CN114773542B - 一种荧光聚苯乙烯微球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荧光聚苯乙烯微球的制备方法，所述方法为：先将与叠氮化合物偶联的荧光染料分子与聚苯乙烯微球通过溶胀法结合，再利用高温下叠氮化合物热解产生的中间体将荧光染料分子键合到聚苯乙烯微球上得到荧光聚苯乙烯微球。本发明制得的荧光编码微球内部及外部均布有大量的羧基和羟基官能团，官能团不仅使编码微球不易团聚，受环境影响小，而且因微球表面具有大量羟基官能团，可以有效减少微球对蛋白质的非特异性吸附；并且在加入相同荧光染料浓度下，本发明制得的荧光编码微球的荧光强度远高于现有有机溶胀法制得的荧光聚苯乙烯微球，并且荧光性能稳定。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光聚苯乙烯微球的制备方法。
背景技术
荧光聚苯乙烯微球在生物医学领域有着广泛的应用，为疾病诊断、食品检测、水环境检测等提供了重要的技术支持。现有的基于荧光有机染料制备荧光聚苯乙烯微球的方法中，如吸附法和化学键合法等，这些表面改性方法制备的荧光聚苯乙烯微球的荧光稳定性都不理想，如CN110484234A，CN109294554A等专利。在染料分子的包埋法和共聚过程中，染料分子干扰聚合过程的一个关键问题是染料尺寸分布宽，染料猝灭，对编码(编码是指结合不同含量的染料，从而具有不同的荧光信号)精度产生了副作用，如CN111875744A，CN111057174A，CN109943317A等专利。此外，还有提出主客体结构体系组装染料掺杂二氧化硅和微球载体，但制备的复杂性限制了其应用。有机染料膨胀法由于操作简单，稳定性好，定量染色准确，是制备荧光编码微球最有吸引力的平台之一，如CN111019643B，CN108359059B，CN108047382B等专利，但溶胀法制备的荧光聚合物微球仅依靠物理结合荧光染料，存在易泄露的问题。
发明内容
技术问题：本发明目的在于提供一种荧光聚苯乙烯微球的制备方法，该制备方法制得的荧光聚苯乙烯微球中荧光染料分子和聚苯乙烯微球基于化学键合和物理双重作用力结合，从而在相同编码浓度下，本发明方法制得的荧光聚苯乙烯微球荧光强度高且荧光性能稳定。
技术方案：本发明所述的荧光聚苯乙烯微球的制备方法，先将与叠氮化合物偶联的荧光染料分子与聚苯乙烯微球通过溶胀法结合，再利用高温下叠氮化合物热解产生的中间体将荧光染料分子键合到聚苯乙烯微球上得到荧光聚苯乙烯微球。
上述荧光聚苯乙烯微球的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)将荧光染料与叠氮化合物偶联结合；
(2)将聚苯乙烯种子微球分散于含有功能单体、引发剂和乳化剂的水溶液中，升温聚合，得到具有官能团修饰的微球载体；含表面活性剂(乳化剂)能够使功能单体乳化，从而更好的进入微球，利用功能单体对微球进行修饰一方面是为了使微球表面和内部均富含官能团，另一方面是为了使微球的结构更松散，从而后续溶胀进去更多的荧光染料分子；本发明使用的聚苯乙烯为通过柔性高分子单体与苯乙烯单体共聚制得，高分子链一圈一圈缠绕形成球状(类似于毛线球)，溶胀过程为将其分子链打开的过程；该步骤通过在聚苯乙烯微球内部溶胀功能单体，进行聚合重构微球，改善微球与染料的相容性。通过溶胀不同含量的高分子单体聚合成的微球载体，能够分别制得3.0～5.5μm的单分散微球。
(3)将步骤(1)中偶联叠氮化合物的荧光染料溶解于有机溶剂中，得到荧光染料溶液，将步骤(2)中微球载体溶解于有机溶剂中，得到微球载体溶液，将荧光染料溶液逐滴加到微球载体溶液中，得到混合溶液，偶联叠氮化合物的荧光染料溶胀到微球载体内部；
(4)高温处理步骤(3)的混合溶液，叠氮化合物热解产生的中间体磺酰硝烯或卡宾能够***微球聚合物的碳氢单键中，从而将叠氮化合物共价结合到聚苯乙烯微球上，使荧光染料分子与聚苯乙烯微球形成一个分子结构，得到本发明荧光聚苯乙烯微球。反应中间体***脂肪族化合物的碳氢单键中有利于实现荧光微球的大编码容量，在结合溶胀法和化学键合法的同时，微球表面功能化也通过溶胀聚合完成，荧光编码微球表面均布丰富的羧基和羟基，表面的羟基可以减少对蛋白质的非特异性吸附。
其中，步骤(1)中，荧光染料为Cy5、Cy3-NHS、Cy5-NHS、Cy7-NHS、BDP R6G NHSester或异硫氰酸荧光素，采用的叠氮化合物为磺酰叠氮化合物，利用荧光染料分子上的反应基团与叠氮化合物远离叠氮基团的反应基团偶联。
其中，步骤(2)中，先将功能单体分散在含有引发剂和乳化剂的水溶液中，再将聚苯乙烯种子微球加入到上述溶液中，聚合温度为70～80℃。在步骤(2)中功能单体充当溶胀剂的作用。
其中，步骤(2)中，所述引发剂为过氧化苯甲酰，引发剂的加入量为功能单体质量的2％～3％。
其中，步骤(2)中，所述功能单体为二乙烯基苯、甲基丙烯酸、马来酸酐、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、琥珀酸单[2-[(2-甲基-丙烯酰基)氧]乙基]酯、琥珀酸单[2-[(2-丙烯酰基)氧]乙基]酯、甲基丙烯酸叔丁酯、N-乙烯基吡咯烷酮、醋酸乙烯酯、醚酰亚胺、乳酸、丙烯、对苯二甲酸乙二醇酯、二甲基硅氧烷、二酐、二胺、乙烯、N，N-亚甲基双丙烯酰胺或乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一种或几种的组合。
其中，步骤(3)中，所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮或甲苯中的一种或几种的混合，有机溶剂的添加量为微球载体质量的10倍左右。
其中，步骤(3)中，将混合溶液置于100℃下反应。与荧光染料分子偶联的叠氮化合物被加热到100℃时发生热裂解反应，叠氮化合物生成活性中间体磺酰硝烯或卡宾，磺酰硝烯或卡宾可与微球聚合物(脂肪族化合物)形成共价键，荧光染料分子在高温前后具有基本相同的结构和组成。置于100℃左右高温下,低于微球的玻璃转化温度，不影响微球尺寸分布。反应中间体包括结合荧光染料的非活性部分，以及远离染料端的活性叠氮官能团部分。
本发明方法将与微球结合的染料分子偶联叠氮化合物，在不影响染料分子结构和荧光特性的基础上(这是因为叠氮化合物的萘核可以使反应性磺酰硝烯或卡宾远离染料分子，从而减少结合反应对荧光染料分子结构和性能的影响)，通过高温裂解叠氮化合物，产生活性反应中间体，反应中间体可以与微球共价结合，从而制备出高荧光强度、荧光性能稳定的荧光编码微球。
有益效果：本发明制得的荧光编码微球内部及外部均布有大量的羧基和羟基官能团，官能团不仅使编码微球不易团聚，受环境影响小，而且因微球表面具有大量羟基官能团，可以有效减少微球对蛋白质的非特异性吸附，从而增加对抗原特异性结合能力；并且在加入相同荧光染料浓度下，本发明制得的荧光编码微球的荧光强度远高于现有有机溶胀法制得的荧光聚苯乙烯微球。
附图说明
图1为偶联染料分子的叠氮化合物的结构式；
图2为聚苯乙烯种子微球的扫描电子显微镜图像；
图3为粒径5.5μm编码微球载体的扫描电子显微镜图像；
图4为Cy5-NHS的结构式；
图5为荧光微球内部结构示意图；
图6为实施例1～4和对比例1～3制备的荧光微球的荧光强度对比图；
图7为实施例1～4和对比例1～3制备的荧光微球的荧光强度随时间的变化图。
具体实施方式
实施例1
本发明荧光聚苯乙烯微球的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)荧光染料分子偶联叠氮化合物的制备：将10mg 5-氨基-1-萘磺酸叠氮化合物和15mg酰氯化Cy5溶解于2mL二氯甲烷中，搅拌过夜后，过滤除去杂质，30℃下旋转蒸发除去有机溶剂，无需进一步纯化待用；
(2)荧光编码微球载体的制备：将苯乙烯(2g)、二乙烯基苯(0.05g)、甲基丙烯酸缩水甘油酯(0.10g)、琥珀酸单[2-[(2-甲基-丙烯酰基)氧]乙基]酯(0.10g)以及过氧化苯甲酰(0.12g)分别乳化于30mL质量浓度为0.2％的SDS溶液中；再将聚苯乙烯种子微球(0.1g)分散在上述乳化液中，于30℃下搅拌12h，再于74℃下加热24h，反应后冷却至室温，然后将样品收集到50mL分离管中待用；图2～3分别为聚苯乙烯种子微球和微球载体的扫描电子显微镜图像；
(3)将步骤(2)得到的微球载体(100mg)分散于10mL甲醇溶液中，超声分散1分钟，得到微球载体溶液；再将步骤(1)得到的5μgCy5-5-氨基-1-萘磺酸叠氮化物溶解于1mL二氯甲烷中，得到荧光染料溶液；将荧光染料溶液逐滴加到微球载体溶液中，超声2分钟，得到混合溶液；混合溶液旋蒸除去二氯甲烷，升温加热到100℃，反应10h；反应后离心洗涤，将得到的荧光编码微球再分散在蒸馏水超声保存；所得微球样品球形度好，粒径均匀，粒径约为5.5μm。
实施例2
本发明荧光聚苯乙烯微球的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)荧光染料分子偶联叠氮化合物的制备：将10mg7-氨基-4-羟基-3-[(4-甲氧基-2-磺基苯基)偶氮]-2-萘磺酸叠氮和15mg酰氯化Cy5溶解于2mL二氯甲烷中，搅拌过夜后，过滤除去杂质，30℃下旋转蒸发除去有机溶剂，无需进一步纯化待用；
(2)荧光编码微球载体的制备：将苯乙烯(2g)、二乙烯基苯(0.05g)、甲基丙烯酸缩水甘油酯(0.10g)、琥珀酸单[2-[(2-甲基-丙烯酰基)氧]乙基]酯(0.10g)以及过氧化苯甲酰(0.12g)分别乳化于30mL质量浓度为0.2％的SDS溶液中；再将聚苯乙烯种子微球(0.1g)分散在上述乳化液中，于30℃下搅拌12h，再于74℃下加热24h，反应后冷却至室温，然后将样品收集到50mL分离管中待用；
(3)将步骤(2)得到的微球载体(100mg)分散于10mL乙醇溶液中，超声分散1分钟，得到微球载体溶液；再将步骤(1)得到的10μgCy5-7-氨基-4-羟基-3-[(4-甲氧基-2-磺基苯基)偶氮]-2-萘磺酸叠氮溶解于1mL丙酮中，得到荧光染料溶液；将荧光染料溶液逐滴加到微球载体溶液中，超声2分钟，得到混合溶液；混合溶液旋蒸除去丙酮，升温加热到100℃，反应10h；反应后离心洗涤，将得到的荧光编码微球再分散在蒸馏水超声保存；所得微球样品球形度好，粒径均匀，粒径约为5.5μm。
实施例3
本发明荧光聚苯乙烯微球的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)荧光染料分子偶联叠氮化合物的制备：将10mg5-(2-氨基乙胺)-1-萘磺酸叠氮和15mgFITC(异硫氰酸荧光素)溶解于2mL二氯甲烷中，搅拌过夜后，过滤除去杂质，30℃下旋转蒸发除去有机溶剂，无需进一步纯化待用；
(2)荧光编码微球载体的制备：将苯乙烯(2g)、二乙烯基苯(0.05g)、甲基丙烯酸缩水甘油酯(0.10g)、琥珀酸单[2-[(2-甲基-丙烯酰基)氧]乙基]酯(0.10g)以及过氧化苯甲酰(0.12g)分别乳化于30mL质量浓度为0.2％的SDS溶液中；再将聚苯乙烯种子微球(0.1g)分散在上述乳化液中，于30℃下搅拌12h，再于74℃下加热24h，反应后冷却至室温，然后将样品收集到50mL分离管中待用；
(3)将步骤(2)得到的微球载体(100mg)分散于10mL甲醇溶液中，超声分散1分钟，得到微球载体溶液；再将步骤(1)得到的5μgFITC-(5-(2-氨基乙胺)-1-萘磺酸叠氮溶解于1mL丙酮中，得到荧光染料溶液；将荧光染料溶液逐滴加到微球载体溶液中，超声2分钟，得到混合溶液；混合溶液旋蒸除去丙酮，升温加热到100℃，反应10h；反应后离心洗涤，将得到的荧光编码微球再分散在蒸馏水超声保存；所得微球样品球形度好，粒径均匀，粒径约为5.5μm。
实施例4
本发明荧光聚苯乙烯微球的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)荧光染料分子偶联叠氮化合物的制备：将10mg5-(2-氨基乙胺)-1-萘磺酸叠氮和15mgBDP R6G NHSester溶解于2mL二氯甲烷中，搅拌过夜后，过滤除去杂质，30℃下旋转蒸发除去有机溶剂，无需进一步纯化待用；
(2)荧光编码微球载体的制备：将苯乙烯(2g)、二乙烯基苯(0.05g)、甲基丙烯酸缩水甘油酯(0.10g)、琥珀酸单[2-[(2-甲基-丙烯酰基)氧]乙基]酯(0.10g)以及过氧化苯甲酰(0.12g)分别乳化于30mL质量浓度为0.2％的SDS溶液中；再将聚苯乙烯种子微球(0.1g)分散在上述乳化液中，于30℃下搅拌12h，再于74℃下加热24h，反应后冷却至室温，然后将样品收集到50mL分离管中待用；
(3)将步骤(2)得到的微球载体(100mg)分散于10mL甲醇溶液中，超声分散1分钟，得到微球载体溶液；再将步骤(1)得到的10μgBDP R6G NHS ester-(5-(2-氨基乙胺)-1-萘磺酸叠氮溶解于1mL二氯甲烷中，得到荧光染料溶液；将荧光染料溶液逐滴加到微球载体溶液中，超声2分钟，得到混合溶液；混合溶液旋蒸除去二氯甲烷，升温加热到100℃，反应10h；反应后离心洗涤，将得到的荧光编码微球再分散在蒸馏水超声保存；所得微球样品球形度好，粒径均匀，粒径约为5.5μm。实施例4制得的荧光微球内部结构如图5所示，染料分子被结合到微球的内部和表面。
对比例1
基于现有有机溶剂溶胀法将10μg荧光染料(BDP R6G NHS)溶胀经步骤(2)处理的微球载体，得到的微球的粒径约为5.5μm，荧光强度如图6所示，其荧光稳定性如图7所示。荧光稳定性是指荧光微球在水溶液中长期储存的荧光强度变化。
对比例2
基于现有有机溶剂溶胀法将5μgFITC溶胀经步骤(2)处理的微球载体，得到的微球的粒径约为5.5μm，溶胀FITC的荧光强度为如图6中所示。
对比例3
基于现有有机溶剂溶胀法将10μg荧光染料(BDP R6G NHS)溶胀聚苯乙烯种子微球，得到的微球的粒径约为2μm，荧光强度为如图6所示，其荧光稳定性如图7所示。
实施例1和实施例2的结果表明，当使用不同用量的荧光染料叠氮化物(Cy5-5-氨基-1-萘磺酸叠氮化物)对本发明制备的载体微球进行溶胀，并且高温处理溶胀后的微球，使荧光染料与微球载体进行键合反应。本发明可以制备出荧光强度不同的荧光编码微球，荧光微球的荧光强度和稳定性的数据如图6和7所示。
由于柔性高分子链在载体微球内部分布，使荧光染料的溶胀效果改善，且叠氮基团可与高分子链进行键合反应，增加了染料分子结合的数量，荧光染料在内部分布均匀，减少了染料的聚集性淬灭情况。实施例4和对比例1以及实施例3和对比例2的荧光强度和稳定性表明，当使用本发明制备的载体微球用于制备荧光微球时，相比于一般溶胀法，荧光强度提高两倍到三倍，且可以长期储存，稳定性更好，具体如图6和7。
由于载体微球内部结构被柔性高分子链填充，极大的增加了荧光染料的相容性，因此，将相同的荧光染料用于一般的溶胀法，对比例1和3的荧光强度和稳定性表明，本发明制备的载体微球相比于聚苯乙烯微球，制备的荧光微球的荧光强度约高3倍左右，并且在较长时间内荧光强度保持一定数值，稳定性较好，具体如图6和7。
本发明方法制得的聚合物微球(利用功能单体重聚后)内部的高分子链有良好的柔韧性和延展性，能够在溶胀荧光有机染料时充分打开，从而利于荧光有机染料分子渗透到微球内部，极大地提高了染料的溶胀效率，进而提高偶联染料的叠氮化合物和微球共价结合，增加了微球的编码容量，避免了目前存在编码容量不足所导致的检测类型数量限制的问题。本发明方法制得的荧光微球具有高荧光强度，同时利用功能单体完成了微球的表面官能化，从而改善了对待检测目标分子的特异性结合能力和微球的分散性。
Claims (1)
1.一种荧光聚苯乙烯微球的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）荧光染料分子偶联叠氮化合物的制备：将10mg 5-(2-氨基乙胺)-1-萘磺酸叠氮和15mg BDP R6G NHSester溶解于2mL二氯甲烷中，搅拌过夜后，过滤除去杂质，30℃下旋转蒸发除去有机溶剂；
（2）荧光编码微球载体的制备：将2g苯乙烯、0.05g二乙烯基苯、0.10g甲基丙烯酸缩水甘油酯、0.10g琥珀酸单[2-[(2-甲基-丙烯酰基)氧]乙基]酯以及0.12g过氧化苯甲酰分别乳化于30mL质量浓度为0.2%的SDS溶液中；再将0.1g聚苯乙烯种子微球分散在上述乳化液中，于30℃下搅拌12h，再于74℃下加热24h，反应后冷却至室温，然后将样品收集到50mL分离管中待用；
（3）将步骤（2）得到的100mg微球载体分散于10mL甲醇溶液中，超声分散1分钟，得到微球载体溶液；再将步骤（1）得到的10µg BDP R6G NHS ester-（5-(2-氨基乙胺)-1-萘磺酸叠氮溶解于1mL二氯甲烷中，得到荧光染料溶液；将荧光染料溶液逐滴加到微球载体溶液中，超声2分钟，得到混合溶液；混合溶液旋蒸除去二氯甲烷，升温加热到100℃，反应10h；反应后离心洗涤，得到荧光聚苯乙烯微球。
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