CN117362412A - 一种重组人绒促性素的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组人绒促性素的纯化方法，本发明涉及重组技术领域，包括以下步骤：步骤一：将中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达***表达的发酵液用乙醇沉淀，得到中间体A；步骤二：将中间体A经过阴离子交换层析纯化，得到中间体B；步骤三：将中间体B经过疏水层析纯化，得到中间体C；步骤四：将中间体C经过冷冻干燥，得到重组人绒促性素成品，本发明以哺乳动物细胞‑中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达***表达的发酵液为起始原料，依次采用乙醇沉淀、阴离子交换层析疏水层析工艺，纯化方法操作简便、生产成本低，易于工业放大生产，获得的重组人绒促性素比活性及纯度更高，无外源蛋白的污染，HCG成品的比活性不低于25000IU/mg蛋白，纯度不低于99％。
Description
技术领域
本发明涉及重组技术领域，具体是一种重组人绒促性素的纯化方法。
背景技术
人绒毛膜***(human chorionic gonadotropin，HCG)是妊娠期间由胎盘合体滋养层细胞分泌产生的一种糖蛋白激素，由两个不同的亚基α、β以非共价键连接组成，因此，HCG一般从孕妇尿液中提取。在激素的产生、分泌、代谢等过程中，HCG分子会发生断裂、解离等多种变化，从而在血、尿中以多种分子形式存在。HCG的药理作用主要与促***相似，而促卵泡成熟样作用甚微，对雌性能促使卵泡成熟及***，并使破裂卵泡转变为黄体。促使其分泌孕激素。对雄性则具有促问质细胞激素的作用，特别是***细胞的活动。使其产生雄激素，促使性器官和副性征发育及成熟，并促进***生成。
目前，我国市场上的HCG主要为孕妇尿液中提取的产品，存在病毒污染、原料来源有限、采集困难、含量低及纯化过程复杂等缺陷。
相比而言，重组HCG(rHCG)是通过基因工程和哺乳动物细胞培养生产的产品，其在纯度、抗原性、安全性、无病毒感染方面具有尿源HCG产品无法比拟的优点。中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,简称CHO)是用于真核生物外源基因表达最为成功的宿主细胞，该表达***具有完备的翻译后加工过程，包括糖基化、羟基化、使表达的外源真核基因产物能够保持器天然结构及活性，且是表达产物分泌到细胞外，有利于外源蛋白的分离纯化。
目前，重组人绒促性素纯化工艺一般采用离子交换层析、亲和层析、疏水层析、凝胶层析等多种层析技术组合的方法，层析工艺过程通常都在三步以上，有的甚至达到五步，且单纯的层析操作难以处理体积庞大的细胞发酵液，使得工艺周期长，产品收率低，生产成本居高不下，为此发明提供一种重组人绒促性素的纯化方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种重组人绒促性素的纯化方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种重组人绒促性素的纯化方法，包括以下步骤：
步骤一：将中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达***表达的发酵液用乙醇沉淀，得到中间体A；
步骤二：将中间体A经过阴离子交换层析纯化，得到中间体B；
步骤三：将中间体B经过疏水层析纯化，得到中间体C；
步骤四：将中间体C经过冷冻干燥，得到重组人绒促性素成品。
该重组人绒促性素纯化方法中，纯化起始材料为使用哺乳动物细胞-中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达***表达的发酵液。
优选地，所述步骤一中乙醇沉淀包括以下步骤：
将所述发酵液过滤除去细胞及碎片，收集滤液，加入乙酸铵，溶解后加乙醇沉淀杂蛋白，离心收集上清液，调节上清液pH，再加乙醇沉淀，离心收集沉淀物，即为中间体A。
优选地，所述乙酸铵加入量为滤液体积的8-10％(w/v)，乙醇用量等于滤液体积，调节上清液pH为5.0-5.5，再加乙醇量为料液体积2.0-3.0倍。
优选地，所述乙醇温度为2-10℃，沉淀时间为4-6小时，沉淀温度2-10℃。
优选地，所述步骤二中阴离子交换层析纯化包括以下步骤：
将所述中间体A上样至阴离子交换层析柱，然后用缓冲液冲洗，再用洗脱液洗脱，收集洗脱峰溶液，即为中间体B。
优选地，所述层析过程包括以下步骤：
中间体A用pH6.0-6.5的0.02M磷酸盐缓冲液溶解至蛋白浓度为50-70mg/ml，层析柱用pH6.0-6.5的0.02M磷酸盐缓冲液洗涤，再用pH5.5-6.0且含0.25-0.3M NaCl的0.02M磷酸盐缓冲液洗脱。
优选地，所述步骤三中疏水层析纯化包括以下步骤：
将所述中间体B上样至疏水层析柱，然后用缓冲液冲洗，洗脱液洗脱，收集洗脱峰溶液，即为中间体C。
优选地，所述中间体B上样前加氯化钠调节电导率至120-130ms/cm，冲洗缓冲液为pH6.5-7.5且含0.9-1.1M NaCl的0.02M磷酸盐缓冲液，洗脱液是pH6.5-7.5且含0.55-0.65MNaCl的0.02M磷酸盐缓冲液。
优选地，所述步骤四中冷冻干燥前还包括：将所述中间体C进行超滤脱盐，脱盐后溶液电导率为0.1-0.3ms/cm，蛋白浓度为60-100mg/mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明以哺乳动物细胞-中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达***表达的发酵液为起始原料，依次采用乙醇沉淀、阴离子交换层析疏水层析工艺，纯化方法操作简便、生产成本低，易于工业放大生产，获得的重组人绒促性素比活性及纯度更高，无外源蛋白的污染，HCG成品的比活性不低于25000IU/mg蛋白，纯度不低于99％。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的原理图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
需要说明的是，本发明中重组人绒促性素的效价检测依据为《中国药典》2020版四部通则《1209绒促性素生物测定法》。
实施例1，如图1所示，一种重组人绒促性素的纯化方法，以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达***表达的发酵液作为起始原料，包括以下步骤：
(1)乙醇沉淀
取中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达***表达的发酵液20L，过滤除去细胞及碎片，收集滤液21L，加入1.68kg乙酸铵，搅拌溶解。搅拌下加入21L乙醇(2℃)，加完后继续搅拌30min，于2-10℃冷库静置4h后离心收集上清液，沉淀物弃去。离心上清液用6mol/L,乙酸调pH至5.0，溶液体积43L，搅拌加入129L乙醇(2℃)，加完后继续搅拌30min，于2-10℃冷库静置4h后离心收集沉淀物，上清液弃去，沉淀物即为中间体A。
(2)离子交换层析
离子交换层析填料为Q Sepharose Fast Flow，层析柱直径75mm，装柱高度20cm，柱体积880ml。层析柱用0.02M磷酸盐缓冲液(pH6.0)冲洗平衡，至流出液pH6.0，电导率2ms/cm。
中间体A用2L 0.02M磷酸盐缓冲液(pH6.0)溶解，检测溶液蛋白浓度为50mg/ml。将溶液上样至平衡好的层析柱，监控流出液在280nm处吸光值A280；用0.02M磷酸盐缓冲液(pH6.0)洗涤4个柱体积，再用含0.25M NaCl的0.02M磷酸盐缓冲液(pH5.5)洗脱，收集洗脱峰溶液1500ml，为中间体B。
(3)疏水层析
疏水层析填料为HiTrap Phenyl FF，层析柱直径50mm，装柱高度20cm，柱体积400ml。层析柱用含有1.1M氯化钠的0.02M磷酸盐缓冲液(pH6.5)冲洗平衡，至流出液pH6.5-7.5、电导率120-130ms/cm。
往中间体B中加入氯化钠，搅拌溶解，至溶液电导率为120ms/cm，
调节pH至6.5。将溶液上样至平衡好的疏水层析柱，监控流出液在280nm处吸光值A280；用含有1.1M氯化钠的0.02M磷酸盐缓冲液(pH6.5)洗涤4个柱体积，再用含0.55M NaCl的0.02M磷酸盐缓冲液(pH6.5)洗脱，收集洗脱峰溶液800ml，为中间体C。
(4)冷冻干燥
用截留分子量为10kd的超滤膜将中间体C超滤脱盐至电导率0.1ms/cm，蛋白浓度为100mg/ml进行冷冻干燥，得到rHCG成品，检测比活性25225IU/mg蛋白，纯度为99.12％。
实施例2，如图1所示，一种重组人绒促性素的纯化方法，以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达***表达的发酵液作为起始原料，包括以下步骤：
(1)乙醇沉淀
取中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达***表达的发酵液100L，过滤除去细胞及碎片，收集滤液105L，加入10kg乙酸铵，搅拌溶解。搅拌下加入100L乙醇(10℃)，加完后继续搅拌30min，于2-10℃冷库静置6h后离心收集上清液，沉淀物弃去。离心上清液用6mol/L,乙酸调pH至5.5，溶液体积210L，搅拌加入420L乙醇(10℃)，加完后继续搅拌30min，于2-10℃冷库静置6h后离心收集沉淀物，上清液弃去。沉淀物即为中间体A。
(2)离子交换层析
离子交换层析填料为HiTrap DEAE FF，层析柱直径150mm，装柱高度20cm，柱体积3500ml。层析柱用0.02M磷酸盐缓冲液(pH6.5)冲洗平衡，至流出液pH6.5，电导率3ms/cm。
中间体I用8L 0.02M磷酸盐缓冲液(pH6.5)溶解，检测溶液蛋白浓度为70mg/ml。将溶液上样至平衡好的层析柱，监控流出液在280nm处吸光值A280；用0.02M磷酸盐缓冲液(pH6.5)洗涤4个柱体积，再用含0.3M NaCl的0.02M磷酸盐缓冲液(pH6.0)洗脱，收集洗脱峰溶液6900ml，为中间体B。
(3)疏水层析
疏水层析填料为Butyl Sepharose 4FF，层析柱直径100mm，装柱高度20cm，柱体积1570ml。层析柱用含有0.9M氯化钠的0.02M磷酸盐缓冲液(pH7.5)冲洗平衡，至流出液pH6.5-7.5、电导率120-130ms/cm。
往中间体B中加入氯化钠，搅拌溶解，至溶液电导率为130ms/cm，
调节pH至7.5。将溶液上样至平衡好的疏水层析柱，监控流出液在280nm处吸光值A280；用含有0.9M氯化钠的0.02M磷酸盐缓冲液(pH7.5)洗涤4个柱体积，再用含0.65M NaCl的0.02M磷酸盐缓冲液(pH7.5)洗脱，收集洗脱峰溶液3000ml，为中间体C。
(4)冷冻干燥
用截留分子量为10kd的超滤膜将中间体C超滤脱盐至电导率0.3ms/cm，蛋白浓度为60mg/ml进行冷冻干燥，得到rHCG成品，检测比活性25341IU/mg蛋白，纯度为99.26％。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方法而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方法进行修改或等同替换，而不脱离本发明技术方法的精神和范围。
Claims (9)
1.一种重组人绒促性素的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：将中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达***表达的发酵液用乙醇沉淀，得到中间体A；
步骤二：将中间体A经过阴离子交换层析纯化，得到中间体B；
步骤三：将中间体B经过疏水层析纯化，得到中间体C；
步骤四：将中间体C经过冷冻干燥，得到重组人绒促性素成品。
2.根据权利要求1所述的一种重组人绒促性素的纯化方法，其特征在于，所述步骤一中乙醇沉淀包括以下步骤：
将所述发酵液过滤除去细胞及碎片，收集滤液，加入乙酸铵，溶解后加乙醇沉淀杂蛋白，离心收集上清液，调节上清液pH，再加乙醇沉淀，离心收集沉淀物，即为中间体A。
3.根据权利要求2所述的一种重组人绒促性素的纯化方法，其特征在于，所述乙酸铵加入量为滤液体积的8-10％(w/v)，乙醇用量等于滤液体积，调节上清液pH为5.0-5.5，再加乙醇量为料液体积2.0-3.0倍。
4.根据权利要求3所述的一种重组人绒促性素的纯化方法，其特征在于，所述乙醇温度为2-10℃，沉淀时间为4-6小时，沉淀温度2-10℃。
5.根据权利要求4所述的一种重组人绒促性素的纯化方法，其特征在于，所述步骤二中阴离子交换层析纯化包括以下步骤：
将所述中间体A上样至阴离子交换层析柱，然后用缓冲液冲洗，再用洗脱液洗脱，收集洗脱峰溶液，即为中间体B。
6.根据权利要求5所述的一种重组人绒促性素的纯化方法，其特征在于，所述层析过程包括以下步骤：
中间体A用pH6.0-6.5的0.02M磷酸盐缓冲液溶解至蛋白浓度为50-70mg/ml，层析柱用pH6.0-6.5的0.02M磷酸盐缓冲液洗涤，再用pH5.5-6.0且含0.25-0.3M NaCl的0.02M磷酸盐缓冲液洗脱。
7.根据权利要求1所述的一种重组人绒促性素的纯化方法，其特征在于，所述步骤三中疏水层析纯化包括以下步骤：
将所述中间体B上样至疏水层析柱，然后用缓冲液冲洗，洗脱液洗脱，收集洗脱峰溶液，即为中间体C。
8.根据权利要求7所述的一种重组人绒促性素的纯化方法，其特征在于，所述中间体B上样前加氯化钠调节电导率至120-130ms/cm，冲洗缓冲液为pH6.5-7.5且含0.9-1.1M NaCl的0.02M磷酸盐缓冲液，洗脱液是pH6.5-7.5且含0.55-0.65M NaCl的0.02M磷酸盐缓冲液。
9.根据权利要求7所述的一种重组人绒促性素的纯化方法，其特征在于，所述步骤四中冷冻干燥前还包括：将所述中间体C进行超滤脱盐，脱盐后溶液电导率为0.1-0.3ms/cm，蛋白浓度为60-100mg/mL。
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