CN107142262B

CN107142262B - 一种水稻种子特异性启动子Posseed及其应用

Info

Publication number: CN107142262B
Application number: CN201710500111.2A
Authority: CN
Inventors: 李�浩; 杨剑波; 杨亚春; 秦瑞英; 李娟�; 李莉; 许蓉芳
Original assignee: Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-06-27
Filing date: 2017-06-27
Publication date: 2020-08-11
Anticipated expiration: 2037-06-27
Also published as: CN107142262A

Abstract

本发明提供一种水稻种子特异性启动子Posseed及其应用。所述水稻种子特异性启动子包含序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列来源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)，本文中称为Posseed或启动子Posseed。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、植物表达载体和宿主菌。具体而言，本发明将上述启动子应用在植物转基因工程中。本发明提供的启动子可以启动外源基因在植物中表达，适用于任何植物，尤其能够驱动外源基因在水稻植株的种子种特异表达，因此可以用于培育理想的水稻品种，或用于生物反应器研究中。

Description

一种水稻种子特异性启动子Posseed及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域，特别涉及水稻种子特异性表达启动子及其应用。

背景技术

启动子是一段位于基因上游区的DNA序列，在基因工程中，启动子是重要的组成部分。植物基因工程中常用的启动子按照其作用方式及其功能可分成三类：组成型启动子，其驱动外源基因在植物各个发育阶段和各个组织内持续恒定的表达，不会因时间与空间的不同而造成表达量的差异；组织特异性启动子，其调控的基因的表达常常只发生在某些特定的器官或组织部位，能使目的基因的表达产物在一定空间积累；诱导性启动子，一般不启动转录或转录活性很低，但在某些特定的物理或化学信号的刺激下，转录活性能够显著地提高。目前组成型启动子应用较为广泛，但在应用中逐渐暴露出一些问题，比如它使外源基因在整个植株中表达，产生大量的外源蛋白质或代谢产物，打破了植物原有的代谢平衡，加重了植株的负担，影响了植物的形态和正常的生长发育，甚至会导致植株死亡，造成资源不必要的浪费。在组织特异性启动子调控下，基因的表达常常只发生在某些特定的器官或组织部位，可避免植物营养的不必要浪费。利用组织特异性启动子按照人们的意愿改进代谢途径，提高组织中营养物质含量，更加便利地获得工业新产品和医药新化合物等。因此，组织特异性启动子已成为转基因研究中最具有发展前景的外源基因的启动元件。

水稻是世界上最重要的粮食作物之一。种子是水稻最主要的营养贮藏器官，具有重要的经济价值。目前已克隆的种子特异性启动子主要是来自于粮食作物及油料作物种子种的蛋白、氨基酸、淀粉、脂类等合成代谢途径中相关的酶基因的启动子，如水稻的谷蛋白、醇溶蛋白基因启动子；水稻的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的启动子等。在植物基因工程中应用较多的是GluB-1启动子。它主要应用于驱动一些大豆基因在水稻中表达改良水稻的品质。水稻谷粒中含有的铁蛋白多积累在糊粉层，在谷粒加工中容易失去，因此，利用胚乳特异性的谷蛋白基因启动子驱动大豆铁蛋白基因在水稻中表达，可以使铁蛋白在转基因水稻的胚乳中积累，不易丢失，从而使稻米的含铁量增加。Xue等利用了GluB-1基因启动子，大量合成纤维素酶，因此种子特异启动子也可应用于生物反应器研究中。目前能用于水稻转基因的种子特异性启动子的数量仍然较少，因此获得一种新的水稻种子特异性启动子，对水稻新品种的研究开发及植物基因工程发展具有推动作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种驱动外源基因在水稻种子中特异性表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种水稻种子特异性启动子，所述水稻种子特异性启动子包含序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)的水稻种子特异性表达启动子，本文中称为Posseed或启动子Posseed。

另一方面，本发明提供一种水稻种子特异性启动子，其DNA序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80％同源性；或者，所述水稻种子特异性启动子为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、***或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；或者所述水稻种子特异性启动子具有与SEQ ID No:1所示的DNA序列杂交的产物。这些水稻种子特异性启动子序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同功能，即驱动目标基因在植物中特异性表达。

另一方面，本发明还提供一种包含上述水稻种子特异性启动子的表达盒、重组表达载体和宿主菌。

再一方面，本发明提供上述水稻种子特异性启动子在培育转基因植物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述水稻种子特异性启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

并且优选地，所述应用可以用于培育理想水稻品种和生物反应器应用中。具体而言，因为水稻胚乳中蛋白含量达到80％以上，因此可以将水稻种子作为生物反应器，在水稻种子大量表达特异蛋白。如利用该启动子驱动一些铁蛋白等基因，用于提高种子种的铁蛋白含量等，也可用于驱动纤维素基因、免疫蛋白等在水稻胚乳中大量表达，然后从水稻胚乳中分离提纯这些成分。

具体实施中，本发明的发明人从日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分离克隆得到结构包括转录起始位点上游的2034bp的DNA序列，并将其命名为Posseed(序列表中的SEQ ID No:1)。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1381上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，用于驱动GUS基因的表达。利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株的种子中有明显的GUS染色，而在其他组织中没有染色，从而证明该2034bp的序列具有驱动基因在种子中表达的活性。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子Posseed能够调控靶标基因在种子中特异性表达，而在其他植株的其他组织中不表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子代替35S等组成型启动子，调控目标基因在植株中表达，从而培育出理想的转基因水稻品种，如提高种子的发育速度，改变水稻中的蛋白和淀粉含量，或用于生物反应器中，大规模表达生产蛋白质等。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将Posseed启动子构建于pCAMBIA1381载体质粒中的示意图，其中A为pCAMBIA1381示意图，B为pCAMBIA1381-Posseed示意图；

图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。

图3为Posseed::GUS转基因水稻植株组织染色图。经24小时GUS染色后，根(A)、茎(B)、叶(C)、叶鞘(D)和花(E)均无GUS活性，而在种子的胚和胚乳(F)中均有GUS强烈表达(标尺＝2.5mm)。

图4为实施例2中的启动子驱动gus基因的染色结果图。GUS基因在转基因水稻非成熟的种子的胚和胚乳部位显现出可明显观测到蓝色(F)，在其它各器官根(A)、茎(B)、叶(C)、叶鞘(D)、花(E)和成熟种子中，均没有检测到GUS基因的表达。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

步骤1、野生型水稻日本晴基因组DNA提取

按照天根试剂盒提供的方法提取野生型日本晴基因组DNA。

步骤2、启动子Posseed的获得和植物表达载体的构建

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻Posseed启动子的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:2)5’端带HindIII，酶切位点(AAGCTT)，反向引物(SEQ ID No:3)5’端带SalI，酶切位点(GTCGAC)，引物由深圳华大基因公司合成，序列如下：

正向引物：AAGCTTAGTACCGTACCACTCTTTCTCG HindIII

反向引物：GTCGACCGATCGGTCCCTAGTACGCACT SalI

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子Posseed，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，35个循环；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度2034bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用HindIII和SalI进行双酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子Posseed，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

回收启动子Posseed片段，同时利用HindIII和SalI对进行线性化处理和回收pCAMBIA1381载体片段，将上述的Posseed片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子Posseed与GUS基因融合的植物表达载体pCAMBIA1381-Posseed(图1)，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，获得含有pCAMBIA1381-Posseed的农杆菌。

步骤3、阳性转基因植株获得

成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween 20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀种子的沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、***旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。

采用上述步骤2中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughput protocol forAgrobacterium mediated transformation based on phosphomannose isomerasepositive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI 10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法，共获得24株pCAMBIA1381-Posseed阳性植株。

步骤4、水稻种子特异性启动子的活性鉴定

将Posseed::GUS转基因植株的组织器官，即根、茎、叶、叶鞘、花和种子分别进行GUS染色。参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色24小时。75％乙醇脱色，将组织中的叶绿素脱掉。然后在解剖显微镜下观察并记录GUS染色的结果。结果如图3所示，GUS基因在转基因水稻成熟的种子的胚和胚乳(图3F)部位显现出可明显观测到蓝色，在其它各器官根(A)、茎(B)、叶(C)、叶鞘(D)和花(E)中，均没有检测到GUS基因的表达。

实施例2

在本实施例中，本申请的发明人发现并验证了另一个种子启动子，并且发现，该启动子具有特定的表达时期。

该启动子的序列为：

参照上述实施例1中的步骤(1)-(4)本申请的发明人对该启动子也进行了类似验证。

即，步骤1、野生型水稻日本晴基因组DNA提取；

步骤2、启动子的获得和植物表达载体的构建；

步骤3、阳性转基因植株获得；

步骤4、水稻种子特异性启动子的活性鉴定。

本实施例Gus基因检验的结果如图4所示。本实施例中进行验证实验所进行的实验方法与实施例1完全相同只是改变了被验证的启动子序列。

申请人发现其可以成功地在水稻的发育期，尤其是灌浆期驱动Gus基因特异性表达，而一旦水稻种子进入成熟期，则其表达特异性消失。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

序列表

<110> 安徽省农业科学院水稻研究所

<120> 一种水稻种子特异性启动子Posseed及其应用

<130> HCI20170105

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2034

<212> DNA

<213> 水稻种子特异性启动子

<400> 1:

agtaccgtac cactctttct cgttctttcc ttgaccggtt caaatgtact gtgccggtac 60

aaacaaacaa acgaacaaag tatgaattcc aagcctctag gttctaacta ctcatccatc 120

acataaaaaa acaataactt gaattccaaa tccatgacca tgaagatatc ctttcatgca 180

ttcacacatt tcaggacctc ctttggaata ggggaattgt tagaggatta tacaattcca 240

actaattaac ggcatggtac gctgtcaatt gttcggtact actccatgtc catgtccatg 300

tccatgtcca gcagaaatta agtcatgtca gtttcagtgc tctttgttag actactgtat 360

tttgtaagca ctcaacacta accacaagag tagcagagac cttggtggtg gactactccg 420

cgtgaaagtc agtaggccgg ccgttagtgt acaagagatt tgcttgattt tcctctgcat 480

gtccggttgt ccaccctctg aaatggggaa cagagacagt agccatagac gtctcgtcaa 540

cgcagaggcg aggcgaccat tcaagtcgag tcgtccaccg aggagaccac acacctcatc 600

tccctgatca attggctgag cagttcgcta tagccagtgc ttgttccatt ttaaaatata 660

agagatttta aacgtggata taacatatta taatattttt atttaaattc gtaatattaa 720

aatatatctt atttatttaa aattatttat attttggacg gagggagagc taggtttgcg 780

gaaattttca atagcctcat gggcagacaa gttaaagcaa gttatctaag agaaaaggtt 840

aaagtagtta cagtcacatt ataaagttct gttaaacaac ttgcagcaga ttcggcccat 900

ctgcaaagtg ccattgttaa gcagcatata ctaatactcc tactatgtga tttgctattt 960

gacgcgtggg cctactagcc gtacgaaata aagtcgtatt ggacgcgtag ctatgttgct 1020

tctacgtctg cttcgtcatg gttcgtttcg ttcgtacgca gggaatcaag catatgataa 1080

ccactggaat agtaacggta atagcaatgg ctagagggag ctccagtggc ctgtgcgaag 1140

catacggaat ccgaatagca gcaacctcct tcagagatag acgtactgta cgtacttgcc 1200

atcaactaag cagtttcagt gaaacttcca ccatgcttta atgctttgcc tgatcccaga 1260

ttcccagact tcagtgcaac acccgggaaa attcggactc gccgcactcg ctgcaactcc 1320

tagcatgtgt ttagattggc ccaaagttta gaatttggtt gaaattaaag acgatgtgac 1380

tgaaaagtta tgtgtgtatg aaaggtttga tgtgatggaa agttgaaagt ttaaaaaaaa 1440

aaactttgga acacacagta gctcgcaagg cgccattccg ccgaattgct taggcaacag 1500

gctacttgca tgggagttcg tttttgcgtg tgcgattcgg tgcggttgcg gcaccgggct 1560

tgatggattg ggtagtggcc gaggccgatg gctctccggc aatttgttcg gcccagccgc 1620

gcgtggcgag accgtgggcg tgggagttca cgcacgcagg gagcgggtgt gggttgccgg 1680

gctaaaaagc cgccggcaac agccacgtcc cgccgcgcgt cgcacgtccg cgccacgagg 1740

caccgaccta tccccgcctc gcgcgccaag cgctccacgc gccgcccagc gccgcaaggc 1800

ccgcaaatac gtggatcccc cacggcgcaa cgccgcaaat aatttacccg cacgcaagcc 1860

tgcacgcgaa cgttcgcgac acttcgtacc aatccattgt ccgtcgaacg ccagaactat 1920

ttaaccaaga ccaggcgcgc gaagagcgaa cgacgctata gcttcagcta cgtagccgtt 1980

gttcatcact cactcaactc agctcagtag tcagtgcgta ctagggaccg atcg 2034

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 正向引物

<400> 2:

aagcttagta ccgtaccact ctttctcg 28

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 反向引物

<400> 3:

gtcgaccgat cggtccctag tacgcact 28

Claims

1.一种水稻种子特异性启动子Posseed，其特征在于，所述水稻种子特异表达启动子由下述序列构成：

SEQ ID No:1所示的序列。

2.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1中所述的水稻种子特异性启动子Posseed。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1中所述的水稻种子特异性启动子Posseed，在所述重组表达载体中，所述水稻种子特异表达启动子连接于载体中待表达的基因序列的上游。

4.一种根据权利要求1中所述的水稻种子特异表达启动子在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将根据权利要求1中所述的水稻种子特异性启动子Posseed连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用用于培育理想的水稻品种或用于生物反应器研究中。

6.一种促进水稻种子发育的水稻培育方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)获取权利要求1中所述的水稻种子特异性启动子Posseed；

(2)取成熟水稻种子，进行愈伤诱导培养；

(3)构建含有权利要求1中所述的水稻种子特异性启动子Posseed的重组表达载体，在该重组表达载体中，所述水稻种子特异性启动子连接至预定促进种子发育的基因的上游；

(4)将所获得重组表达载体转入根癌农杆菌；

(5)对步骤(2)中所获得的愈伤培养组织利用转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化；

(6)将转化后获得的愈伤组织进行分化和生根培养获得转基因幼苗；

(7)将鉴定为阳性的幼苗进行培育，获得转基因水稻，在所述水稻发育过程中，所述水稻种子特异性启动子诱导促进种子发育的基因特异性表达。