CN114835782A - 一种猪瘟病毒e0截短蛋白、制备方法及应用 - Google Patents
一种猪瘟病毒e0截短蛋白、制备方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114835782A CN114835782A CN202210570210.9A CN202210570210A CN114835782A CN 114835782 A CN114835782 A CN 114835782A CN 202210570210 A CN202210570210 A CN 202210570210A CN 114835782 A CN114835782 A CN 114835782A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- truncated protein
- swine fever
- fever virus
- classical swine
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
- C12N2770/24322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
- C12N2770/24334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
- C12N2770/24351—Methods of production or purification of viral material
- C12N2770/24352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae
- G01N2333/183—Flaviviridae, e.g. pestivirus, mucosal disease virus, bovine viral diarrhoea virus, classical swine fever virus (hog cholera virus) or border disease virus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种猪瘟病毒E0截短蛋白、制备方法及应用。本发明首先提供了一种猪瘟病毒E0截短蛋白,显著促进了E0蛋白的表达,产量可达0.38 mg/ml,而且不影响E0蛋白的免疫原性,可用于猪瘟亚单位疫苗的制备;在上述猪瘟病毒E0截短蛋白的基础上,本发明发现,将E0截短蛋白的第160位、162位、165位和166位氨基酸均突变为甘氨酸G,能够使E0截短蛋白的表达量进一步提升30%以上,且不影响其免疫原性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种猪瘟病毒E0截短蛋白、制备方法及应用。
背景技术
猪瘟(classical swine fever,CSF)又称猪霍乱(hogcholera,HC)是由猪瘟病毒(Hog Cholera virus,HCV或Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种急性热性致死性疾病,猪瘟具有高度接触传染性,流行广泛,发病与死亡率高,危害极大。国际兽疫局(OIE)以前将其定为A类传染病,现将期列为通报疫病,我国将其列为一类动物疫病。
CSFV为有囊膜病毒,病毒粒子大小约为40-60nm。病毒基因组为单股正链RNA,长约12.3kb,含一个大的开放性阅读框(ORF),编码一个含3898个氨基酸残基的多聚蛋白,分子量约为438kD。多聚蛋白在翻译的同时和翻译后经病毒和宿主细胞的蛋白酶加工成12种成熟的病毒蛋白,包括结构蛋白和非结构蛋白,其多聚蛋白上从N到C端的顺序依次为:Npro、C、E0(Erns)、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。NS2-3可被加工成NS2、NS3(P80),除C、E0、E1和E2为结构蛋白外.其余均为非结构蛋白。结构蛋白的加工是由宿主细胞的信号肽酶介导进行的,蛋白酶首先在核衣壳蛋白C和E012前体之间剪切多聚蛋白,随后在E2的C端剪切开,最后E012被迅速剪切成E01和E2。在E2从E012前体释放以后,E01被加工成E0和E1,最后这3种囊膜糖蛋白通过分子内或分子间二硫键形成复合物,组装成病毒粒子结构。
目前采取以预防为主的综合防控策略防控猪瘟,其中灭活疫苗是猪瘟田间毒株经病毒培养***大量扩增、灭活、乳化等工艺制成,但是,传统的灭活疫苗存在免疫持续期短,在生产制备过程中还存在因病毒灭活不彻底而散毒的风险、生产成本较高等问题。基于此,研究者长期致力于CSF亚单位疫苗的研发。E0蛋白能够诱导机体产生病毒中和性抗体,是CSFV的重要保护性抗原,也是CSF亚单位疫苗研制的候选抗原。E0蛋白的氨基酸序列中存在多个糖基化位点,对于保持其抗原性具有重要作用。通过原核大肠杆菌对E0进行制备时,产物以不可溶的包涵体形式存在,且缺乏糖基化修饰,严重影响了抗原蛋白的免疫原性;通过具有完备糖基化修饰功能的真核CHO细胞对E0进行制备时,目标蛋白不表达或表达量极低,以上情况严重阻碍了CSF亚单位疫苗的研发。
发明内容
为了解决CSFV E0在CHO细胞中表达量低或不表达的技术问题,本发明经过大量研究发现,将CSFV E0蛋白进行截短获得的CSFV E0蛋白片段能够在CHO细胞中进行大量表达,且不影响其免疫原性,可用于CSF亚单位疫苗的制备,具体包括以下内容:
第一方面,本发明提供了一种猪瘟病毒E0截短蛋白,所述猪瘟病毒E0截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
第二方面,本发明提供了一种编码上述第一方面所述猪瘟病毒E0截短蛋白的基因序列,所述基因序列如SEQ ID NO.2所示。
第三方面,本发明提供了一种猪瘟病毒E0截短蛋白,将上述第一方面所述猪瘟病毒E0截短蛋白的第160位、162位、165位和166位氨基酸均突变为甘氨酸G;所述突变后的猪瘟病毒E0截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
第四方面,本发明提供了一种编码上述第三方面所述猪瘟病毒E0截短蛋白的基因序列,其特征在于,所述基因序列如SEQ ID NO.4所示。
第五方面,本发明提供了一种上述第一方面和第三方面所述的猪瘟病毒E0截短蛋白在制备猪瘟疫苗中的应用。
优选地,所述疫苗为亚单位疫苗。
第六方面,本发明提供了一种上述第一方面和第三方面所述的猪瘟病毒E0截短蛋白的制备方法,所述方法包括:将编码猪瘟病毒E0截短蛋白的基因克隆到真核表达载体中,得到表达猪瘟病毒E0截短蛋白的重组质粒;再将所述的重组质粒转染至CHO细胞中,培养、筛选、纯化得到猪瘟病毒E0截短蛋白。
优选地,所述真核表达载体为pcDNA3.1载体。
优选地,所述CHO细胞为CHO悬浮细胞。
优选地,所述方法为:
(1)PCR扩增编码猪瘟病毒E0截短蛋白的基因片段,所述基因片段如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示;
(2)用限制性内切酶Xho I、Hind III分别对载体pcDNA3.1和猪瘟病毒E0截短蛋白的基因片段进行双酶切,并将酶切片段用DNA连接酶连接,获得表达猪瘟病毒E0截短蛋白的重组质粒pcDNA3.1-CSFV-tE0截短;
(3)将重组质粒pcDNA3.1-CSFV-tE0截短转染CHO悬浮细胞,悬浮培养,收集细胞培养上清,纯化即得猪瘟病毒E0截短蛋白。
本发明的有益效果是:①通过原核大肠杆菌对猪瘟病毒E0蛋白进行制备时,产物以不可溶的包涵体形式存在,且缺乏糖基化修饰,严重影响了抗原蛋白的免疫原性;通过具有完备糖基化修饰功能的真核CHO细胞对猪瘟病毒E0蛋白进行制备时,目标蛋白不表达或表达量极低,以上情况严重阻碍了CSF亚单位疫苗的研发;而本发明意外发现,将猪瘟病毒E0蛋白截短获得的E0蛋白片段不仅能够在CHO细胞中大量分泌表达,蛋白产量高达0.38mg/ml;而且不影响E0蛋白的免疫原性,可用于CSF亚单位疫苗的制备;②在上述截短表达的猪瘟病毒E0蛋白片段的基础上,本发明发现,将猪瘟病毒E0截短蛋白的第160位、162位、165位和166位氨基酸均突变为甘氨酸G后,进一步促进了猪瘟病毒E0截短蛋白的表达,蛋白表达量提升30%以上,且不影响其免疫原性。
附图说明
图1猪瘟病毒E0蛋白、E0截短蛋白、氨基酸突变的E0截短蛋白表达结果;
图2猪瘟病毒E0截短蛋白的纯化结果;
图3猪瘟病毒氨基酸突变的E0截短蛋白的纯化结果;
图4间接ELISA对猪瘟病毒E0截短蛋白免疫兔血清抗体检测结果;
图5间接ELISA对猪瘟病毒氨基酸突变的E0截短蛋白免疫兔血清抗体检测结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解,这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整,未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和***实验室活动许可:
中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL-3)和猪瘟病相关生物安全的相关要求,经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报许可,并已在农业农村部备案,符合国家生物安全等级的要求。
CSFV疫苗标准株(购自中国兽医药品监察所-中国兽医微生物菌种保藏管理中心)、真核表达载体pcDNA3.1(+)、CSFV阳性血清由本实验室保存。CHO悬浮细胞表达***、Unstained protein MW marker(26610)、RT-PCR扩增试剂盒、6×His Tag MonoclonalAntibody(HIS.H8)、Unstained protein MW marker(26616)及BCA蛋白定量试剂盒、Alexa488标记的羊抗兔二抗均购自Thermo Fisher Scientific公司。镍亲和层析柱购自GE公司。RNA提取试剂盒和DNA凝胶纯化回收试剂盒均购自OMEGA有限公司。Xho I和HindIII限制性内切酶购自New England Biolabs(NEB)公司。大肠杆菌DH5α感受态细胞购自全式金公司。大量质粒提取试剂盒购自MACHEREY-NAGEL公司。ECL显色液购自上海碧云天生物技术有限公司。截流分子量为8000-10000道尔顿的MD44透析袋购自北京索莱宝科技有限公司。
术语“载体”是指可将某编码蛋白的多聚核苷酸***其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可以通过转化,转导或者转染宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。举例来说,载体包括:质粒;噬菌体;柯斯质粒等。
术语“疫苗”是指能够在动物中提供保护性应答的生物制剂,其中所述疫苗已经被递送并且不能造成严重疾病。本发明的疫苗是遗传工程改造的亚单位疫苗。
本发明的疫苗,进一步任选地包含一种或多种佐剂,赋形剂,载体和稀释剂。佐剂可以任何合适的佐剂,化学类免疫佐剂如氢氧化铝、弗氏佐剂、矿物油、司盘等;微生物类免疫佐剂如分枝杆菌、BCC、脂多糖、胞壁酰二肽、胞肽、脂溶性蜡质D、短小棒状杆菌;植物类免疫佐剂多为从植物或大真菌中提取的多糖类,如茯苓多糖、红花多糖、中草药类等。而生化类免疫佐剂如胸腺肽、转移因子、白细胞介素等。优选的佐剂可以是纳米佐剂生物佐剂,白介素、干扰素等。
本发明的疫苗也可用于联合疫苗,如与猪或牛的其他疫苗联合,但重点在减毒活疫苗上,尤其是病毒基因的整合,如双价苗,三价苗等。
本发明的疫苗的施用可以采用方便的途径,例如肌内注射,鼻内,口服,皮下,透皮和***等途径。疫苗可以在初免-加强方案后施用。例如,在第一次接种后,受试者可以在一段时间(例如约7,14,21或28天)之后接受第二次加强施用。通常,加强施用的剂量相同或低于初免施用的剂量。此外,也可以进行第三次加强免疫,例如免疫后2-3个月、6个月或一年。
实施例1猪瘟病毒E0截短蛋白及氨基酸突变的E0截短蛋白的制备
1.E0蛋白的基因片段扩增
由北京六合华大基因科技有限公司合成编码猪瘟病毒E0蛋白、E0截短蛋白、氨基酸突变的E0截短蛋白的基因片段,并经核酸凝胶电泳鉴定正确。其中编码猪瘟病毒E0蛋白的基因片段如SEQ ID NO.6所示,氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示;编码猪瘟病毒E0截短蛋白的基因片段如SEQ ID NO.2所示,氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;编码氨基酸突变的猪瘟病毒E0截短蛋白的基因片段如SEQ ID NO.4所示,氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示;其中,氨基酸突变的猪瘟病毒E0截短蛋白指将猪瘟病毒E0截短蛋白的第160位、162位、165位和166位氨基酸均突变为甘氨酸G。
2.表达质粒的构建与鉴定
pcDNA3.1载体用限制性内切酶Xho I、Hind III双酶切,切胶回收纯化载体片段;同时将合成的E0蛋白、E0截短蛋白、氨基酸突变的E0截短蛋白的基因片段分别用限制性内切酶Xho I、Hind III双酶切并回收纯化,再分别将纯化回收的基因片段与纯化的pcDNA3.1载体片段通过T4 DNA连接酶连接,程序为16℃,12h,连接产物分别转化DH5α感受态细胞,挑取单菌落增菌培养,利用质粒提取试剂盒提取重组质粒,重组质粒分别命名为pcDNA3.1-CSFV-E0、pcDNA3.1-CSFV-tE0、pcDNA3.1-CSFV-mE0;重组质粒用Xho I、Hind III进行双酶切鉴定,双酶切鉴定正确的重组质粒进行测序鉴定,确定目的基因序列的正确***,确保阅读框完全正确。
构建的重组表达质粒pcDNA3.1-CSFV-E0、pcDNA3.1-CSFV-tE0(E0截短蛋白)、pcDNA3.1-CSFV-mE0(E0截短突变蛋白)经Xho I和Hind III双酶切后,酶切产物大小与理论值相符,表明扩增的E0蛋白、E0截短蛋白和氨基酸突变的E0截短蛋白等基因片段与载体正确连接,基因测序结果也显示目的片段成功***表达载体中。
3.蛋白的表达与纯化
参照ExpiCHO表达***试剂盒说明书,将3种重组表达质粒分别转染CHO悬浮细胞,转染的细胞于32℃、5%CO2、湿度90%条件下继续悬浮培养12天后,4000g离心10min收集细胞培养上清进行SDS-PAGE鉴定。离心收集的细胞培养上清,经0.22μm滤膜过滤后,依照GE公司镍亲和层析柱说明书进行纯化。SDS-PAGE鉴定纯化后的目标蛋白,并使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
离心收取3种转染重组表达质粒的细胞培养上清液,进行SDS-PAGE鉴定,结果如图1所示,转染pcDNA3.1-CSFV-E0质粒的细胞培养上清在30kD左右未观察到特异性目标蛋白条带,表明E0蛋白基本无表达;而转染pcDNA3.1-CSFV-tE0质粒和pcDNA3.1-CSFV-mE0质粒的细胞培养上清在30kD左右均观察到特异性目标蛋白条带,表明E0截短蛋白以及氨基酸突变的E0截短蛋白均能够正常表达。
使用镍亲和层析柱对表达的E0截短蛋白和氨基酸突变的E0截短蛋白进行纯化,洗脱蛋白样品经SDS-PAGE鉴定,结果如图2和图3所示:在30kD左右位置处观察到特异性目标蛋白条带,与细胞上清鉴定结果相符。使用BCA蛋白定量试剂盒测定纯化后E0截短蛋白的浓度,计算单位培养体积中分泌表达的目标蛋白量,E0截短蛋白表达量约为0.38mg/mL,氨基酸突变的E0截短蛋白表达量约为0.51mg/mL。
实施例2免疫原性检测
采用间接ELISA对E0截短蛋白和氨基酸突变的E0截短蛋白免疫兔血清进行检测,分析其免疫原性。用50mM碳酸盐缓冲液将纯化的2种目标蛋白(50ng/孔)分别包被于ELISA酶标板中,4℃孵育过夜。用1%牛血清白蛋白(BSA)37℃,封闭2h。将待检血清用血清稀释液按1:2000稀释并加入反应孔中,100μL/孔,每个样品设3个复孔,37℃孵育1h。HRP标记的山羊抗兔IgG抗体用血清稀释液按1:5000稀释后加入反应孔中,100μL/孔,37℃孵育1h。TMB显色,每孔50μL,显色10min后,加入50μL终止液终止反应,读取OD450nm值。
CSFV-E0截短蛋白间接ELISA结果如图4所示,免疫后7天,即可检测到针对E0蛋白的血清抗体,二免7天后抗体水平显著升高,在免疫后第28天抗体保持较高水平,与灭活CSFV抗原相比,抗体水平略高。结果证明,CHO细胞表达的E0截短蛋白具有良好的免疫原性。
氨基酸突变的CSFV-E0截短蛋白间接ELISA结果如图5所示,免疫后7天,即可检测到针对E0蛋白的血清抗体,二免7天后抗体水平显著升高,在免疫后第28天抗体保持较高水平。与灭活CSFV抗原相比,抗体水平提高,与CSFV-E0截短蛋白相当。结果证明,CHO细胞表达的氨基酸突变的E0截短蛋白也具有良好的免疫原性。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种猪瘟病毒E0截短蛋白、制备方法及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 170
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Glu Asn Ile Thr Gln Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr Asn Gly
1 5 10 15
Ile Gln His Ala Met Tyr Leu Arg Gly Val Ser Arg Ser Leu His Gly
20 25 30
Ile Trp Pro Glu Lys Ile Cys Lys Gly Val Pro Thr Tyr Leu Ala Thr
35 40 45
Asp Thr Glu Leu Lys Glu Ile Gln Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Gly
50 55 60
Thr Asn Tyr Thr Cys Cys Lys Leu Gln Arg His Glu Trp Asn Lys His
65 70 75 80
Gly Trp Cys Asn Trp Tyr Asn Ile Asp Pro Trp Ile Gln Leu Met Asn
85 90 95
Arg Thr Gln Ala Asn Leu Ala Glu Gly Pro Pro Ala Lys Glu Cys Ala
100 105 110
Val Thr Cys Arg Tyr Asp Lys Asp Ala Asp Ile Asn Val Val Thr Gln
115 120 125
Ala Arg Asn Arg Pro Thr Thr Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn
130 135 140
Phe Ser Phe Ala Gly Thr Ile Ile Glu Gly Pro Cys Asn Phe Asp Val
145 150 155 160
Ser Val Glu Asp Ile Leu Tyr Gly Asp His
165 170
<210> 2
<211> 510
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccgaaaata taactcaatg gaacctgagt gataacggca ctaatggtat tcagcatgct 60
atgtacctta gaggggttag cagaagcttg catgggatct ggccggaaaa aatatgcaaa 120
ggagtcccca cctacctggc cacagacacg gaactgaaag aaatacaggg aatgatggat 180
gccagcgagg ggacaaacta tacgtgctgt aagttacaga gacatgaatg gaacaaacat 240
ggatggtgta actggtacaa tatagaccca tggatacagt tgatgaatag aacccaagca 300
aacttggcag aaggccctcc ggccaaggag tgcgctgtga cttgcaggta cgataaagat 360
gccgacatca acgtggtcac ccaggccaga aacaggccaa caaccctgac cggctgcaag 420
aaaggaaaaa atttttcttt tgcgggtaca attatagagg gcccatgtaa tttcgatgtt 480
tccgtggagg atatcttgta tggggatcat 510
<210> 3
<211> 170
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Glu Asn Ile Thr Gln Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr Asn Gly
1 5 10 15
Ile Gln His Ala Met Tyr Leu Arg Gly Val Ser Arg Ser Leu His Gly
20 25 30
Ile Trp Pro Glu Lys Ile Cys Lys Gly Val Pro Thr Tyr Leu Ala Thr
35 40 45
Asp Thr Glu Leu Lys Glu Ile Gln Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Gly
50 55 60
Thr Asn Tyr Thr Cys Cys Lys Leu Gln Arg His Glu Trp Asn Lys His
65 70 75 80
Gly Trp Cys Asn Trp Tyr Asn Ile Asp Pro Trp Ile Gln Leu Met Asn
85 90 95
Arg Thr Gln Ala Asn Leu Ala Glu Gly Pro Pro Ala Lys Glu Cys Ala
100 105 110
Val Thr Cys Arg Tyr Asp Lys Asp Ala Asp Ile Asn Val Val Thr Gln
115 120 125
Ala Arg Asn Arg Pro Thr Thr Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn
130 135 140
Phe Ser Phe Ala Gly Thr Ile Ile Glu Gly Pro Cys Asn Phe Asp Gly
145 150 155 160
Ser Gly Glu Asp Gly Gly Tyr Gly Asp His
165 170
<210> 4
<211> 510
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccgaaaata taactcaatg gaacctgagt gataacggca ctaatggtat tcagcatgct 60
atgtacctta gaggggttag cagaagcttg catgggatct ggccggaaaa aatatgcaaa 120
ggagtcccca cctacctggc cacagacacg gaactgaaag aaatacaggg aatgatggat 180
gccagcgagg ggacaaacta tacgtgctgt aagttacaga gacatgaatg gaacaaacat 240
ggatggtgta actggtacaa tatagaccca tggatacagt tgatgaatag aacccaagca 300
aacttggcag aaggccctcc ggccaaggag tgcgctgtga cttgcaggta cgataaagat 360
gccgacatca acgtggtcac ccaggccaga aacaggccaa caaccctgac cggctgcaag 420
aaaggaaaaa atttttcttt tgcgggtaca attatagagg gcccatgtaa tttcgatggc 480
tccggcgagg atggcggcta tggggatcat 510
<210> 5
<211> 233
<212> PRT
<213> 猪瘟病毒(Classical swine fever virus)
<400> 5
Ala Glu Asn Ile Thr Gln Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr Asn Gly
1 5 10 15
Ile Gln His Ala Met Tyr Leu Arg Gly Val Ser Arg Ser Leu His Gly
20 25 30
Ile Trp Pro Glu Lys Ile Cys Lys Gly Val Pro Thr Tyr Leu Ala Thr
35 40 45
Asp Thr Glu Leu Lys Glu Ile Gln Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Gly
50 55 60
Thr Asn Tyr Thr Cys Cys Lys Leu Gln Arg His Glu Trp Asn Lys His
65 70 75 80
Gly Trp Cys Asn Trp Tyr Asn Ile Asp Pro Trp Ile Gln Leu Met Asn
85 90 95
Arg Thr Gln Ala Asn Leu Ala Glu Gly Pro Pro Ala Lys Glu Cys Ala
100 105 110
Val Thr Cys Arg Tyr Asp Lys Asp Ala Asp Ile Asn Val Val Thr Gln
115 120 125
Ala Arg Asn Arg Pro Thr Thr Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn
130 135 140
Phe Ser Phe Ala Gly Thr Ile Ile Glu Gly Pro Cys Asn Phe Asp Val
145 150 155 160
Ser Val Glu Asp Ile Leu Tyr Gly Asp His Glu Cys Gly Ser Leu Leu
165 170 175
Gln Asp Thr Ala Leu Tyr Leu Val Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu
180 185 190
Asn Ala Arg Gln Gly Ala Ala Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gln
195 200 205
Leu Ser Thr Ala Gly Lys Arg Leu Glu Gly Arg Ser Lys Thr Trp Phe
210 215 220
Gly Ala Tyr Ala Leu Ser Pro Tyr Cys
225 230
<210> 6
<211> 699
<212> DNA
<213> 猪瘟病毒(Classical swine fever virus)
<400> 6
gccgaaaata taactcaatg gaacctgagt gataacggca ctaatggtat tcagcatgct 60
atgtacctta gaggggttag cagaagcttg catgggatct ggccggaaaa aatatgcaaa 120
ggagtcccca cctacctggc cacagacacg gaactgaaag aaatacaggg aatgatggat 180
gccagcgagg ggacaaacta tacgtgctgt aagttacaga gacatgaatg gaacaaacat 240
ggatggtgta actggtacaa tatagaccca tggatacagt tgatgaatag aacccaagca 300
aacttggcag aaggccctcc ggccaaggag tgcgctgtga cttgcaggta cgataaagat 360
gccgacatca acgtggtcac ccaggccaga aacaggccaa caaccctgac cggctgcaag 420
aaaggaaaaa atttttcttt tgcgggtaca attatagagg gcccatgtaa tttcgatgtt 480
tccgtggagg atatcttgta tggggatcat gagtgcggca gtttgctcca ggacacggct 540
ctgtacctag tagatggaat gaccaacact atagagaatg ccagacaggg agcagccagg 600
gtaacatctt ggctcgggag gcaactcagc actgccggga agaggttgga gggtagaagc 660
aaaacctggt ttggtgccta tgccctatcg ccttactgt 699
Claims (10)
1.一种猪瘟病毒E0截短蛋白,其特征在于,所述猪瘟病毒E0截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述猪瘟病毒E0截短蛋白的基因序列,其特征在于,所述基因序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1所述的猪瘟病毒E0截短蛋白,其特征在于,所述猪瘟病毒E0截短蛋白的第160位、162位、165位和166位氨基酸均突变为甘氨酸G;所述突变后的猪瘟病毒E0截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.一种编码权利要求3所述猪瘟病毒E0截短蛋白的基因序列,其特征在于,所述基因序列如SEQ ID NO.4所示。
5.如权利要求1或3所述的猪瘟病毒E0截短蛋白在制备猪瘟疫苗或猪瘟诊断制剂中的应用。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述疫苗为亚单位疫苗。
7.如权利要求1或3所述猪瘟病毒E0截短蛋白的制备方法,其特征在于,所述方法包括:将编码猪瘟病毒E0截短蛋白的基因克隆到真核表达载体中得到表达猪瘟病毒E0截短蛋白的重组质粒;再将所述的重组质粒转染至CHO细胞中,培养、筛选、纯化得到猪瘟病毒E0截短蛋白。
8.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述真核表达载体为pcDNA3.1载体。
9.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述CHO细胞为CHO悬浮细胞。
10.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述方法为:
(1)PCR扩增编码猪瘟病毒E0截短蛋白的基因片段,所述基因片段如SEQ ID NO.2或SEQID NO.4所示;
(2)用限制性内切酶Xho I、Hind III分别对载体pcDNA3.1和猪瘟病毒E0截短蛋白的基因片段进行双酶切,并将酶切片段和E0截短蛋白的基因片段用DNA连接酶连接,获得表达猪瘟病毒E0截短蛋白的重组质粒pcDNA3.1-CSFV-tE0;
(3)将重组质粒pcDNA3.1-BCSFV-tE0转染CHO悬浮细胞,悬浮培养,收集细胞培养上清,纯化即得猪瘟病毒E0截短蛋白。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210570210.9A CN114835782B (zh) | 2022-05-24 | 2022-05-24 | 一种猪瘟病毒e0截短蛋白、制备方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210570210.9A CN114835782B (zh) | 2022-05-24 | 2022-05-24 | 一种猪瘟病毒e0截短蛋白、制备方法及应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114835782A true CN114835782A (zh) | 2022-08-02 |
CN114835782B CN114835782B (zh) | 2023-10-20 |
Family
ID=82572400
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210570210.9A Active CN114835782B (zh) | 2022-05-24 | 2022-05-24 | 一种猪瘟病毒e0截短蛋白、制备方法及应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114835782B (zh) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108107217A (zh) * | 2017-11-14 | 2018-06-01 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 猪瘟病毒截短e2蛋白及其应用 |
CN109182248A (zh) * | 2018-09-10 | 2019-01-11 | 青岛易邦生物工程有限公司 | 一种猪瘟病毒抗体检测elisa诊断试剂盒 |
CN111973738A (zh) * | 2020-09-02 | 2020-11-24 | 天康生物股份有限公司 | 一种基于猪瘟病毒基因的核酸和重组蛋白共免疫疫苗、制备方法及应用 |
CN213933883U (zh) * | 2020-11-23 | 2021-08-10 | 浙江洪晟生物科技股份有限公司 | 猪瘟病毒e2&e0抗体检测试剂盒 |
CN113980983A (zh) * | 2021-10-21 | 2022-01-28 | 成都史纪生物制药有限公司 | 一种截短的猪瘟病毒e2基因及其应用 |
-
2022
- 2022-05-24 CN CN202210570210.9A patent/CN114835782B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108107217A (zh) * | 2017-11-14 | 2018-06-01 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 猪瘟病毒截短e2蛋白及其应用 |
CN109182248A (zh) * | 2018-09-10 | 2019-01-11 | 青岛易邦生物工程有限公司 | 一种猪瘟病毒抗体检测elisa诊断试剂盒 |
CN111973738A (zh) * | 2020-09-02 | 2020-11-24 | 天康生物股份有限公司 | 一种基于猪瘟病毒基因的核酸和重组蛋白共免疫疫苗、制备方法及应用 |
CN213933883U (zh) * | 2020-11-23 | 2021-08-10 | 浙江洪晟生物科技股份有限公司 | 猪瘟病毒e2&e0抗体检测试剂盒 |
CN113980983A (zh) * | 2021-10-21 | 2022-01-28 | 成都史纪生物制药有限公司 | 一种截短的猪瘟病毒e2基因及其应用 |
Non-Patent Citations (6)
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN114835782B (zh) | 2023-10-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO2021254327A1 (zh) | 一种包膜替换型病毒载体疫苗及其构建方法 | |
CN112876570B (zh) | 非洲猪瘟病毒疫苗及其制备方法 | |
CN108586618B (zh) | 一种猪流行性腹泻亚单位疫苗的制备及应用 | |
CN111234036B (zh) | 非洲猪瘟病毒p72融合蛋白及其制备方法和应用 | |
CN110105436A (zh) | 猪圆环病毒3型抗体的elisa检测试剂盒及其制备方法与应用 | |
CN116836243A (zh) | 呼吸道合胞病毒融合前f蛋白突变体及其应用 | |
CN109705223B (zh) | 一种羊口疮病毒重组亚单位疫苗及其生产方法 | |
CN111454989A (zh) | 一种嵌合型基因i型乙型脑炎病毒病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用 | |
CN114835782B (zh) | 一种猪瘟病毒e0截短蛋白、制备方法及应用 | |
CN116240222A (zh) | 一种密码子优化的牛病毒性腹泻病毒1型e2蛋白基因及其应用 | |
CN114805609B (zh) | 一种猪瘟病毒e2-e0融合蛋白、制备方法及应用 | |
CN115340609B (zh) | 一种***病毒多抗原表位融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法 | |
CN112730829B (zh) | 一种快速检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1的胶体金试纸条及其应用 | |
CN114773438B (zh) | 一种牛病毒性腹泻病毒e0截短蛋白、制备方法及应用 | |
CN114853912B (zh) | 一种牛病毒性腹泻病毒e2-e0融合蛋白、制备方法及应用 | |
CN113855795A (zh) | 禽戊型肝炎病毒orf2亚单位疫苗 | |
CN110747215A (zh) | 一种高效表达猪瘟e2蛋白的重组杆状病毒及其构建方法 | |
CN114315984A (zh) | 一种用于制备prrsv基因ii型表位缺失疫苗毒株的n蛋白表位突变标记及其应用 | |
CN113861277A (zh) | 一种牛轮状病毒重组vp8蛋白与应用 | |
CN107746848B (zh) | 重组猪瘟病毒e2蛋白及其表达细胞系、制备方法、应用及猪瘟病毒亚单位疫苗 | |
CN111732667B (zh) | 小反刍兽疫病毒基因工程亚单位疫苗 | |
CN115960265B (zh) | 一种长效多价猪***和猪瘟疫苗及其制备方法和应用 | |
CN113372454B (zh) | 尼帕病毒受体结合糖蛋白及其应用 | |
CN113444153B (zh) | 非洲猪瘟病毒CD2v截短蛋白及在制备野毒和自然弱毒检测试剂盒中的应用 | |
CN111533813B (zh) | 牛病毒性腹泻病毒重组亚单位疫苗 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |