WO2010111845A1

WO2010111845A1 - 一种高比活绝经期促性腺素及其制备方法和用途

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Publication number: WO2010111845A1
Application number: PCT/CN2009/071986
Authority: WO
Inventors: 季晓铭; 高霄梁; 郭照晔; 洪云海; 季斌; 严惠敏
Original assignee: 上海天伟生物制药有限公司
Priority date: 2009-04-02
Filing date: 2009-05-26
Publication date: 2010-10-07
Also published as: CN101851287A; KR20120029375A; CN101851287B

Description

一种高比活绝经期促性腺素及其制备方法和用途技术领域

本发明涉及蛋白质纯化和生物医药领域。具体而言，本发明涉及高比活绝经期促性腺素以及相应的纯化方法。背景技术

绝经期促性腺素（Human Menopausal Gonadotrop ins，简称 HMG ) 含有卵泡剌激素（Fol l i c le- s t imulat ing hormone , 简称 FSH)和黄体生成激素 (leute ini z ing hormone , 简称 LH)两种活性成分，它们是由垂体产生的糖蛋白激素，都是由 α链和 β链两个亚基组成。 FSH的 a亚基与 LH、绒毛膜促性腺素（chori oni c gonadotropi n , 简称 CG)的 α亚基完全相同，具有 92个氨基酸，分子量约为 14500D , 第 52和 78位置上的天冬酰胺是发生糖基化的氨基酸。 FSH的 β亚基由 1 1 1个氨基酸组成，分子量约为 18000D , 其中第 7和 24位置上的天冬酰胺是发生 -糖基化的氨基酸。而 LH的 β亚基由 121 个氨基酸组成，分子量约为 14800D ; CG 的 β亚基则有 145 个氨基酸，分子量 22000 - 39000D。

临床上 HMG主要用于治疗不育症，它可以从垂体或绝经期妇女的尿液中提取出来，也可通过 DNA重组技术而制备。

含有 FSH的第一代产品是尿促性素（HMG)，如 Serono公司的 Pergonal , 它是 FSH与 LH 比例约为 1 的混合物。但是它的比活和纯度都很低，比活一般在 40— 300IU/mg蛋白，纯度只有 2— 3%的有效成分，其余约 97%都是杂蛋白，由于杂蛋白含量大，对人体有潜在的副作用，给药方式也只能局限于肌肉注射。高纯度的尿促性素（PHMG)是本领域所特别需要的，它应当纯度高、杂质少，不含有大量的杂蛋白，因此不会造成人体的过敏反应，并且由于这些优点它可以使用皮下注射，提高患者的顺应性。

但是， pHMG的纯化很有难度，由于它同时含有 FSH和 LH两种成分，而且需要两者按一定的比例构成，而 FSH和 LH 的结构性质又不相同，因此在后期的纯化过程中很容易使两者分离从而导致达不到希望的比例，这在 pHMG 的纯化中尤其突出，目前还没有关于直接获得高比活 HMG的方法的报道。

因此本领域迫切需要开发出一种制备纯度高、杂质少的高比活 HMG的方法，便于使用于皮下注射，方便患者的使用、减轻痛苦。发明内容

本发明旨在提供一种纯度高、杂质少的高比活 HMG的制备方法。

本发明的另一个目的是提供由上述方法纯化得到的高比活 HMG。

本发明的又一个目的是提供由上述方法纯化得到的高比活 HMG的药物组合物。

本发明的再一个目的是提供由上述方法纯化得到的高比活 HMG的用途。在本发明的第一方面，提供了一种高比活绝经期促性腺素（purified Human Menopausal Gonadotropins, pHMG ) ，所述高比活绝经期促个生]]彔素比活不低于 5000 FSH国际单位 /mg蛋白。

在另一优选例中，所述的高比活绝经期促性腺素的比活为不低于 6000 FSH 国际单位 /mg蛋白；更佳地，其比活为不低于 8000 FSH国际单位 /mg蛋白。

在另一优选例中，所述的高比活绝经期促性腺素的比活为 6000— 20000 FSH 国际单位 /mg蛋白；更佳地，其比活为 8000— 15000 FSH国际单位 /mg蛋白。在另一优选例中，所述的绝经期促性腺素来自重组的绝经期促性腺素或其变体、或人尿来源的绝经期促性腺素或其变体。

在另一优选例中，所述的高比活绝经期促性腺素中，卵泡剌激素（FSH ) 与 *** （LH ) 的生物效价比例为 1 : 0. 1— 3。

在另一优选例中，所述的高比活绝经期促性腺素中，卵泡剌激素（FSH ) 与 *** （LH ) 的生物效价比例为 1 : 0. 5— 1. 4。在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的高比活绝经期促性腺素 ( pHMG) 的制备方法，所述的方法包括步骤：将低比活 HMG 通过染料亲和层析纯化，得到高比活绝经期促性腺素；所述的低比活 HMG比活在 2000 FSH国际单位 /mg蛋白以下。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤：

( 1 ) 将含有低比活 HMG的溶液上样至染料亲和层析的层析柱上；

( 2 ) 用 pH6— 11的缓冲液进行洗涤；和

( 3 ) 用 pH6— 11的缓冲液进行洗脱，得到高比活绝经期促性腺素。

在另一优选例中，所述含有低比活 HMG 的溶液中低比活 HMG的浓度为 0. 1 - 10w/v% o

在另一优选例中，所述含有低比活 HMG的溶液 pH为 4一 8。

在另一优选例中，所述的缓冲液选自醋酸钠溶液、醋酸铵溶液、甘氨酸 -NaOH 溶液、 Tri s-HCl溶液、或磷酸盐溶液。

在另一优选例中，所述步骤（3 ) 中包括下述步骤：

( 3' ) 用 pH6— 11的缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；

( 3" ) 浓缩洗脱液后，加入无水乙醇，离心得到沉淀；和

( 3'" ) 将沉淀脱水，得到干燥的高比活绝经期促性腺素。

在另一优选例中，所述染料亲和层析的层析柱的染料配基选自 Cibacron Blue、 Orange ^ Red、 Green。

在另一优选例中，所述染料亲和层析的层析柱的固相载体选自皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素、或琼脂糖。

在另一优选例中，所述染料亲和层析的层析柱选自 Blue Sepharose FF或 Blue Sepharose 6B。在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述的组合物中含有治疗有效量的如上所述的高比活绝经期促性腺素和药学上可接受的载体。在本发明的第四方面，提供了一种如上所述的高比活绝经期促性腺素的用途，用于制备治疗不育综合症的药物。据此，本发明提供了一种高比活 HMG及其制备方法，便于使用于皮下注射，方便患者的使用、减轻痛苦。具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，惊奇地发现通过染料亲和层析色谱可以获得高比活的 HMG，其比活可以达到 5000 FSH国际单位 /mg蛋白以上，是目前已知比活最高的 HMG，并且 FSH和 LH的生物效价比例可以在要求的范围内，如 1 : 0. 1 - 1： 3。具体地，本发明将低比活 HMG通过染料亲和层析纯化，得到高比活绝经期促性腺素。如本文所用， "低比活 HMG " 是指比活在 2000 FSH国际单位（IU ) /mg蛋白以下的 HMG，优选比活在 40— 300 FSHIU/mg蛋白。可以通过本领域熟知的方法获得低比活 HMG，例如但不限于，从绝经期妇女尿液中通过高岭土吸附、洗脱，丙酮沉淀，乙醇溶液抽提，离子交换层析色谱（包括阳离子、阴离子色谱），甚至疏水色谱得到。也可以通过商业渠道获得。低比活 HMG中 FSH和 LH的生物效价比例在 1 : 0. 1— 3范围，更多的在 1 : 0. 5- 1 . 4范围。

如本文所用， "绝经期促性腺素" 、 "尿促性素" 和 " HMG " 可以互换使用，都是指一类由垂体产生的糖蛋白激素或其变体，含有 FSH和 LH两种活性成分。可以是重组的绝经期促性腺素或其变体、或是人尿来源的绝经期促性腺素或其变体。

如本文所用， "卵泡剌激素" 和 " FSH " 可以互换使用，都是指一类用于促进***或卵泡产生、促进卵巢发育的激素或其变体，其可在天然情况下由垂体前叶分泌，可从绝经期妇女的尿液中提取或可通过重组技术获得的。

如本文所用， "黄体生成激素"和 " LH "可以互换使用，都是指是由脑垂体前叶嗜碱性细胞分泌的，作用于成熟的卵胞，能引起***并生成黄体的一类激素或其变体。

在本发明中，卵泡剌激素（FSH ) 与*** （LH ) 的生物效价是指按照中国药典 2005版附录 XII M、附录 XII N的方法测定所得的每毫克产品中含多少国际单位 FSH和 LH。

比活是指单位重量的蛋白中所含的效价，在本发明中， HMG或 pHMG的比活是指每毫克蛋白中含多少国际单位 FSH或 LH。其中，蛋白含量的测定方法是按照 L 0 wry法或其衍生的方法进行测定。制备方法

本发明提供的高比活绝经期促性腺素的制备方法，是将低比活 HMG通过染料亲和层析纯化。

在本发明的一个实施例中，所述的制备高比活绝经期促性腺素的方法包括步骤：

( 1 ) 将含有低比活 HMG的溶液上样至染料亲和层析的层析柱上；和

( 2 ) 用 pH6— 1 1的洗涤液进行洗脱，得到高比活绝经期促性腺素。

染料亲和层析的层析柱可以是本领域所熟知的，例如但不限于， Green 琼脂糖、 Orange琼脂糖；较佳地为 Blue琼脂糖；更佳地为 Blue Sepharose 6B。较佳地，洗涤液中的离子浓度在 0.01— 5M，洗涤液选自醋酸钠溶液、甘氨酸 -NaOH溶液、或 Tris-HCl溶液。

所述的含有低比活 HMG的溶液是将低比活 HMG溶解于缓冲液而得；较佳地，所述含有低比活 HMG的溶液 pH为 4-8。

在本发明的一个优选例中，所述的制备高比活绝经期促性腺素的方法包括步骤：

( i )将含有低比活 HMG的溶液上样至染料亲和层析的蓝色琼脂糖（Blue Sepharose) 层析柱上；所述的含有低比活 HMG的溶液是将低比活 HMG溶解于 pH4-8缓冲液；

( ii ) 用步骤（ i ) 中的缓冲液洗涤；

(iii) 用 pH6— 11的甘氨酸 -NaOH缓冲液洗涤；

( iv) 用含低浓度盐的 pH6— 11的 Tris-HCl缓冲液洗涤

(V) 用含高浓度盐的 pH6— 11的 Tris-HC缓冲液洗脱，收集洗脱液； ( V ) 浓缩洗脱液，加入无水乙醇，离心得到沉淀；和

( vi ) 将沉淀脱水，得到干燥的高比活绝经期促性腺素。

所述的盐是盐酸盐或硫酸盐，其中的金属离子选自 Na、 K、或铵；一般在步骤（iv) 和步骤（V) 中使用同一种盐；

所述的低浓度为 0-0.5M，较佳地为 0.1— 0.5M，更佳地为 0.3— 0.5M; 所述的高浓度为 0.5— 5M，较佳地为 2— 5M，更佳地为 3— 5M。在本发明的一个优选实施例中，所述高比活绝经期促性腺素通过以下步骤获得：

将含有低比活 HMG的溶液上样至染料亲和层析的层析柱上；和

用 pH6— 11的缓冲液进行洗涤和洗脱，得到高比活绝经期促性腺素。高比活绝经期促性腺素（pHMG)

通过本发明的方法可以制备得到高比活绝经期促性腺素，其比活 5000 FSH国际单位 /mg蛋白。

本发明制备得到的高比活的绝经期促性腺素中，卵泡剌激素（FSH) 与 *** （LH) 的生物效价比例为 1: 0.1-3；较佳地，卵泡剌激素（FSH) 与*** （LH) 的生物效价比例为 1: 0.5— 1.4。药物组合物

如本文所用，术语 "药学上可接受的载体" 指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在 Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co. , N.J. 1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如崩解剂、润湿剂、乳化剂、 pH缓冲物质等。

所述药物组合物可以根据不同给药途径而制备成各种剂型。这些剂型以下面方式之一施用：口服、局部用药、非肠道用药，如皮下、静脉、和肌肉注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中优选优选皮下注射给药方式。用途

通过本发明的方法制备得到的高比活绝经期促性腺素可以用于制备治疗不育综合症的药物，所述的药物可以通过常规途径施用，其中包括 (但并不限于；)：肌注、皮下注射等。优选皮下注射施用。药物制剂形式应与施用方式相匹配。药物的施用量，按活性物质计算，通常为每天约 0.01— 5 g/kg体重，较佳地约 0.05-0.5ug/kg体重，更优选为 0.2-0.4ug/kg体重。

本发明的药物可直接使用，也可与其它治疗剂或辅剂联合使用。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。本发明的主要优点在于：

1、提供了一种高纯度、杂质少的高比活 HMG，可应用于皮下注射；

2、提供了一种高比活 HMG的纯化方法，方法简单有效，适合产业化。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在 100毫升的溶液中溶质的重量。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。本发明中 FSH、 LH生物效价的测定方法按中国药典 2005版附录 XII M、

XII N的方法进行。

本发明中比活测定中的蛋白质含量测定按 Lo wry法测定。实施例 1

制备高比活绝经期促性腺素 I 在本实施例中，将低比活 HMG (购自上海天伟生物制药有限公司;)用作 pHMG的起始原料，其中 FSH的生物效价为 273 IU/mg， LH的生物效价为 3 19 IU/mg。

将 500mL Blue Sepharose FF (购自 GE Amersham) , 装入层析柱，用平衡液 (0.02 M 醋酸钠， pH7.0)平衡。

将 10g低比活 HMG用 1L平衡液溶解，用 HC1或 NaOH溶液调节 pH约 7.0，然后上样至上述 Blue Sepharose FF层析柱上，上样结束后用平衡液洗涤 5倍柱体积，然后用 0.05M Glycin-NaOH pHIO洗涤 8倍柱体积，再用 0.05M Tris-HC1,0.4M NaCl， pH9洗涤 8倍柱体积,最后用 0.05M Tris-HC1,4M NaCl， pH9洗脱,分部收集洗脱液，合并有效成份，用 10000MW膜超滤浓缩后，边搅拌边加入 5倍体积预冷的无水乙醇，离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，真空干燥得 236mg干燥品，即高比活绝经期促性腺素 I 。

生物效价的测定方法：按照中国药典 2005版附录 XI I M、附录 XI I N的方法测定 FSH、 LH生物效价。

蛋白质含量测定方法：按 Lowry法进行测定。 FSH比活的计算方法：比活 = FSH生物效价（IU/mg ) ÷每毫克干燥品中的蛋白含量（mg/mg )

其结果见表 1 :

结果表明，采用本发明的方法进行纯化，可以使 HMG的比活大大提高。实施例 2

制备高比活绝经期促性腺素 II 将 500mL Blue Sepharose 6B (购自 GE Amersham) , 装入层析柱，用平衡液 (0.02 M 醋酸钠， pH7.0)平衡。

将 6g同实施例 1 中相同来源的低比活 HMG用 600mL平衡液溶解，用 HC1或 NaOH溶液调节 pH约 7.0，然后上样至上述 Blue Sepharose 6B层析柱上，上样结束后用平衡液洗涤 5倍柱体积，然后用 0.05M Glycin-NaOH pH10 洗涤 5倍柱体积，再用 0.05M Tris-HC1,0.2M NaCl， pH9洗涤 5倍柱体积,再用 0.05M Tris-HC1,0.5M NaCl， pH9 洗涤 7 倍柱体积，最后用 0.05M Tris-HC1,4M NaCl , pH9洗脱,分段收集洗脱液，合并有效成份，用 10000MW 膜超滤浓缩至 lOOmL,即得高比活绝经期促性腺素 II。对此液体取样测定 FSH、 LH生物效价及蛋白含量，计算比活。

蛋白质含量测定方法：按 Lowry法进行测定。

FSH比活的计算方法：比活 = FSH生物效价（IU/mL ) ÷每毫升液体中的蛋白含量 ( mg/mL )

其结果见表 2 : 表 2 所得干燥品的生物效价和比活

结果表明，采用本发明的方法进行纯化，可以使 HMG的比活大大提高。实施例 3

pHMG冻干针剂的制备

用于制造 100瓶 pHMG冻干针剂，且每瓶含 75IU FSH和 75 IU LH的例子如下：

将实施例 1 所制备的高比活绝经期促性腺素 I 1. 64mg，溶解于 5mL注射用无热原水中，用 0. 22 μ ηι过滤器进行无菌过滤，并用注射用无热原水洗涤过滤器。

将 lg乳糖溶解于 30mL注射用无热原水中，如果需要的话，用 HC1或 NaOH 调节 pH6. 5 ± 0. 2，用 0. 22 μ ηι过滤器进行无菌过滤。然后加入到上述 FSH溶液中，用注射用无热原水定容至 75mL，混匀。

将上述溶液分装入安瓿瓶中，每瓶 0. 75mL，进行冷冻干燥。

所得到的安瓿瓶中，每瓶含约 75 IU FSH、 75IU LH和 10mg乳糖。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

权利要求

1.一种高比活绝经期促性腺素（purified Human Menopausal Gonadotropins pHMG) ，其特征在于，其比活不低于 5000 FSH国际单位 /mg蛋白。

2.如权利要求 1 所述的高比活绝经期促性腺素，其特征在于，所述的高比活绝经期促性腺素的比活为不低于 6000 FSH国际单位 /mg蛋白；较佳地，其比活为不低于 8000 FSH国际单位 /mg蛋白。

3.如权利要求 1 所述的高比活绝经期促性腺素，其特征在于，所述的绝经期促性腺素来自重组的绝经期促性腺素或其变体、或人尿来源的绝经期促性腺素或其变体。

4.如权利要求 1 所述的高比活绝经期促性腺素，其特征在于，所述的高比活绝经期促性腺素中，卵泡剌激素（FSH ) 与*** （LH ) 的生物效价比例为 1 : 0. 1一 3。

5.如权利要求 1 所述的高比活绝经期促性腺素，其特征在于，所述的高比活绝经期促性腺素中，卵泡剌激素（FSH ) 与*** （LH ) 的生物效价比例为 1 : 0. 5 - 1. 4。

6.—种如权利要求 1一 5任一所述的高比活绝经期促性腺素（pHMG) 的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

将低比活 HMG通过染料亲和层析纯化，得到高比活绝经期促性腺素；所述的低比活 HMG比活在 2000 FSH国际单位 /mg蛋白以下。

7.如权利要求 6所述的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

( 2 ) 用 pH6— 11的缓冲液进行洗涤；和

8.如权利要求 6所述的制备方法，其特征在于，所述含有低比活 HMG的溶液中低比活 HMG的浓度为 0. 1— 10w/v%。

9.如权利要求 7所述的制备方法，其特征在于，所述含有低比活 HMG的溶液 pH为 4一 8。

10.如权利要求 7所述的制备方法，其特征在于，所述的缓冲液选自醋酸钠溶液、醋酸铵溶液、甘氨酸 -NaOH溶液、 Tri s-HCl溶液、或磷酸盐溶液。

11.如权利要求 6— 10任一所述的制备方法，其特征在于，所述染料亲和层析的层析柱的染料配基选自 Cibacron Blue , Orange , Red, Green。

12.如权利要求 6— 10任一所述的制备方法，其特征在于，所述染料亲和层析的层析柱的固相载体选自皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素、或琼脂糖。

13.如权利要求 6— 10任一所述的制备方法，其特征在于，所述染料亲和层析的层析柱选自 Blue Sepharose FF或 Blue Sepharose 6B。

14. 一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物中含有治疗有效量的如权利要求 1一 5任一所述的高比活绝经期促性腺素、和药学上可接受的载体。

15 . 一种如权利要求 1 一 5 任一所述的高比活绝经期促性腺素的用途，其特征在于，用于制备治疗不育综合症的药物。