CN117551818B - 一种检测呼吸道合胞病毒的靶基因、引物探针组合以及试剂盒和应用 - Google Patents
一种检测呼吸道合胞病毒的靶基因、引物探针组合以及试剂盒和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种检测呼吸道合胞病毒的靶基因、引物探针组合以及试剂盒和应用，标志物的序列具有SEQ ID NO.1所示序列或特异性片段。本发明所提供的呼吸道合胞病毒检测方法，检测用时短、仪器设备简单、实验成本低、无需变温条件，具有良好的特异性和灵敏性，分析灵敏度达到1拷贝/μL，适用于大量样本检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，尤其是涉及一种检测呼吸道合胞病毒的靶基因、引物探针组合以及试剂盒和应用。
背景技术
急性下呼吸道传染病(ALRI)是造成世界各地儿童死亡的主要因素，也是婴幼童住院治疗的最常见原因的一种。其中，引起一岁以下婴幼儿健康问题的主要原因是呼吸道合胞病毒(RSV)。呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)属副黏病毒科肺炎属，广泛散布在世界各地，主要通过鼻、眼睛表面的黏膜接触，以及通过飞沫或者密切接触传播而感染，感染率高，为世界造成了巨大的医疗和经济负担。因此，高效、迅速、精确地检测RSV，对慢性病的防治与管理和临床诊断有着重大意义。
目前，RSV的常用实验室检测手段主要有病毒分离培养法、酶联免疫吸附法(ELISA)、血清学检测以及基于实时荧光定量PCR的分子生物学方法等。但是这些检测方法存在耗时较长、操作复杂、对专业技术人员要求高、依赖昂贵仪器设备等，基本不适合基层医院应用。
重组酶聚合酶扩增技术是近年发展的新型核酸体外扩增检测技术，其与常规聚合酶链式反应PCR技术的关键区别在于扩增反应的温度和步骤不同，重组酶聚合酶扩增技术的扩增在37-42℃的等温条件下，30 min内即可实现靶标基因的指数级扩增，具有快速、灵敏、操作简便、成本低等特点。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种检测结果准确、无假阴性的快速、高灵敏、高特异的检测呼吸道合胞病毒的方法。
为实现以上目的，经过大量序列比对和筛选，本发明首先提供一条用于检测呼吸道合胞病毒的标志物，所述标志物具有SEQ ID NO.1所示序列或特异性片段。
本发明还提供了上述标志物在采用重组酶介导的恒温核酸扩增技术检测呼吸道合胞病毒中的应用。
另外，本发明还根据上述标志物设计了多条特异性的引物对和靶探针，对其进行筛选确定最优的引物序列对。
针对荧光法，本发明筛选得到的最优的引物序列对，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.2-3所示，所述靶探针为荧光法AP位点核酸内切酶靶探针，所述荧光法AP位点核酸内切酶靶探针的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
进一步的，荧光法AP位点核酸内切酶探针分别于四氢呋喃THF两侧标记荧光基团和淬灭基团，且两基团之间间隔1-5bp。
进一步的，四氢呋喃两侧标记不同荧光色的荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团选自Cyan500、FAM、VIC、Cy3、JOE、TAMRA、Texas Red、ROX、Cy5、Cy5.5、TET、HEX、NED，所述淬灭基团包括MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、NFQ、DABCYL、Eclipse。
针对胶体金法，本发明筛选得到的最优的引物序列对，其核苷酸序列分别如SEQID NO.2-3所示，所述靶探针为核酸内切酶靶探针，所述胶体金法核酸内切酶靶探针的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示。
进一步的，胶体金法核酸内切酶探针5’端标记一个抗原标记（例如FAM或FITC），距离5’端25-50nt序列位置上标记一个四氢呋喃THF修饰，3’末端标记一个修饰基团（例如C3-spacer、氨基或者磷酸基团）。
本发明还提供了一种适用于重组酶介导的恒温核酸扩增技术检测呼吸道合胞病毒的引物探针组，该引物探针组含有一对特异性引物对和一条靶探针，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示，所述靶探针的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4或SEQ IDNO. 9所示。
本发明提供了所述引物探针组合在制备荧光型快速检测呼吸道合胞病毒的试剂盒中的应用。
进一步，本发明提供的荧光型快速检测呼吸道合胞病毒的试剂盒含有上述重组酶介导的恒温核酸扩增体系，该体系具体配置如下：
蜡样芽胞杆菌DNA聚合酶I大片段 10-100 ng/μL；
蜡样芽胞杆菌DNA重组酶RecA 60-300 ng/μL；
T4噬菌体单链DNA结合蛋白 200-1000 ng/μL；
T4噬菌体重组调节蛋白 30-200 ng/μL；
AP位点核酸内切酶 30-200 ng/μL；
逆转录酶 5-50 U/μL；
肌酸激酶 100-1000 ng/μL；
Tirs缓冲液 50-200 mM；
醋酸钾 100-400 mM；
醋酸镁 50-400 mM；
三(2-羰基乙基)磷盐酸盐 10-40 mM；
海藻糖 2%-10 %；
聚乙二醇20000 2%-10 %；
dNTP 20-300 µM ；
ATP 2-50 mM；
磷酸肌酸 20-100 mM；
精氨酸盐酸盐 1-20 mM；；
核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的正向引物 100-800 nM；
核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的反向引物 100-800 nM；
核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示的靶探针 100-400 nM。
结果判读：将反应管置于恒温荧光检测仪、酶标仪或荧光PCR仪中，读取荧光信号，根据呼吸道合胞病毒靶标序列检测结果进行判断：
呼吸道合胞病毒靶标检测结果出现荧光信号增强，检测结果为阳性；
呼吸道合胞病毒靶标检测结果未出现荧光信号增强，检测结果为阴性。
本发明提供了所述引物探针组合在制备胶体金型快速检测呼吸道合胞病毒的试剂盒中的应用。
进一步，本发明提供的胶体金型快速检测呼吸道合胞病毒的试剂盒含有上述重组酶介导的恒温核酸扩增体系，该体系具体配置如下：
蜡样芽胞杆菌DNA聚合酶I大片段 10-100 ng/μL；
蜡样芽胞杆菌DNA重组酶RecA 60-300 ng/μL；
T4噬菌体单链DNA结合蛋白 200-1000 ng/μL；
T4噬菌体重组调节蛋白 30-200 ng/μL；
核酸内切酶 30-200 ng/μL；
逆转录酶 5-50 U/μL；
肌酸激酶 100-1000 ng/μL；
Tirs缓冲液 50-200 mM；
醋酸钾 100-400 mM；
醋酸镁 50-400 mM；
三(2-羰基乙基)磷盐酸盐 10-40 mM；
海藻糖 2%-10 %；
聚乙二醇20000 2%-10 %；
dNTP 20-300 µM ；
ATP 2-50 mM；
磷酸肌酸 20-100 mM；
精氨酸盐酸盐 1-20 mM；
核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的正向引物 100-800 nM；
核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的反向引物 100-800 nM（5’端修饰biotin）；
核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示的靶探针 50-400 nM。
结果判读：将胶体金试纸条***到反应液中或者将反应液滴加到胶体金试纸条样本区，静置1-10分钟，根据胶体金显色结果进行判断：
检测线和控制线均显示红色，检测结果为阳性；
检测线显示无色，控制线为红色，检测结果为阴性；
检测线显示红色，控制线为无色，检测结果为无效。
本发明通过利用蜡样芽胞杆菌DNA聚合酶I大片段、蜡样芽胞杆菌DNA重组酶RecA等组分构建重组酶介导的恒温扩增体系（Recombinant enzyme mediated isothermalamplification system，RMA），设计呼吸道合胞病毒特异的扩增引物和探针，用于呼吸道合胞病毒检测。该方法其可在25~43℃内完成整个反应，其反应速度极快，一般由反应开始至完成只需要5~15分钟。该技术由于具备了操作简单，对仪器设备的要求较低，且具有高灵敏高特异等特点，有望实现呼吸道合胞病毒快速高灵敏现场化检测。
本领域技术人员可以理解，本发明还提供了一种快速检测呼吸道合胞病毒的重组酶介导恒温核酸快速扩增方法，以本发明上述引物对和探针组合对待测样本模板进行恒温核酸扩增检测，所述待测样本模板为待测样本的RNA或DNA。
本发明所提供的呼吸道合胞病毒检测方法，检测用时短、仪器设备简单、实验成本低、无需变温条件，具有良好的特异性和灵敏性，分析灵敏度达到1拷贝/μL，适用于大量样本检测。
附图说明
图1为实施例1的重组酶介导恒温扩增体系有效性验证结果。
图2为实施例2的方法对呼吸道合胞病毒扩增引物对的筛选结果。
图3为实施例4的方法对不同浓度梯度的呼吸道合胞病毒RNA实时荧光重组酶介导恒温扩增检测结果。
图4为本发明荧光法检测试剂盒对呼吸道合胞病毒检测灵敏度分析结果。
图5为本发明胶体金法检测试剂盒对呼吸道合胞病毒检测灵敏度分析结果。
图6为本发明检测试剂盒对呼吸道合胞病毒实时荧光重组酶介导恒温扩增检测技术特异性分析。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明创造。
实施例1 重组酶介导的恒温扩增体系的构建
通过氨基酸序列检索比对以及AlphaFold蛋白结构数据库筛查，挖掘出蜡状芽孢杆菌DNA聚合酶大片段、蜡状芽孢杆菌DNA重组酶，T4 噬菌体单链DNA结合蛋白和重组调节蛋白，通过基因合成构建表达质粒，表达纯化4种蛋白质，通过重组酶介导恒温扩增反应进行反应体系活性验证，结果如图1所示。当呼吸道合胞病毒RSV存在时，荧光信号升高；无RSV的对照组（NC）没有荧光信号增强（如图1A所示）。此外，仅当蜡状芽孢杆菌DNA聚合酶大片段、蜡状芽孢杆菌DNA重组酶，T4 噬菌体单链DNA结合蛋白和重组调节蛋白四种蛋白都存在时，才有效扩增靶标基因，产生荧光信号，缺失其中任何一种蛋白都无法有效扩增，即无荧光信号产生（如图1B所示）。
具体反应体系为：
蜡样芽胞杆菌DNA聚合酶I大片段 30 ng/μL；
蜡样芽胞杆菌DNA重组酶RecA 180 ng/μL；
T4噬菌体重组调节蛋白 60 ng/μL；
T4噬菌体单链DNA结合蛋白 600 ng/μL；
逆转录酶M-MLV 10 U/μL；
RNase inhibitor 1 U/μL；
肌酸激酶 1000 ng/µL；
Tirs缓冲液 80 mM；
醋酸钾 200 mM；
三(2-羰基乙基)磷盐酸盐 20 mM；
海藻糖 5%（w/v）；
聚乙二醇20000 5%（w/v）；
dNTP 100 µM；
ATP 10 mM；
磷酸肌酸 50 mM；
精氨酸盐酸盐 10 mM；
醋酸镁 280mM。
将配置好的反应体系混匀后，将反应液甩（或快速离心）至管子底部，然后立即将反应管放入荧光检测设备中。荧光检测程序设置为：恒温42 ºC；每30 s采集一次FAM通道（信号采集通道的选择与荧光探针设计一致）荧光值。
实施例2 用于恒温核酸扩增检测的呼吸道合胞病毒靶序列、特异性引物对、靶探针的设计、筛选和确定
用软件对比NCBI数据库中呼吸道合胞病毒的基因组序列，下载不少于500条呼吸道合胞病毒全基因组序列，利用MEGA和DNAman软件进行序列比对，筛选确定同源性高的保守序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：5’-CCAAATTAGCAGCAGGAGATAGATCAGGTCTTACAGCTGTGATTAGGAGAGCTAATAATGTCCTAAAAAATGAAATGAAACGTTATAAAGGTTTATTACCCAAGGATATAGCCAACAGCTTCTATGAAGTATTTGAAAAATATCCTCACTTTATAGATGTTTTTGTTCATTTTGGTATAGCACAATCT-3’。
本发明在获得确切的保守区域序列后，根据所述保守序列设计引物和探针。所述引物设计策略优选如下：（1）在保守区域序列中选择连续的18-35个碱基作为上下游引物；（2）上游引物与下游引物反向互补序列之间间隔长度为100-400 bp之间；（3）所述上游和下游引物中GC含量在30%-70%；（4）所述上游引物和下游引物之间不存在四个以上连续互补配对的碱基；（5）引物自身或引物之间不形成发卡结构或其他二级结构；（6）用于胶体金法的下游引物的5’端修饰一个标记基团（例如Biotin）。
所述探针设计策略优选如下：（1）在上游引物和下游引物之间设计一段长度为45-55 nt的与目标片段互补的序列作为探针序列；（2）探针序列与上下游引物序列之间不存在识别碱基重叠；（3）序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基；（4）探针序列与上下游引物之间不存在碱基互补配对、且不形成引物间二级结构；（5）用于荧光法检测的探针在距离5’端30-35 nt的中部位置标记一个四氢呋喃（THF），形成去嘌呤或去嘧啶位点（AP位点）（无碱基要求），作为AP位点核酸内切酶识别位点，THF位点上游T碱基上标记一个荧光基团（如FAM），下游T碱基上标记一个淬灭基团（如BHQ），两个基团之间间距2-4 nt；THF距离3’末端约15 nt，且在3’末端标记一个修饰基团（如氨基、磷酸基团或C3-spacer）；（6）用于胶体金法检测的探针在距离5’端标记一个抗原标记（如FAM），在距离5’端25-35 nt位置上标记一个四氢呋喃（THF），作为核酸内切酶的识别位点， THF距离3’末端约15 nt，且在3’末端标记一个修饰基团（如氨基、磷酸基团或C3-spacer）。
根据以上引物和探针设计策略，在该保守区域设计和合成多条特异性引物和靶探针，分成3组经实验验证，如图2所示，结果发现组1引物探针组合的扩增反应速率最快，检测结果最优，最终筛选确定组1扩增引物对作为检测引物探针对，并根据组1的引物对针对胶体金法设计相应的靶探针，如表2所示。
表1 呼吸道合胞病毒恒温扩增引物组合（荧光法）
表2 呼吸道合胞病毒恒温扩增引物组合（胶体金法）
实施例3 检测呼吸道合胞病毒的重组酶介导的恒温核酸扩增方法
1. 呼吸道合胞病毒RNA的提取
（1）样本处理
①将采集的鼻拭子或咽拭子样本浸泡在病毒拭子保存液中并涡旋振荡混匀，经过56°C 30 min热灭活后，取100 μL样本至于1.5 mL无核酸酶离心管中；
② 加入200 μL裂解缓冲液和3 μL Carrier RNA，并立即充分上下颠倒混匀；
（2）RNA捕获
① 向处理后的样本中加入20 μL磁珠悬浮液，室温放置10 min，每间隔2 min上下颠倒混匀一次，进行RNA捕获，随后，瞬时离心收集管盖和管壁的液体；
② 将离心管静置在磁力架上，待磁珠完全被吸附聚集后，用移液器移去上清液体（注意枪头勿触碰磁珠，以免造成RNA的损失）；
（3）洗涤
① 向离心管中加入400 μL漂洗液，涡旋振荡混匀，并瞬时离心收集管盖和管壁的液体；
② 将离心管静置在磁力架上，待磁珠完全被吸附聚集后，吸弃液体；
③ 向离心管中加入400 μL洗涤液，涡旋振荡混匀，并瞬时离心收集管盖和管壁的液体；
④ 将离心管静置在磁力架上，待磁珠完全被吸附聚集后，吸弃液体；
⑤ 重复步骤③和④一次；
⑥ 将离心管放置在磁力架上，开盖晾干5-10 min，以去除残留的乙醇；
（4）RNA收集
① 从磁力架上取下离心管，向离心管中加入30 μL洗脱液，涡旋振荡1 min，56°C静置2 min，瞬时离心收集管盖和管壁的液体；
② 将离心管至于磁力架上，待磁珠完全被吸附聚集后，将液体转移至新的无核酸酶的离心管中，-80°C保存。
2. 扩增体系配置（终体积为50μL）：
蜡样芽胞杆菌DNA聚合酶I大片段 80 ng/μL；
蜡样芽胞杆菌DNA重组酶RecA 50 ng/μL；
T4噬菌体单链DNA结合蛋白 400 ng/μL；
T4噬菌体重组调节蛋白 60 ng/μL；
AP位点核酸内切酶（荧光法）/核酸内切酶（胶体金法） 80 ng/μL；
肌酸激酶 50 ng/μL；
Tris缓冲液 40 mM；
醋酸钾 80 mM；
醋酸镁 25 mM；
三(2-羰基乙基)磷盐酸盐 20 mM；
聚乙二醇20000 5% （w/v）；
ATP 5 mM；
dNTP 3 mM；
磷酸肌酸 100 mM；
精氨酸盐酸盐 10 mM；
海藻糖 5%；
逆转录酶M-MLV 10 U/μL；
靶探针 200 nM（荧光法序列为SEQ ID NO.4，胶体金法为SEQ ID NO.9）；
正向引物 400 nM （SEQ ID NO.2）；
反向引物 400 nM（荧光法为SEQ ID NO.3；胶体金法反向引物5’端修饰有biotin）；
以上配置好的恒温扩增体系可以直接进行扩增反应，也可冷冻干燥成为粉末状扩增体系。
3. 呼吸道合胞病毒检测
将提取的样本RNA 2 μL加入到反应体系中，42°C反应10-30分钟。
荧光法分析检测结果：利用荧光PCR仪进行荧光信号实时检测。结果显示，在3 min之后开始显示扩增的荧光信号，阴性对照样本无荧光信号增强。
胶体金法分析检测结果：将反应后的样本滴加到胶体金试纸条加样区，1-10分钟后观察比色结果。
实施例4 灵敏度和特异性分析
1.灵敏度分析
荧光法灵敏度分析：将呼吸道合胞病毒RNA进行梯度稀释，以蒸馏水作为阴性对照，进行恒温扩增检测实验，实验重复4次，统计分析检测结果如图3所示，结果显示检测灵敏度达到单拷贝/微升（2拷贝/反应）。
胶体金法灵敏度分析：将呼吸道合胞病毒RNA进行梯度稀释，以蒸馏水作为阴性对照，进行恒温扩增检测实验，检测结果如图5所示，结果显示检测灵敏度达到单拷贝/微升（2拷贝/反应）。
2. 特异性评价
利用本发明所建立的呼吸道合胞病毒检测方法对其他常见呼吸道病毒（例如甲型流感病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒-2、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒）以及细菌、人基因组进行检测，结果如图6所示，仅呼吸道合胞病毒样本有显著扩增信号，而其他呼吸道病毒以及细菌无扩增信号，说明本发明所建立的呼吸道合胞病毒检测方法特异性地检测呼吸道合胞病毒。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种荧光型快速检测呼吸道合胞病毒的试剂盒，其特征在于：
含有如下所示的重组酶介导的恒温核酸扩增体系：
蜡样芽胞杆菌DNA聚合酶I大片段 80 ng/μL；
蜡样芽胞杆菌DNA重组酶RecA 50 ng/μL；
T4噬菌体单链DNA结合蛋白 400 ng/μL；
T4噬菌体重组调节蛋白 60 ng/μL；
AP位点核酸内切酶 80 ng/μL；
逆转录酶M-MLV 10 U/μL；
肌酸激酶 50 ng/μL；
Tirs缓冲液 40mM；
醋酸钾 80 mM；
醋酸镁 25 mM；
三(2-羰基乙基)磷盐酸盐 20 mM；
海藻糖 5%；
聚乙二醇20000 5 %w/v；
dNTP 3 mM ；
ATP 5 mM；
磷酸肌酸 100 mM；
精氨酸盐酸盐 10 mM；
核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的正向引物 400 nM；
核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的反向引物 400 nM；
核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示的靶探针 200 nM。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述靶探针标记不同荧光色的荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团选自Cyan500、FAM、VIC、Cy3、JOE、TAMRA、Texas Red、ROX、Cy5、Cy5.5、TET、HEX、NED，所述淬灭基团选自MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、NFQ、DABCYL、Eclipse。
3.一种胶体金型快速检测呼吸道合胞病毒的试剂盒，其特征在于：
含有如下所示的重组酶介导的恒温核酸扩增体系：
蜡样芽胞杆菌DNA聚合酶I大片段 80 ng/μL；
蜡样芽胞杆菌DNA重组酶RecA 50 ng/μL；
T4噬菌体单链DNA结合蛋白 400 ng/μL；
T4噬菌体重组调节蛋白 60 ng/μL；
核酸内切酶 80 ng/μL；
逆转录酶M-MLV 10 U/μL
肌酸激酶 50 ng/μL；
Tirs缓冲液 40 mM；
醋酸钾 80 mM；
醋酸镁 25 mM；
三(2-羰基乙基)磷盐酸盐 20 mM；
海藻糖 5 %；
聚乙二醇20000 5% w/v；
dNTP 3 mM ；
ATP 5 mM；
磷酸肌酸 100 mM；
精氨酸盐酸盐 10 mM；
核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的正向引物 400 nM；
核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的反向引物 400 nM；
核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示的靶探针 200 nM；
所述反向引物5’端修饰biotin。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述靶探针于5’端标记抗原标记，距离5’端25-50nt序列位置上标记四氢呋喃修饰，3’末端标记修饰基团。
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| CN117551818A (zh) | 2024-02-13 |
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