CN110982940A - 基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的组合物及试剂盒 - Google Patents

基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的组合物及试剂盒 Download PDF

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张颖
狄飚
朱娉婷
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张蓉
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Abstract

本发明公开了一种基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的组合物，所述组合物包括用于检测麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的引物序列，本发明能够在一个反应体系中的同一个荧光通道同时检出目前已知的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒全部三种病毒，一次检测即可以同时检出三种病毒；跟现有产品相比，不需较昂贵的探针合成即可完成检测，本发明提供的试剂盒操作简便，适应性好，成本较低。

Description

基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测 的组合物及试剂盒
技术领域
本发明属于病毒的体外诊断技术领域，特别涉及一种基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的组合物及试剂盒。
背景技术
麻疹病毒（Measles Virus，MV）属副粘病毒科，麻疹病毒属，其基因组为单股负链RNA病毒，全长约含15894个核苷酸。尽管麻疹病毒只有一个血清型，目前，世界卫生组织已经鉴定出23个基因型。麻疹是一种高度接触传染的病毒感染性疾病，最常出现在儿童中，其特征性表现是发热、咳嗽、鼻炎、结膜炎、口腔黏膜上的黏膜疹以及从头至尾扩展的斑丘疹。风疹病毒（Rubella Virus，RV）属披膜病毒科，风疹病毒属，其基因组为单股正链RNA病毒，全长约含9757个核苷酸。风疹是一种接触传染的病毒感染性疾病，可造成腺体病、皮疹，全身症状通常轻而短暂。孕早期感染可能导致自发性流产、死产或者先天性缺陷。腮腺炎病毒（Mumps Virus）属副粘病毒科，副粘病毒属，其基因组为单股负链RNA病毒，全长约含15384个核苷酸。腮腺炎病毒可分为 A、B、C、D、E、F、G、H 等8个基因型。流行性腮腺炎是一种急性接触传染的、影响全身的病毒感染性疾病，通常引起唾液腺疼痛，最常见的是腮腺，为双侧或单侧腮腺炎症，发病初期可有发热、头痛、肌痛、厌食，多发于儿童。合并症可以包括***、脑膜脑炎以及胰腺炎。
麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的实验室诊断方法主要有IgM抗体检测法、IgG抗体检测法、病毒分离培养和病毒核酸检测。其中病毒核酸检测包括普通PCR法、荧光PCR法（Real-Time PCR，RT-PCR）、等温扩增法等技术。RT-PCR具有速度快、通量高、灵敏度高、特异性强等突出优势，从而成为最主要手段的临床诊断方法，辅助病毒分离培养和血清学检测病毒(急性期特异性抗体)。虽然RT-PCR方法检测灵敏度高于其他检测手段，但传统的单通道检测通量低，针对同一个样本需要使用多组引物和探针组合进行多次检测以确定病毒型别。目前也有部分基于不同颜色基团标记TaqMan或MGB探针的病毒核酸检测试剂盒，但此类试剂盒都需要标记不同颜色基团的探针（例如CN201210015448.1），尚没有一种试剂盒能够在一个反应体系中的同一个荧光通道同时检出目前已知的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的组合物及试剂盒，本方法建立的新型基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测试剂盒弥补了这一不足。
为实现上述目的，本发明提供了一种基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的组合物，组合物包括用于检测麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的核酸序列，其中，针对麻疹病毒引物、风疹病毒引物和腮腺炎病毒引物的序列如下：
麻疹病毒引物：SEQ ID NO.1：gacaaaccacccattacatcaggatccgg 和SEQ ID NO.2：catgtgaaaagtattggtccgcctcatcct；
风疹病毒引物：SEQ ID NO.3：attctgcaacacgccgcacggacaact和SEQ ID NO.4：tggcccccacgagccgcgagcagtcag；
腮腺炎病毒引物：SEQ ID NO.5：ccaaaatgacttcagagtacagccactaca和SEQ ID NO.6：aattgggggtagtttgatcatgtcagtgat。
本发明进一步限定的技术方案为：
优选地，上述技术方案中，所述麻疹病毒引物、风疹病毒引物和腮腺炎病毒引物的浓度均为0.1-0.6μmol/L。
本发明还公开了一种基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的试剂盒，包括如前所述的基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的组合物。
本发明进一步限定的技术方案为：
优选地，上述技术方案中，还包括RT-PCR反应液、酶混合液、阳性对照和空白对照。
优选地，上述技术方案中，所述的RT-PCR反应液包括：缓冲液、Mg2+、dNTPs。
优选地，上述技术方案中，所述的酶混合液包括：RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、逆转录酶。
优选地，上述技术方案中，所述的阳性对照为人工合成的基因。
优选地，上述技术方案中，所述的空白对照为灭菌的去RNA酶水。
利用如前文所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
（1）提取待测样品RNA；
（2）以待测样品RNA为模板，加入SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6反应液，酶混合液以及RT-PCR反 应试剂，配成RT-PCR反应体系，进行扩增反应和熔解曲线分析。
本发明进一步限定的技术方案为：
优选地，上述技术方案中，扩增反应的条件为：42-50℃ 10-30min；93-95℃ 5-10min；93-95 ℃ 10-15s，55-60 ℃ 40-60s，共进行45个循环；熔解曲线分析条件为：93-95℃ 10-15s；40-45℃ 30-60s；从60-65 ℃开始运行熔解曲线分析程序。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、能够在一个反应体系中的同一个荧光通道同时检出目前已知的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒全部三种病毒，一次检测即可以同时检出三种病毒；
2、不需较昂贵的探针合成即可完成检测，本发明提供的试剂盒操作简便，适应性好，成本较低；
3、在检测其他病原时没有交叉反应，具有很强的特异性；麻疹病毒的检出限 为1000copies/mL，风疹病毒的检出限为1000 copies/mL，腮腺炎病毒的检出限为1000 copies/mL，检出限低，灵敏度高；可广泛应用于各级医疗卫生机构的发热出疹监测/检测实验室，对临床诊断、人群筛查等多种样本中的可疑发热出疹病毒进行鉴别，具有适用于多种样本的优势。
附图说明：
图1为实施例1中应用于麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测鉴别的熔解曲线示意图。
图2为实施例2中基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的试剂盒的特异性试验扩增曲线图。
图3为实施例2中基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的试剂盒特异性试验阳性样本麻疹病毒的熔解曲线图。
图4为实施例2中基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的试剂盒特异性试验阳性样本风疹病毒的熔解曲线图。
图5为实施例2中基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的试剂盒特异性试验阳性样本腮腺炎病毒的熔解曲线图。
具体实施方式：
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护 范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或 组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
一种基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测试剂盒，是一种能够在同一反应体系中同一荧光通道同时检测麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸RNA的试剂盒，可应用于人类临床样本、微生物/病毒培养物样本等多种样本类型进行检测。
利用生物信息学分析技术手段筛选麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的基因保守区，根据保守区序列设计特异性引物对，并确定扩增产物的熔解温度和最佳反应体系的检测程序，并对该检测方法的灵敏度、特异性、稳定性进行性能验证，及临床样本检测。
基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的组合物，包括用于麻疹病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒检测的引物序列，各引物序列的浓度为0.1-0.6μmol/L。
用于麻疹病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
用于风疹病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；
用于腮腺炎病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；
表1基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的组合物：
基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的试剂盒，包括基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的组合物、RT-PC反应液、酶混合液、空白对照和阳性对照，其中RT-PCR反应液包括缓冲液、dNTPs和Mg2+，酶混合液包括RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、逆转录酶，其中阳性对照为人工合成的基因。空白对照为灭菌的去RNA酶水。
与现有的基于TaqMan或MGB探针的荧光PCR法检测相比，在具有同样检测性能的基础上不需较昂贵的探针合成即可完成检测，本发明提供的试剂盒操作简便，适应性好，成本较低。
在检测其他病原时没有交叉反应，具有很强的特异性；麻疹病毒的检出限为1000copies/mL，风疹病毒的检出限为1000 copies/mL，腮腺炎病毒的检出限为1000 copies/mL，检出限低，灵敏度高；可广泛应用于各级医疗卫生机构的发热出疹监测/检测实验室，对临床诊断、人群筛查等多种样本中的可疑发热出疹病毒进行鉴别，具有适用于多种样本的优势。
实施例1 基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测试剂盒的建立
1、样本核酸提取采用Qiagen公司的 QIAamp® Viral RNA Mini Kit试剂盒，制备样本核酸RNA体积60μL。
2、配制试剂反应体系为25μL，反应体系组成如表2所示：
表2试剂盒的试剂反应体系：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
。
3、设置荧光PCR扩增和熔解曲线程序
按照以下程序进行RT-PCR扩增：42-50℃ 10-30min；93-95℃ 5-10min；93-95 ℃ 10-15s，55-60 ℃ 40-60s，共进行45个循环；
按照以下程序进行熔解曲线分析：93-95℃ 10-15s；40-45℃ 30-60s；从60-65 ℃开始运行熔解曲线分析程序。
4、结果判定
（1）阴阳性判定
扩增曲线呈S形且Ct值≤35，判定为阳性；Ct值≥38，判定为阴性；Ct值＞ 35且＜38，判定为可疑，需重复检测。
当阴性对照检测阴性且阳性对照检测阳性时，若待测样本检测阳性，则结果判定为病毒核酸阳性；当阴性对照检测阴性且阳性对照检测阳性时，若待测样本检测阴性，则结果判定为病毒核酸阴性；除此之外的其他所有情况判定为可疑或检测失败，需重复检测。
（2）病毒类型判定
针对病毒核酸检测阳性样本，当熔解曲线峰值在84.0±0.5℃时，判定为麻疹病毒核酸阳性；当熔解曲线峰值在76.5±0.5℃时，判定为腮腺炎病毒核酸阳性；当熔解曲线峰值在70.5±0.5℃时，判定为风疹病毒核酸阳性；当熔解曲线峰值在上述所有范围之外时为检测失败，需重复检测。如图1所示，图1为应用于麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测分型判定的熔解曲线示意图，显示不同熔解曲线峰型和区分。
实施例2 基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的试剂盒的特异性分析
利用实施例1中建立的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的试剂盒分别对肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、腺病毒、水痘-带状疱疹病毒、鼻病毒、单纯疱疹病毒、登革病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒进行检测。如图2所示，图2为麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的试剂盒特异性试验扩增曲线图，其中曲线1为麻疹病毒扩增曲线，曲线2为风疹病毒扩增曲线；曲线3为腮腺炎病毒扩增曲线；曲线4-12为肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、腺病毒、水痘-带状疱疹病毒、鼻病毒、单纯疱疹病毒、登革病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒的扩增曲线。如图3所示，图3为特异性试验阳性样本麻疹病毒的熔解曲线图，图3中可见阳性样本麻疹病毒的熔解曲线峰值 为84.0；如图4所示，图4为特异性试验阳性样本风疹病毒的熔解曲线图，图4中可见阳性样本风疹病毒的熔解曲线峰值为70.5；如图5所示，图5为特异性试验阳性样本腮腺炎的熔解曲线图，图5中可见阳性样本腮腺炎病毒的熔解曲线峰值为76.5。麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的试剂盒特异性试验的检测结果见表3，可见本发明所述试剂盒在检测其他病原时没有交叉反应，具有很强的特异性。
表3麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的试剂盒特异性确认：
样本名称 检测结果 样本名称 检测结果
风疹病毒 阳性 肠道病毒71型 阴性
麻疹病毒 阳性 柯萨奇病毒A16型 阴性
腮腺炎病毒 阳性 腺病毒 阴性
- - 水痘-带状疱疹病毒 阴性
- - 鼻病毒 阴性
- - 单纯疱疹病毒 阴性
- - 登革病毒 阴性
- - 甲型流感病毒 阴性
- - 乙型流感病毒 阴性
- - 副流感病毒 阴性
- - 呼吸道合胞病毒 阴性
- - 冠状病毒 阴性
实施例3基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测试剂盒的对麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒最低检出限的确认
利用实施例1中建立的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测试剂盒分别对麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的不同浓度样本进行检测，结果见表4、表5和表6，表4为麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测试剂盒检测麻疹病毒检出限确认，表5为麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测试剂盒检测风疹病毒检出限确认，表6为麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测试剂盒检测腮腺炎病毒检出限确认。通过表4、表5和表6，结果显示本检测方法的最低检出限(LOD)为麻疹病毒1000 copies/mL，风疹病毒1000 copies/mL，腮腺炎病毒1000 copies/mL。
表4麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测试剂盒检测麻疹病毒最低检出限确认：
样本浓度（copies/mL） 检测重复数 检测阳性数 阳性检出率
10 20 4 20.0%
100 20 16 80.0%
1000 20 20 100.0%
10000 20 20 100.0%
表5麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测试剂盒检测风疹病毒最低检出限确认：
样本浓度（copies/mL） 检测重复数 检测阳性数 阳性检出率
10 20 5 25.0%
100 20 13 65.0%
1000 20 20 100.0%
10000 20 20 100.0%
表6麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测试剂盒检测腮腺炎病毒最低检出限确认：
样本浓度（copies/mL） 检测重复数 检测阳性数 阳性检出率
10 20 2 10.0%
100 20 8 40.0%
1000 20 20 100.0%
10000 20 20 100.0%
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 广州市疾病预防控制中心
<120> 基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的组合物及试剂盒
<130> P20190075
<141> 2019-12-30
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gacaaaccac ccattacatc aggatccgg 29
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catgtgaaaa gtattggtcc gcctcatcct 30
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
attctgcaac acgccgcacg gacaact 27
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggcccccac gagccgcgag cagtcag 27
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccaaaatgac ttcagagtac agccactaca 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aattgggggt agtttgatca tgtcagtgat 30

Claims (10)

1.一种基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的组合物，其特征在于，所述组合物包括用于检测麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的核酸序列，其中，针对麻疹病毒引物、风疹病毒引物和腮腺炎病毒引物的序列如下：
麻疹病毒引物：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
风疹病毒引物：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；
腮腺炎病毒引物：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。
2.按照权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述麻疹病毒引物、风疹病毒引物和腮腺炎病毒引物的浓度均为0.1-0.6μmol/L。
3.一种基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的组合物。
4.按照权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，其特征在于，还包括RT-PCR反应液、酶混合液、阳性对照和空白对照。
5.按照权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的RT-PCR反应液包括：缓冲液、Mg2+、dNTPs。
6.按照权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶混合液包括：RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、逆转录酶。
7.按照权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为人工合成的基因。
8.按照权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的空白对照为灭菌的去RNA酶水。
9.利用权利要求3所述试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）提取待测样品RNA；
（2）以待测样品RNA为模板，加入SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6反应液，酶混合液以及RT-PCR反应试剂，配成RT-PCR反应体系，进行扩增反应和熔解曲线分析。
10.按权利要求9所述的使用方法方法，其特征在于，所述扩增反应的条件为：42-50℃10-30min；93-95℃ 5-10min；93-95 ℃ 10-15s，55-60 ℃ 40-60s，共进行45个循环；熔解曲线分析条件为：93-95℃ 10-15s；40-45℃ 30-60s；从60-65 ℃开始运行熔解曲线分析程序。
CN201911392059.9A 2019-12-30 2019-12-30 基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的组合物及试剂盒 Pending CN110982940A (zh)

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