatctcc agaggattcc tccgatcctc

tcgccgccct cctttttatc ccccaccccc ctcctcctct tcatcctcca agaagcagag

agcgaagcaa gctcgaatcg atttccaacc cagaggattt gattagcttt gacgcagacc

aagatcatct gatcacatgg tagatctgag。

实施例3启动子的功能验证

1、转pEnd2水稻的获得

(1)重组载体的获得

将由实施例1得到的2250bp的PCR产物pEnd2与表达载体pCAMBIA1305.1(公众可从中国水稻研究所获得，在载体的结构示意图如图3所示)的连接是依赖于In-fusion重组的方法：先用EcoR I和NcoI双酶切载体pCAMBIA1305.1，将35S启动子切掉，再用带接头的PCR产物和经EcoR I和NcoI酶切过的载体在50℃进行In-fusion重组即可获得重组载体，将其命名为pEnd2-GUS(图5)。用EcoR I和Spe I双酶切表达载体pCAMBIA1305.1，将载体上的35S和catalase intron片段一起切掉，再用带EcoR I和Spe I接头的引物把catalase intron片段扩增出来，重新和EcoR I和Spe I酶切后的载体在50℃进行In-fusion重组即可获得不含35S的重组载体，将其命名为35S-free-GUS(图4)。

具体方法如下：

1)pCAMBIA1305.1载体用EcoR I和NcoI酶切

EcoR I和NcoI酶切体系(50μl)：pCAMBIA1305.1质粒2μg、buffer 10μl、EcoR I2μl、Nco I 2μl、ddH₂O补足到50μl，37℃酶切2小时，回收11846bp的线性化pCAMBIA1305.1。

2)带接头的启动子pEnd2 PCR产物扩增

以叶片基因组DNA作为模板，用带接头的引物进行PCR扩增出带EcoR I和NcoI接头的启动子pEnd2片段。

扩增体系(50μl)及PCR程序同上所述。

3)In-fusion重组

重组体系如下(2.5μl)：线性化的pCAMBIA1305.1载体1μl、带接头的启动子pEnd2PCR产物1μl、In-fusion酶0.5μl，50℃重组30min，得到重组产物。

4)pCAMBIA1305.1载体用EcoR I和Spe I酶切

EcoR I和Spe I酶切体系(50μl)：pCAMBIA1305.1质粒2μg、Buffer 10μl、EcoR I 2μl、Spe I 2μl，ddH₂O补足到50μl，37℃酶切2h，回收线性化pCAMBIA1305.1。

5)带接头的catalase intron PCR产物扩增

以空pCAMBIA1305.1作为模板，用带接头的引物进行PCR扩增出带EcoR I和Spe I接头的catalase intron片段。

扩增体系(50μl)及PCR程序同上所述。

6)In-fusion重组

重组体系如下(2.5μl)：线性化的pCAMBIA1305.1载体1μl、带接头的catalaseintron PCR产物1μl，In-fusion酶0.5μl，50℃重组30min，得到重组产物。

将上述测序正确的pEnd2-GUS及35S-free-GUS质粒热激转化入Trans10大肠杆菌感受态细胞，得到克隆。

提取克隆质粒，酶切检测阳性克隆，结果表明pEnd2-GUS质粒为序列表中的SEQ IDNo:1所示的pEnd2***表达载体pCAMBIA1305.1中得到的载体，且***的位置为GUS基因的前面(替换原来GUS基因前面的35S启动子)，即为重组载体。

(2)重组菌的获得

将重组载体pEnd2-GUS和35S-free-GUS热激转化根癌农杆菌EHA105菌株，得到重组菌。

提取重组菌的质粒，经过测序，该质粒分别为pEnd2-GUS和35S-free-GUS，说明含有该质粒的重组菌为阳性，命名为EHA105/pEnd2-GUS和EHA105/35S-free-GUS。

农杆菌热激转化法的具体方法如下：

1)将从-80℃冰箱中取出的农杆菌感受态放置于冰上，待其自然融化；

2)加入2μl质粒，轻轻弹匀，冰上放置30min；

3)放入液氮中5min；

4)37℃热激5min；

5)取出迅速***冰上2min，加入无抗YEP液体培养基，28℃，150rpm摇4h；

6)吸取100μl菌液均匀涂布在含有卡纳霉素，利福平的YEP平板上，28℃倒置培养3-4天。

7)挑取单克隆于加入卡纳霉素，利福平的YEP液体培养基中，28℃，200rpm摇床中培养1天。

8)从中取0.2ml转接到20ml(1/100比例稀释)同样YEP抗性培养基中，同样条件下培养到OD₆₀₀＝0.5便可进行转化愈伤组织。

(3)转pEnd2-GUS和35S-free-GUS水稻的获得及分子鉴定

1)转化

a)转化受体的选择

将成熟的水稻品种ZH11种子去壳，经过一系列消毒后进行愈伤诱导和继代培养，挑选生长旺盛的愈伤用作转化的受体。

b)遗传转化

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Hiei Y,Ohta S,Komari T,Kumashiro(1994),Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacteriumand sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.The plant Journal,6:271-282)，将含35S-free-GUS和重组载体pEnd2-GUS的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗，25℃条件下共培养3天，在含有120mg/L G418的筛选培养基上培养，筛选抗性愈伤。将筛选到的抗性愈伤在预分化培养基上培养10天，再将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。1个月后得到抗性转基因植株。

待根系生长良好，小苗长至8cm时打开盖炼苗5天，取出转基因苗并洗掉根上残留的培养基，移栽到土壤中，放到无阳光直射的温室中适当培养，然后移入室外栽培。得到T0代转基因水稻。

2)转基因阳性植株的鉴定

将T0代转基因水稻移入温室后，待其返青，然后分单株取一小段幼嫩叶片，提取其基因组DNA为模板，用PCR的方法检测转基因阳性植株。扩增片段为载体pCAMBIA1305.1上的部分片段加上启动子pEnd2的部分片段，大小为471bp。引物序列为pEnd2-F：CTTTGGTCTTCTGAGACTGTATCTT，pEnd2-R：TGTTCCCATTGATGAGTATG。

PCR扩增程序如下：95℃2min，98℃30s，58℃30s，68℃1min，35个循环，68℃5min。PCR产物经0.8％琼脂糖胶电泳检测。通过此方法，可剔除假阳性植株。

实施例4转pEnd2-GUS和35S-free-GUS水稻GUS组织化学染色法验证启动子功能

分别取阳性T0代转pEnd2-GUS和35S-free-GUS水稻的根、茎秆、叶片、幼穗、以及灌浆中期(开花后10到15天)的种子，分别将以上各组织切成适当大小并对种子进行横切或纵切。将切好的各个组织侵入GUS染液，抽真空10min，然后放入37℃培养箱中反应1h，观察是否出现GUS信号并拍照。

以T0代转35S-free-GUS水稻为阴性对照。

T0代转35S-free-GUS水稻的GUS组织化学染色结果如图6所示，可以看出，GUS基因在各个组织中均不表达。并且在图2中，发育的水稻种子中最高相对表达量即在开花后20天的水稻种子中的相对表达量达到718倍，相较于已报道的其他水稻胚乳特异性表达启动子，该启动子在胚乳中表达量极高。

T0代转pEnd2-GUS水稻的GUS组织化学染色结果如图7所示，可以看出，T0代转pEnd2-GUS水稻的GUS基因在种子的胚乳中具有表达活性(蓝色)，而在其他部位均不表达。

因此，pEnd2为启动子，其可以启动目标基因如GUS在种子的胚乳中特异表达。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> 一种水稻胚乳特异性表达启动子pEnd2及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2250

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccatgattac gaattctatc cttacaagtt tgtttcgaca tgtttttaca taaaaatatt 60

cttaaatatg tatcaaagag ctttcaacat ttaaattcgg tgactattga tctatgtata 120

gatggcgttc ctctcaaagg ttgctaattg gaacatactc atcaatggga acatgataca 180

tgtggtcaaa agagataaat ggggcctgat aagtcagagg gtcgagagtc cctgataagt 240

gaggcccaca cctatgggcc cataagtcag agagacacgt ccctttgacg tacgtgagag 300

gagccccacc gggacataac ataataatag cactcaaaat cttttttctt cacttggaaa 360

aatatcaatt gtagtttgat caaattatat tttgaatgtt atgtacttat gaccaaatca 420

ccgaaggaag ggaggatgac atttcacatt ttgttttgat agcacgtgtt tgttacttta 480

tatcagacta gatttataaa gtctaataaa tcttaattga ttatgaaagt ttctttaaga 540

caaatatact aataatattt ttattatttt aactaaaatg tatcattcat caaagtttta 600

aaattttgat tgatcttacc caaacattga aattttgtga tagaaaggag gaactagctc 660

acacattggt ttatcttaga aacgtgcatt ttttatcctc aagacgagaa acattttgta 720

gggtgtttaa gatgctagaa ggatagggag ttgccaatta gtcacaatct gaaaaagcta 780

aatttcttag cttgctgcta ctagtttgtt ttttacacta tataaatact tatttcaaaa 840

ccaggaataa aaatcaaggt cgagaatggg tagctgacgg atgttcctta aatataacat 900

atttggcgtg tttccgaaga taatgccagc gcattgcgaa aaaaaaattc aaaatgctaa 960

ggaatatatt tacagtttgg ttaattatat caatgccatt ataaatttat caattttgaa 1020

aaataccact actatcacat aattaaaatc atgtgctgca aaacatcaaa attccacatt 1080

atacgtctaa aacacattat gaatcgtttt gtgactactc tattttttat tttttatgga 1140

ctaaaataaa atcgtctctt acaactcaaa gaacaacaac actatccttc ctcctgccaa 1200

ctccacaatt ggatgcttta gttctaatca aaattttcaa tctaacattt gacatcgcta 1260

ccacaacaaa ctgctaccac ttcaccattc ataattcgtg tacaaaataa ttgaatgaat 1320

atcatataaa aaactacata ggaaaaaaag agaaaaataa ttgggtggtg gaggagccag 1380

gtcgccgttc acgaccattg gcatcgctcg tcggcatgga ggggtcgccg tccacgaccg 1440

ctcaagtcgg ctagctggca ctcattgcca gcaccagcac cattagcttg gtgctcatcg 1500

gcgcctagac tgcgtatcgt agctgtcgaa cgtgtcgtcc tagaccttac tgcctccacc 1560

agtgctaggt ctgctcatgt tgagctcgcc gtcgccagaa ccgactttgc gcaacctaga 1620

tcgaaacttc atcgttaccg tgcgccgcca ctgcatatgc ttgtgtcgag agcaagcttt 1680

gtatttagct agtcgtcact tgccgccggc gtcgtcgctg ctgattggcg ctccccacgt 1740

tggcaagatt aggtgatcga tttggctatg gtcgttggat ttgaggttag ggttaaaagg 1800

agacataaaa atacagtagg aaagaaaaat tcaaaacgcg tatatggatc aaattatata 1860

aattgtaaag atatttttta aaacagatga ttttttcaat ttgcaatggc aatgatccca 1920

ttaaccccct cccccgcttt gaggaagaag cgaacacact ccatgcgccc ccgcagcaca 1980

cgtatgcatg gtacgtgtcc gccggcgtca cacgcggcgt gcagcgcgac gcccgcggcg 2040

catctcggcg gccgcccgcg ccgccgcctc atccatctcc agaggattcc tccgatcctc 2100

tcgccgccct cctttttatc ccccaccccc ctcctcctct tcatcctcca agaagcagag 2160

agcgaagcaa gctcgaatcg atttccaacc cagaggattt gattagcttt gacgcagacc 2220

aagatcatct gatcacatgg tagatctgag 2250

<210> 2

<211> 1069

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccaagaagc agagagcgaa gcaagctcga atcgatttcc aacccagagg atttgattag 60

ctttgacgca gaccaagatc atctgatcaa tggcgtccat gcagaagagc cgcgaggagc 120

gcgcggaggc ggcggcgcac agggcggccg acgagctcca cgccgccagg cgggacgagc 180

ctggcggcgg cggaggcggc atgctgggca ccgtgcagga gagcgcgcgg tccctcctcg 240

gcgccgtccg cgacaagatc cccgggcccg gcagcggcgg cgctggcgca ggcgcagccg 300

ccggggaggg gaaggccgcc gaggcgaagg gcttcgcggc ggacaaggcg gagggcgcgc 360

ggcgcgcgct cgcgggatcc gcggcggcga ggaagggcga gacggacgag tccgcgtggc 420

agcacgggga ggacgtgcgg cggcgcgccg cggagaaggc cgaggaggcg cggcggcgga 480

gcgagcctca gccgtcgtcg gaggagaagt agccgtcgcc tcggctcgcc gccatttctc 540

tctgttcttg aaagcttctt cctactcggc tcacctgacc ggagtccggg acgtgtcgtg 600

ctcgtgcgca gggggaggtc ggcgacggag aacatctacg ggtcggcggc gagcgcggcg 660

gaggcgttca ggcagaagat gacgatgccg gaggacgtgg tggagcagaa gcgcgccgag 720

gctgccgccg gcgggaacaa gggaacagcc gccgcgacgg cgacggcgac gaacaccggc 780

ggggaggcgg cggcggagga ggtgatgatg cgggtgaagg cggcggacca gatgacgggg 840

caggcgttca acgacgtggg caagatgggg gaggagggca ccggcatggc ggccggagat 900

ggtgggcgcc gccgctgaga tcgccggagc cgaccgcgcg gcgccacgcc acggtgtttt 960

tgctcgtcgc gttttgtact aatctcagta taatctgtaa tgtaaatatg taatgcggca 1020

gttaaaagta ataaaatatc ccctaatcac ttgtccaaag cagagaaca 1069

Claims (5)

1.一种水稻胚乳特异性表达启动子在培育转基因水稻中的应用，其特征在于，其核苷酸序列为如SEQ ID NO:1所示的序列；

所述转基因水稻在种子胚乳中特异性表达外源基因；

所述外源基因包括GUS基因。

2.包含权利要求1所述的水稻胚乳特异性表达启动子的重组载体在培育转基因水稻中的应用。

3.包含权利要求2所述的重组载体的宿主细胞在培育转基因水稻中的应用。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述转基因水稻在种子胚乳中特异性表达外源基因。

5.利用权利要求1所述的水稻胚乳特异性表达启动子培育转基因水稻的方法，其特征在于，包括：将外源基因连接到所述水稻胚乳特异性表达启动子的下游，之后转入水稻中，筛选种子胚乳中特异性表达所述外源基因的植株，即为转基因水稻。

Images