CN114703134A - 一种体外分化和扩增Th17细胞的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种体外分化和扩增Th17细胞的方法及应用。本发明还提供了在体外选择性分化和扩增Th17细胞的组合物和方法。本发明提供的方法以及利用本发明提供的组合物所产生Th17细胞不仅数量充足、同质性高，而且具有高度分化的特点以及稳定性高以及功能活性强；所述方法简单、易操作，并且成本低。本发明所产生的Th17细胞适用于研究机体免疫调控和免疫平衡的分子机制以及检测与Th17细胞异常活化相关疾病或病症治疗药物的生物学功能。

Description

一种体外分化和扩增Th17细胞的方法及应用
技术领域
本发明属于细胞培养领域，涉及一种体外分化和扩增Th17细胞的方法及应用。具体地，本发明涉及在体外选择性分化和扩增Th17细胞的组合物和方法，以及通过本发明的方法能够产生高同质性的Th17细胞。
背景技术
CD4+辅助性T淋巴细胞(helper T cell，Th)是细胞免疫的介质，在活化其他免疫细胞(如B细胞和细胞毒性T细胞)以及调节免疫反应中起着关键作用。未定向分化的CD4+Th细胞称为初始(naive)CD4+T细胞或Th前体细胞(Th0)，在识别抗原后，初始CD4+T细胞经历克隆扩增并在不同细胞因子、转录因子以及共刺激信号和黏附分子影响下分化为不同的效应细胞亚型(即CD4+Th细胞亚群)，这些CD4+Th细胞亚群，包括Th1、Th2、Th17和调节性T细胞(Treg)，每个亚群都由一组特定的细胞因子和转录因子活化，并通过其分泌不同的细胞因子而发挥不同的效应功能，各细胞因子间相互调控，使机体处于精细而复杂的免疫平衡状态，在细胞免疫中发挥重要作用。
Th17细胞是继Th1和Th2细胞被发现之后的第三类效应性CD4+Th细胞亚群，因其分泌高水平的IL-17而得名。Th17主要分泌IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22等细胞因子，并表达转录因子维甲酸相关孤儿核受体(retinoid-related orphan receptor，ROR)gt和RORa，而在宿主防御细胞外病原体中发挥作用，特别是粘膜和上皮屏障处，但Th17细胞失调与多种自身免疫疾病(包括多发性硬化症、类风湿性关节炎、炎症性肠病、银屑病和牛皮癣等)的发生有关。
目前Th17细胞已成为免疫学领域的研究热点，越来越多的研究将Th17细胞及其细胞因子产物作为多种自身免疫疾病的治疗靶点进行探索，因此在体外获取数量多、同质性高且稳定的Th17细胞成为对Th17细胞研究的首要条件。然而，由于体外分化扩增方法不同常导致获得的Th17细胞具有较大差异，表现为数量不足、同质性差和/或不稳定，易转分化或去分化。
由此可见，亟需开发一种能够快速、有效且稳定可靠的方法进行体外分化、扩增得到足够数量、同质性高且稳定的Th17细胞，使其适用于研究机体免疫调控和免疫平衡的分子机制以及检测与Th17细胞异常活化相关疾病或病症治疗药物的生物学功能。
发明内容
鉴于现有技术存在的技术缺陷，本发明提供了一种体外分化和扩增Th17细胞的方法，解决了从初始CD4+T细胞分化扩增为足够数量、同质性程度高且稳定的Th7细胞这一迫切需求。本发明还提供了在体外选择性分化和扩增Th17细胞的组合物及其用来产生Th17细胞的方法。本发明提供的方法以及利用本发明提供的组合物所产生Th17不仅数量充足，而且细胞活力好，且同质性程度高，具有高度分化、稳定性高以及功能活性强的特点；所述方法简单、易操作，并且成本低；本发明所产生的Th17细胞适于用于检测与Th17细胞失调相关疾病或病症治疗药物的生物学活性/功能和/或用于免疫学机制(例如机体免疫调控和免疫平衡的分子机制)研究。
一方面，本发明提供了一种体外分化和扩增Th17细胞的方法，包括以下步骤：
(1)获取初始CD4+T细胞：所述的初始CD4+T细胞选自CD4+CD45RA+T细胞；
(2)将步骤(1)细胞在细胞培养基中活化、分化并扩增为Th17细胞；
(3)收获步骤(2)获得的Th17细胞并检测。
所述步骤(1)中的初始CD4+T细胞来源包括但不限于人外周血、脐带血、免疫器官(例如脾脏或***)内的血细胞和血前体细胞。初始CD4+T细胞包括表达CD4表面抗原的未分化的T细胞，包括但不限于人外周血、脐带血，以及其他事先操作过的CD4+T细胞。可先从骨髓，脐带血等来源取得的造血干细胞、淋巴母细胞等T细胞前体，并诱导分化至CD4+T细胞。
所述初始CD4+T细胞可利用磁珠分离技术从所述来源中的单核细胞群中分离纯化得到，还可以是商业化的已分离纯化的原代人CD4+CD45RA+T细胞。
所述步骤(2)中的细胞培养基包含基础细胞培养基和添加物，所述添加物包含极化细胞因子(polarizing cytokine)和IL-2，其中所述极化细胞因子包含TGF-b、IL-1b、IL-6、IL-21和IL-23的一种或多种，优选的所述极化细胞因子是TGF-b、IL-1b、IL-6和IL-23。
进一步，所述TGF-b在细胞培养基中的浓度为1-10ng/ml，优选2.5-10ng/ml，更优选的是2.5ng/ml；所述IL-6在细胞培养基中的浓度为10-50ng/ml，优选30ng/ml。
所述添加物TGF-b能够直接诱导以及协同IL-6通过STAT3信号促进RORgt和RORa的表达，使初始CD4+T细胞定向分化为Th17细胞；同时，IL-6的存在及其活化的STAT3信号有利于下调初始CD4+T细胞表达Foxp3，从而抑制TGF-b诱导CD4+T细胞向Treg细胞分化。本发明人意外地发现当IL-6与TGF-b的浓度比维持在5-12时，初始CD4+T细胞能够显著上调RORgt的表达量并维持在高水平，进而保证初始CD4+T细胞能够最大化地向Th17细胞分化，且分化程度高。进一步，添加物中的IL-1b不仅能够刺激初始CD4+T细胞使其向Th17细胞分化，而且还能够增强IL-6对TGF-b诱导Treg细胞分化的抑制作用，从而有利于初始CD4+T细胞分化为Th17细胞。IL-23能够促进Th17成熟、存活和增殖，有利于Th17高表达和分泌IL-17，并且还具有降低Th17去分化的潜力。
本发明通过大量实验发现在基础细胞培养基中同时添加TGF-b、IL-1b、IL-6、IL-23和IL-2，并控制在所述浓度范围内时，它们在最大程度促进Th17细胞分化方面具有协同增效作用，并且还能显著维持Th17细胞的存活、扩增、效应功能和稳定性。其中，优选地，IL-1β在细胞培养基中的浓度为20ng/mL，IL-23在细胞培养基中的浓度为30ng/mL，IL-2在细胞培养基中的浓度为10-30U/mL。
所述步骤(2)中的添加物还可以进一步包含抗CD3抗体和抗CD28抗体，所述抗CD3抗体和抗CD28抗体可以是可溶性的，也可以是免疫磁珠形式的。所述抗CD3抗体和抗CD28抗体与所述的IL-2能够有效激活和/或扩增初始CD4+T细胞，有利于促使初始CD4+T细胞分化为Th17细胞。
所述步骤(2)中的基础细胞培养基可以是无血清的细胞培养基，也可以是包含血清的细胞培养基，所述血清是10-20％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)。
所述无血清的细胞培养基选自以下一种或多种商用培养基：Yssel’s T CellMedium，Immunocult T cell media，CTS OpTmizer T cell expansion SFM和AIM VMedium，优选Yssel’s T Cell Medium，Immunocult T cell media，更优选的是ImmunocultT cell media。
本发明的发明人意外发现在含有血清的细胞培养基中培养获得的Th17细胞在细胞数量、活率、RORgt表达量和IL-17分泌水平方面较无血清的细胞培养基具有更好的表现。
所述步骤(2)中的细胞在所述细胞培养基中至少培养3天，优选6天，更优选地，将细胞在所述细胞培养基中培养3天后分离细胞并重新加入新鲜的所述细胞培养基继续培养至第6天。
本发明人惊奇地发现对初始CD4+T细胞进行持续性活化、分化和扩增培养6天，相较于第0天在包含所述极化细胞因子、IL-2以及抗CD3抗体和抗CD28抗体的细胞培养基中培养初始CD4+T细胞，并在第3天时更换不含所述抗CD3抗体和抗CD28抗体的细胞培养基培养至第6天所获得的细胞，不仅使得初始CD4+T细胞分化为具有终末分化效应表型的CCR6+Th17细胞，而且可以获得足够数量的、同质性高的且细胞功能活性强的Th17细胞。
所述步骤(2)中的添加物还可以包含抗IFN-g抗体和抗IL-4抗体，可有效防止Th17分化受到抑制，以及防止初始CD4+T细胞向其他CD4+Th细胞(例如，Th1和Th2)分化。
所述步骤(3)中的检测包括Th17细胞的表面标志物或细胞表面抗原、转录细胞因子和分泌的细胞因子。所述的表面标志物或细胞表面抗原包括CD39,CD121a，CD161,CCR4,CCR6,CXCR3,IL-21R,和IL-23R，优选CCR6和CXCR3；所述转录因子包括RORgt或RORa；所述分泌的细胞因子包括IL-17A,IL-17AF,IL-17F,IL-21,和IL-22，优选IL-17A。
另一方面，本发明还提供了一种在体外选择性分化和扩增Th17细胞的组合物及其用来产生Th17细胞的方法。所述组合物包含极化细胞因子和IL-2，其中所述极化细胞因子包含TGF-b、IL-1b、IL-6、IL-21和IL-23的一种或多种，优选的所述极化细胞因子是TGF-b、IL-1b、IL-6和IL-23。所述组合物还可以进一步包含抗CD3抗体和抗CD28抗体和/或抗IFN-g、抗IL-4抗体。所述方法包括以下步骤：(1)获取初始CD4+T细胞：所述的初始CD4+T细胞是CD4+CD45RA+T细胞；(2)将所述组合物加入到基础细胞培养基中配制为本发明的细胞培养基，将步骤(1)细胞在所述的细胞培养基中活化、分化并扩增为Th17细胞，所述组合物中的TGF-b在细胞培养基中的浓度为1-10ng/ml，优选2.5-10ng/ml，更优选的是2.5ng/ml；IL-6在细胞培养基中的浓度为10-50ng/ml，优选的是30ng/ml；所述IL-6与TGF-β的浓度比为5-12。进一步，所述组合物还包含IL-1β、IL-23和IL-2，其中，IL-1b在细胞培养基中的浓度为20ng/ml；IL-23在细胞培养基中的浓度为30ng/ml；IL-2在细胞培养基中的浓度为10-30U/ml。所述的基础细胞培养基可以是无血清的细胞培养基，也可以是包含10-20％FBS的细胞培养基；(3)收获步骤(2)获得的Th17细胞并检测Th17细胞的表面标志物或细胞表面抗原、转录因子和分泌的细胞因子。
第三方面，本发明提供了一种通过上述方法和使用上述组合物得到的Th17细胞在研究免疫学机制和/或检测与Th17细胞失调相关疾病或病症治疗药物的生物学功能中的用途。所述与Th17细胞失调相关疾病或病症包括但不限于自身免疫疾病(包括多发性硬化症、类风湿性关节炎、炎症性肠病、银屑病和牛皮癣等)以及其他特应性和慢性炎症性疾病。
本发明与现有技术相比具有如下优点及有益效果：
1、提供了一种体外分化和扩增Th17细胞的方法，通过对添加到基础细胞培养基中的添加物(包含细胞因子、FBS、抗CD3抗体和抗CD28抗体)的筛选，以及对细胞因子浓度或配比、FBS浓度、以及培养方式进行一系列优化，不仅能够产生足够数量的、活力好且同质性高的Th17细胞，而且所得到的Th17细胞具有终末分化效应表型，其稳定性高，不易转分化为其他CD4+辅助性T亚型以及去分化为初始CD4+T细胞；
2、提供了一种在体外选择性分化和扩增Th17细胞的组合物及其用来产生Th17细胞的方法，所述组合物成分简单，各成分间配比合理，并且将所述组合物添加到基础细胞培养基中所产生的Th17细胞不仅数量充足、活力好、同质性高，而且是终末分化的，稳定性高，不易转分化或去分化；
3、提供了一种体外分化、扩增Th17细胞的方法和组合物及其用以产生Th17细胞的方法，方法适用性强，具有良好的重复性和稳定性，且成本低，方法简单、易操作；
4、通过大量的研究实验发现，如果细胞一直培养6天且不换液，或者在第3天时更换为不含抗CD3和抗CD28的新鲜细胞培养基，T细胞因为未得到持续激活和促分化而变得衰竭以至于不能分泌细胞因子加强细胞分化，并且也不易再被激活，进而难以达到本发明方法的效果；
5、提供了一种体外分化和扩增Th17细胞的方法和组合物及其用以产生Th17细胞的方法，所述方法所获得的Th17细胞适用于研究免疫学机制和/或检测与Th17细胞失调相关疾病或病症治疗药物的生物学功能。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。
术语解释(本发明英文代号对应的中文名称)
序号 英文 中文
1 helper T cell,Th 辅助性T淋巴细胞
2 transforming growth factor-β,TGF-b 转化生长因子-b
3 interleukin,IL 白细胞介素
4 regulatory T cells,Treg 调节性T细胞
5 retinoid-related orphan receptor,ROR 维甲酸相关孤儿核受体
6 Forkhead box protein P3,FOXP3 叉头盒蛋白P3
7 fetal bovine serum,FBS 胎牛血清
8 peripheral blood mononuclear cells,PBMC 外周血单核细胞
9 Median Fluorescence Intensity,MFI 平均荧光强度
附图说明
图1.不同条件下的人初始CD4+T细胞分化、扩增为Th17细胞在第6天时的细胞活率(a)和活细胞密度(b)，其中，Stemcell IC 6表示细胞培养基中包含的抗CD3和抗CD28抗体是STEMCELL公司的ImmunoCultTMHuman CD3/CD28 T Cell Activator，并且采用实施例1的培养方式在第0天和第3天加入表1所示的各细胞培养基，共培养6天；Stemcell IC 3/3表示细胞培养基中包含的抗CD3和抗CD28抗体是STEMCELL公司的ImmunoCultTMHuman CD3/CD28T Cell Activator，并且采用对比实施例的培养方式在第0天加入表1所示的各细胞培养基，在第3天分离细胞，并加入不含抗CD3和抗CD28的新鲜培养基继续培养至第6天；Dynabeads 6表示细胞培养基中包含的抗CD3和抗CD28抗体是
Figure BDA0003553163510000031
Human T-Activator CD3/CD28，并且采用实施例1的培养方式在第0天和第3天加入表2所示的各细胞培养基，共培养6天；Dynabeads 3/3表示细胞培养基中包含的抗CD3和抗CD28抗体是
Figure BDA0003553163510000032
Human T-Activator CD3/CD28，并且采用对比实施例的培养方式在第0天加入表2所示的各细胞培养基，在第3天分离细胞，并加入不含抗CD3和抗CD28的新鲜培养基继续培养至第6天。
图2.流式细胞术检测人初始CD4+T细胞在不同条件下分化和扩增后在第6天得到的RORgt+CD45RO+细胞，其中，Stemcell IC 6表示细胞培养基中包含的抗CD3和抗CD28抗体是STEMCELL公司的ImmunoCultTMHuman CD3/CD28 T Cell Activator，并且采用实施例1的培养方式在第0天和第3天加入表1所示的各细胞培养基，共培养6天；Stemcell IC 3/3表示细胞培养基中包含的抗CD3和抗CD28抗体是STEMCELL公司的ImmunoCultTMHuman CD3/CD28T Cell Activator，并且采用对比实施例的培养方式在第0天加入表1所示的各细胞培养基，在第3天分离细胞，并加入不含抗CD3和抗CD28的新鲜培养基继续培养至第6天；Dynabeads 6表示细胞培养基中包含的抗CD3和抗CD28抗体是
Figure BDA0003553163510000041
Human T-Activator CD3/CD28，并且采用实施例1的培养方式在第0天和第3天加入表2所示的各细胞培养基，共培养6天；Dynabeads 3/3表示细胞培养基中包含的抗CD3和抗CD28抗体是
Figure BDA0003553163510000042
Human T-Activator CD3/CD28，并且采用对比实施例的培养方式在第0天加入表2所示的各细胞培养基，在第3天分离细胞，并加入不含抗CD3和抗CD28的新鲜培养基继续培养至第6天。
图3.不同条件下的人初始CD4+T细胞分化和扩增为Th17细胞在第6天时的RORgt表达量，其中，Stemcell IC 6表示细胞培养基中包含的抗CD3和抗CD28抗体是STEMCELL公司的ImmunoCultTMHuman CD3/CD28 T Cell Activator，并且采用实施例1的培养方式在第0天和第3天加入表1所示的各细胞培养基，共培养6天；Stemcell IC 3/3表示细胞培养基中包含的抗CD3和抗CD28抗体是STEMCELL公司的ImmunoCultTMHuman CD3/CD28 T CellActivator，并且采用对比实施例的培养方式在第0天加入表1所示的各细胞培养基，在第3天分离细胞，并加入不含抗CD3和抗CD28的新鲜培养基继续培养至第6天；Dynabeads 6表示细胞培养基中包含的抗CD3和抗CD28抗体是
Figure BDA0003553163510000043
Human T-Activator CD3/CD28，并且采用实施例1的培养方式在第0天和第3天加入表2所示的各细胞培养基，共培养6天；Dynabeads 3/3表示细胞培养基中包含的抗CD3和抗CD28抗体是
Figure BDA0003553163510000044
Human T-Activator CD3/CD28，并且采用对比实施例的培养方式在第0天加入表2所示的各细胞培养基，在第3天分离细胞，并加入不含抗CD3和抗CD28的新鲜培养基继续培养至第6天。
图4.AlphaLISA法检测不同条件下的人初始CD4+T细胞分化和扩增为Th17细胞在第6天时的IL-17A分泌量，其中，Stemcell IC 6表示细胞培养基中包含的抗CD3和抗CD28抗体是STEMCELL公司的ImmunoCultTMHuman CD3/CD28 T Cell Activator，并且采用实施例1的培养方式在第0天和第3天加入表1所示的各细胞培养基，共培养6天；Stemcell IC 3/3表示细胞培养基中包含的抗CD3和抗CD28抗体是STEMCELL公司的ImmunoCultTMHuman CD3/CD28 T Cell Activator，并且采用对比实施例的培养方式在第0天加入表1所示的各细胞培养基，在第3天分离细胞，并加入不含抗CD3和抗CD28的新鲜培养基继续培养至第6天；Dynabeads 6表示细胞培养基中包含的抗CD3和抗CD28抗体是
Figure BDA0003553163510000045
Human T-Activator CD3/CD28，并且采用实施例1的培养方式在第0天和第3天加入表2所示的各细胞培养基，共培养6天；Dynabeads 3/3表示细胞培养基中包含的抗CD3和抗CD28抗体是
Figure BDA0003553163510000046
Human T-Activator CD3/CD28，并且采用对比实施例的培养方式在第0天加入表2所示的各细胞培养基，在第3天分离细胞，并加入不含抗CD3和抗CD28的新鲜培养基继续培养至第6天。
图5.流式细胞术检测细胞培养基中包含抗CD3和抗CD28可溶性抗体的G1组在第0天和第3天加入包含抗CD3和抗CD28可溶性抗体ImmunoCultTMHuman CD3/CD28 T CellActivator(表示为G1 Stemcell IC 6)以及细胞培养基中包含抗CD3和抗CD28免疫磁珠Dynabeads、IL-2和极化细胞因子的细胞培养基G5组(表示为G5 Dynabeads 6)分化和扩增为Th17细胞在第6天时的分化程度，即细胞表面抗原CXCR3+CCR6+Th17细胞。
具体实施方式
通过以下的实施例进一步阐释了本发明，其不应被解释为进一步限制。本申请全文中引用的所有附图和所有参考文献、专利和专利申请的内容以引用的方式明确地并入本文。
实施例1一种分化和扩增Th17细胞的方法
1、从人外周血中分离得到纯化的人初始CD4+T细胞
取健康人外周血，经Ficoll密度梯度处理后获得外周血单核细胞(PBMC)，利用磁珠分离技术从PBMC中分离得到纯化的人初始CD4+T细胞，即原代人CD4+CD45RA+T细胞。
2、分化和扩增Th17细胞
(1)细胞培养基的配制
按照表1和表2的配方，在基础培养基中添加不同浓度的细胞因子、抗体和/或FBS，以配制为用于分化、扩增为Th17细胞的不同的细胞培养基。其中，基础培养基包含RMPI(含有2mM谷氨酰胺、55μM BME、25mM HEPES、1mM丙酮酸钠和0.1mM非必需氨基酸)、Yssel’s TCell Medium(货号900-103，Gemini Bioproducts公司)和ImmunoCultTM T cell expansionmedium(货号10981，STEMCELL公司)。表1表示每组细胞培养基中抗CD3抗体和抗CD28抗体使用的是STEMCELL公司生产的ImmunoCultTMHuman CD3/CD28 T Cell Activator(货号10971)来活化步骤1制备得到的人初始CD4+T细胞；表2表示每组细胞培养基中抗CD3抗体和抗CD28抗体使用的是Gibco公司生产的“
Figure BDA0003553163510000051
Human T-Activator CD3/CD28”来活化步骤1制备得到的人初始CD4+T细胞。
表1
Figure BDA0003553163510000052
表2
Figure BDA0003553163510000053
(2)分化和扩增Th17细胞
根据表1和表2进行分组，分别用表1和表2配制的细胞培养基悬浮上述步骤1获得的人初始CD4+T细胞，混匀后，调整细胞密度至1×106/mL，并以每孔250mL体积加入到96孔板中，置于37℃、5％CO2湿度饱和的二氧化碳培养箱中培养。第3天，对细胞计数后，将细胞离心，去上清，分别加入表1和表2中配制的细胞培养基，置于37℃、5％CO2湿度饱和的二氧化碳培养箱中继续培养至第6天(该培养方式称为持续性活化、分化和扩增培养6天)。第6天，细胞计数，测细胞活率，检测结果如图1所示，G4组T细胞在含有抗CD3和抗CD28可溶性抗体(Stemcell 6所示的各组)的血清细胞培养基，其细胞活率和扩增能力(即活细胞数)都较差；同样，在无血清细胞培养基中，G6组无论是添加抗CD3和抗CD28可溶性抗体(Stemcell 6所示的各组)，还是添加抗CD3和抗CD28的免疫磁珠Dynabeads(Dynabeads 6所示的各组)，它们细胞的扩增能力(即活细胞数)较其他组均更低，表明基础细胞培养基Yssel’s T CellMedium不适宜用于Th17细胞增殖培养；而其他各组的细胞培养基(包括有血清和无血清培养基)中IL-6与TGF-b的浓度比维持在5-12，使其初始CD4+T细胞经过持续激活和诱导分化后呈现成团快速增殖，并在第6天细胞达到增殖高峰(表现为具有较好的扩增能力和/或细胞活率)。
此外，还设置了阴性对照组，方法如下：在基础培养基ImmunoCultTM T cellexpansion medium中添加终浓度为30U/mL的IL-2，并悬浮上述步骤1获得的人初始CD4+T细胞，混匀后，调整细胞密度至1×106/mL，并以每孔250mL体积加入到事先包被好了抗CD3抗体(OKT3抗体，5μg/mL)和抗CD28抗体(28.2抗体，2.5μg/mL)的96孔板中，置于37℃、5％CO2湿度饱和的二氧化碳培养箱中培养6天。
(3)检测分析
第7天，离心取上清液进行IL-17A分泌水平的检测，并对收获的细胞进行流式分析。
1)流式细胞术检测RORgt的细胞核内染色
具体方法如下：
将收获的细胞以50mL/孔含Trustain Fc block试剂的PBS在原96孔板中重悬，室温孵育15分钟；然后，加入100mL/孔含Zombie NIR荧光染料的PBS，室温孵育15分钟；用PBS洗涤两次；加入100mL/孔含表面抗原流式抗体的PBS重悬细胞，室温孵育15分钟；用PBS洗涤两次；加入固定缓冲液，于4℃孵育25分钟；用破膜缓冲液重悬细胞，室温孵育20分钟；离心去上清，加入50mL/孔含RORgt抗体的破膜缓冲液重悬细胞，室温孵育1小时；用破膜缓冲液洗涤细胞两次；最后用PBS重悬细胞后用流式细胞仪检测CD45RO和RORgt双阳性活细胞比例，以及RORgt的平均荧光强度(Median Fluorescence Intensity,MFI)。
其中CD45RO和RORgt双阳性活细胞检测结果如图2和表3所示，在包含抗CD3和抗CD28可溶性抗体(Stemcell IC 6所示的各组)的细胞培养基组中分化扩增得到的双阳性活细胞比例可高达60％以上，甚至可达到80％以上，显著高于包含抗CD3和抗CD28抗体免疫磁珠Dynabeads(Dynabeads 6所示的各组)的细胞培养基组；由于包含抗CD3和抗CD28可溶性抗体(Stemcell 6所示的各组)的细胞培养基中的IL-6与TGF-β的浓度比为2，使得G4组表达RORγt的活细胞数比例相对于同条件下其他组都更低，表明IL-6/TGF-β浓度比过低，不利于初始CD4+T细胞分化为Th17细胞。尽管G6组在分别包含抗CD3和抗CD28可溶性抗体(Stemcell IC 6所示各组)和抗CD3和抗CD28免疫磁珠Dynabeads(Dynabeads 6所示的各组)的细胞培养基中其活细胞数量少，但流式细胞术检测到其相对于在包含相同的抗CD3和CD28情况下的其他各组具有相当或更高的表达RORγt的细胞比例，表明尽管G6组的基础细胞培养基Yssel’s T Cell Medium不是利于Th17细胞增殖培养的最佳选择，但是并不影响初始CD4+T细胞分化为Th17细胞。
表3经持续性活化、分化和扩增培养6天后流式细胞术检测第6天的细胞表面抗原CD45RO和细胞核表达RORγt阳性活细胞的比例
Figure BDA0003553163510000061
流式细胞术检测RORgt表达量的结果如图3所示，尽管包含抗CD3和抗CD28免疫磁珠Dynabeads(Dynabeads 6所示的各组)的细胞培养基各组相较于包含抗CD3和抗CD28可溶性抗体(Stemcell IC 6所示的各组)的细胞培养基各组具有更好的细胞扩增能力，但是在RORgt表达量方面，前者显著低于后者。由于包含抗CD3和抗CD28可溶性抗体(Stemcell 6所示的各组)的细胞培养基中的IL-6与TGF-β的浓度比为2，使得G4组的RORγt表达量相对于同条件下其他组都更低，表明IL-6/TGF-β浓度比过低，不利于初始CD4+T细胞分化为Th17细胞。尽管G6组在分别包含抗CD3和抗CD28可溶性抗体(Stemcell IC 6所示各组)和抗CD3和抗CD28免疫磁珠Dynabeads(Dynabeads 6所示的各组)的细胞培养基中其活细胞数量少，但是流式细胞术检测到其相对于在包含相同的抗CD3和CD28情况下的G7组具有相当或更高的RORγt表达量，进一步验证了上述的尽管G6组的基础细胞培养基Yssel’s T Cell Medium不是利于Th17细胞增殖培养的最佳选择，但是并不影响初始CD4+T细胞分化为Th17细胞。
2)AlphaLISA法检测Th17细胞分泌IL-17A的水平
利用
Figure BDA0003553163510000071
人IL-17(IL-17,IL17A)检测试剂盒定量检测上述上清液中IL-17A的分泌水平。具体方法如下：
a.取5mL上清液于96孔板中；
b.在上述96孔板中加入20mL/孔检测混合液，所述混合液由AlphaLISA抗IL-17A受体磁珠(25mg/mL)和生物素标记的抗IL-17A抗体(2.5nM)组成，所述混合液中AlphaLISA抗IL-17A受体磁珠终浓度为10mg/mL，生物素标记的抗IL-17A抗体终浓度为1nM；将96孔板于室温下孵育60分钟；
c.加入25mL的2×链霉亲和素(Streptavidin，SA)-供体磁珠(80mg/mL)，所述SA-供体磁珠的终浓度为40mg/mL；并于室温下避光孵育30分钟；
d.置于酶标仪中读取发光信号值。
检测结果如图4所示，包含抗CD3和抗CD28可溶性抗体(Stemcell IC 6所示各组)的细胞培养基各组的IL-17A分泌量显著高于包含抗CD3和抗CD28免疫磁珠Dynabeads的细胞培养基各组(Dynabeads 6所示各组)，且G1组在同等条件下的抗CD3和抗CD28中都具有最高的IL-17A分泌量；当细胞培养基中IL-6/TGF-β浓度比＜5，影响初始人CD4+T细胞分化为Th17细胞，进而影响IL-17A的分泌量，如G4组；此外，鉴于AlphaLISA法检测是基于96孔板中各孔总细胞所分泌的IL-17A的量，同时由于G6组在分别包含抗CD3和抗CD28可溶性抗体(Stemcell IC 6所示各组)和抗CD3和抗CD28免疫磁珠Dynabeads(Dynabeads 6所示的各组)的无血清细胞培养基中其活细胞数量少，所以G6组与在同等条件下抗CD3和抗CD28中具有显著降低的IL-17A分泌量。
综上，尽管包含抗CD3和抗CD28免疫磁珠Dynabeads的细胞培养基各组(Dynabeads6所示各组)相较于包含抗CD3和抗CD28可溶性抗体的细胞培养基各组(Stemcell IC 6所示各组)具有更好的细胞扩增能力和/或细胞活率，但是在RORgt表达量和IL-17A分泌量方面，前者显著低于后者；并且在同等条件下，包含10-20％FBS细胞培养基组较无血清细胞培养基组(包含Stemcell IC 6所示各组和Dynabeads 6所示各组)具有更高的RORgt表达量和/或IL-17A分泌量；进一步，在包含IL-6与TGF-b浓度比维持在5-12和10-20％FBS的细胞培养基组(无论抗CD3和抗CD28形式)在第0天和第3天分别加入包含抗CD3和抗CD28以及各细胞因子(包含IL-2和极化细胞因子)细胞培养基使得初始CD4+T细胞分化、扩增为的Th17细胞均具有良好的增殖力、活率和RORgt表达活性以及IL-17A分泌能力；此外，对于在基础细胞培养基ImmunoCult中添加浓度比为5-12的IL-6与TGF-b、以及抗CD3和抗CD28可溶性抗体的无血清细胞培养基也能较好地促使初始CD4+T细胞分化扩增为具有足够数量的、同质性高且RORγt表达量以及IL-17A分泌量均较高的Th17细胞。
实施例2对Th17细胞分化程度的研究
为了进一步研究实施例1获得的Th17细胞的分化程度，选择细胞培养基中包含抗CD3和抗CD28可溶性抗体的G1组(具有较高比例的RORγt+细胞数和高表达量的RORγt)和包含抗CD3和抗CD28免疫磁珠Dynabeads的G5组(具有低比例的RORγt+细胞数和低表达量的RORγt)，采用如实施例1所述方法使用流式细胞术检测CXCR3+CCR6+Th17细胞的占比。
检测结果如图5所示，细胞培养基中包含抗CD3和抗CD28可溶性抗体的G1组在第0天和第3天加入包含抗CD3和抗CD28可溶性抗体、IL-2和极化细胞因子的细胞培养基培养至第6天时，RORgt+细胞中CXCR3+CCR6+Th17细胞比例约为58.9％(图5)；细胞培养基中包含抗CD3和抗CD28免疫磁珠Dynabeads的G5组在第0天和第3天加入包含抗CD3和抗CD28可溶性抗体、IL-2和极化细胞因子的细胞培养基培养至第6天时，RORgt+的细胞中CXCR3+CCR6+Th17细胞比例约为17.4％(图5)，表明采用实施例1所述方法分化、扩增得到的RORgt+Th17细胞具有CCR6+CXCR3+的终末分化效应表型，且CCR6+CXCR3+细胞比例与RORgt表达量呈正相关。进一步表明，采用实施例1所述方法获得的Th17细胞具有分化程度高且稳定的特性。
综上，人初始CD4+T细胞在包含10-20％FBS、抗CD3和抗CD28可溶性抗体、以及合理浓度范围的IL-2和各极化细胞因子且IL-6与TGF-β浓度比维持在5-12的细胞培养基中分化扩增得到的Th17细胞不仅具有良好的增殖活性、同质性高，而且呈现高度分化且稳定性高的特征。
对比实施例 选用不同培养方式对人初始CD4+T细胞分化、扩增为Th17细胞的影响
1、采用实施例1所述方法从人外周血中分离得到纯化的人初始CD4+T细胞
2、体外分化、扩增Th17细胞
(1)细胞培养基的配制
同实施例1。
(2)分化、扩增Th17细胞
根据表1和表2进行分组，分别用表1和表2配制的细胞培养基悬浮上述步骤1获得的人初始CD4+T细胞，混匀后，调整细胞密度至1×106/mL，并以每孔250mL体积加入到96孔板中，置于37℃、5％CO2湿度饱和的二氧化碳培养箱中，根据细胞分化扩增情况，在第3天对细胞计数后，将细胞离心，去上清，加入不含抗CD3和抗CD28的细胞培养基，置于37℃、5％CO2湿度饱和的二氧化碳培养箱中继续培养(即采用3天激活促分化，3天不激活维持培养方式，用3/3表示)。第6天，细胞计数，测细胞活率，检测结果如图1所示，Stemcell 3/3所示各组大多数的细胞密度不及Dynabeads 3/3所示各组，但是在细胞活率方面，Stemcell 3/3所示各组与Dynabeads 3/3所示各组相当；然而，Stemcell 3/3所示各组细胞密度和活率与Stemcell 6所示各组大部分相当，Dynabeads 3/3所示各组细胞密度和活率与Dynabeads 6所示各组也大部分相当。
(3)检测分析：
采用同实施例1所述方法检测上述步骤所得到的表达CD45RO以及RORgt阳性活细胞数、RORgt表达量以及IL-17A分泌量。
表达CD45RO+RORgt+活细胞数检测结果如图2和表4所示，在包含抗CD3和抗CD28可溶性抗体(Stemcell IC 3/3所示的各组)以及抗CD3和抗CD28免疫磁珠Dynabeads(Dynabeads 3/3所示的各组)的细胞培养基组中分化扩增得到的CD45RO+RORgt+活细胞比例显著低于Stemcell IC 6所示的各组和Dynabeads 6所示的各组。
表4采用3/3培养方式，在第6天流式细胞术检测细胞表面抗原CD45RO和细胞核表达RORγt阳性活细胞比例
Figure BDA0003553163510000081
流式细胞术检测RORgt表达量的结果如图3所示，在包含抗CD3和抗CD28可溶性抗体细胞培养基各组中，采用3/3培养方式分化扩增得到的细胞，其RORgt表达量显著低于采用第0天和第3天分别加入表1所示细胞培养基共培养6天所得到的细胞；在包含抗CD3和抗CD28免疫磁珠Dynabeads细胞培养基各组中，采用3/3培养方式分化扩增得到的细胞，其RORgt表达量与采用第0天和第3天分别加入表2所示细胞培养基共培养6天所得到的细胞的RORgt表达量相当。此外，尽管包含抗CD3和抗CD28免疫磁珠Dynabeads(Dynabeads 3/3所示的各组)的细胞培养基各组相较于包含抗CD3和抗CD28可溶性抗体(Stemcell IC 3/3所示的各组)的细胞培养基各组具有更好的细胞扩增能力，但是在RORgt表达量方面，也同样发现前者显著低于后者。
AlphaLISA法检测Th17细胞分泌IL-17A的水平，结果如图4所示，在包含抗CD3和抗CD28可溶性抗体细胞培养基各组中，采用3/3培养方式分化扩增得到的细胞，其IL-17A分泌量显著低于采用第0天和第3天分别加入表1所示细胞培养基共培养6天所得到细胞的IL-17A分泌量；然而，在包含抗CD3和抗CD28免疫磁珠Dynabeads细胞培养基各组中，采用3/3培养方式分化扩增得到的细胞，其IL-17A分泌量与采用第0天和第3天分别加入表2所示细胞培养基共培养6天所得到的细胞的IL-17A分泌量相当；此外，同样发现，包含抗CD3和抗CD28可溶性抗体(Stemcell IC 3/3所示各组)的细胞培养基各组的IL-17A分泌量显著高于包含抗CD3和抗CD28免疫磁珠Dynabeads的细胞培养基各组(Dynabeads 3/3所示各组)。
综上，在相同组分的培养基条件下，采用不同培养方式，使得将人初始CD4+T细胞活化、分化和扩增为Th17细胞在RORgt+活细胞数量、RORgt表达量以及IL-17A分泌量方面差异较大。由此可见，本发明所采用的在第0天和第3天分别加入包含激活促增殖的抗CD3和抗CD28以及IL-2以及促分化扩增的极化细胞因子(包含TGF-b、IL-6、IL-1b和IL-23)细胞培养基的培养方式，对于获得足够数量的、同质性高的以及细胞功能活性强、稳定的且具有终末分化效应表型的CCR6+Th17细胞具有意想不到的技术效果。
尽管本发明已通过一个或多个实施方式来描述，但是应当理解的是，本发明不限于这些实施方式，并且本发明说明书旨在涵盖落在所附权利要求的精神和宽范围内的所有替代、修改和变动。本发明所引用的所有参考文献均通过引用整体的方式并入本发明中。

Claims (13)

1.一种体外分化和扩增Th17细胞的方法，包括以下步骤：
(1)获取初始CD4+T细胞：所述的初始CD4+T细胞选自CD4+CD45RA+T细胞；
(2)将步骤(1)细胞在细胞培养基中活化、分化并扩增为Th17细胞；
(3)收获步骤(2)获得的Th17细胞并检测。
其中，所述步骤(2)中的细胞培养基包含基础细胞培养基和添加物，所述添加物包含极化细胞因子(polarizing cytokine)和IL-2，其中所述极化细胞因子包含TGF-β、IL-1β、IL-6、IL-21和IL-23的一种或多种，优选的所述极化细胞因子是TGF-β、IL-1β、IL-6和IL-23；所述IL-6与TGF-β的浓度比为5-12。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的添加物包含TGF-β在细胞培养基中的浓度为1-10ng/ml，优选2.5-10ng/ml，更优选的是2.5ng/ml；IL-6在细胞培养基中的浓度为10-50ng/ml，优选的是30ng/ml。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的添加物包含IL-1β在细胞培养基中的浓度为20ng/ml，IL-23在细胞培养基中的浓度为30ng/ml，IL-2在细胞培养基中的浓度为10-30U/ml。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，所述步骤(2)中的添加物还可以进一步包含抗CD3抗体和抗CD28抗体，所述抗CD3抗体和抗CD28抗体可以是可溶性的，也可以是免疫磁珠形式的。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的基础细胞培养基可以是无血清的细胞培养基，也可以是包含血清的细胞培养基，所述血清是10-20％胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)，所述无血清的细胞培养基选自以下一种或多种商用培养基：Yssel’sT Cell Medium，Immunocult T cell media,CTS OpTmizer T cell expansion SFM和AIMV Medium，优选Yssel’s T Cell Medium，Immunocult T cell media，更优选的是Immunocult T cell media。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的细胞在所述细胞培养基中至少培养3天，优选6天，更优选地，将步骤(1)细胞在所述细胞培养基中培养3天后分离细胞并重新加入新鲜的所述细胞培养基继续培养至第6天。
7.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的添加物还可以包含抗IFN-γ抗体和抗IL-4抗体。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的初始CD4+T细胞来源包括但不限于人外周血、脐带血、免疫器官(例如脾脏或***)内的血细胞和血前体细胞，所述初始CD4+T细胞包括表达CD4表面抗原的未分化的T细胞，包括但不限于人外周血、脐带血，以及其他事先操作过的CD4+T细胞。可先从骨髓，脐带血等来源取得的造血干细胞、淋巴母细胞等T细胞前体，并诱导分化至CD4+T细胞，所述初始CD4+T细胞可利用磁珠分离技术从所述来源中的单核细胞群中分离纯化得到，还可以是商业化已分离纯化的原代人CD4+CD45RA+T细胞。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的检测包括Th17细胞的表面标志物或细胞表面抗原、转录细胞因子和分泌的细胞因子，所述的表面标志物或细胞表面抗原包括CD39,CD121a，CD161,CCR4,CCR6,CXCR3,IL-21R,和IL-23R，优选CCR6和CXCR3；所述转录因子包括RORγt或RORα；所述分泌的细胞因子包括IL-17A,IL-17AF,IL-17F,IL-21,和IL-22，优选IL-17A。
10.一种在体外选择性分化和扩增Th17细胞的组合物，所述组合物包含极化细胞因子和IL-2，其中所述极化细胞因子包含TGF-β、IL-1β、IL-6、IL-21和IL-23的一种或多种，优选的所述极化细胞因子是TGF-β、IL-1β、IL-6和IL-23，所述组合物还可以进一步包含抗CD3抗体和抗CD28抗体和/或抗IFN-γ、抗IL-4抗体。
11.一种使用权利要求9所述组合物产生Th17细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)获取初始CD4+T细胞：所述的初始CD4+T细胞是CD4+CD45RA+T细胞；
(2)将所述组合物加入到基础细胞培养基中配制为本发明的细胞培养基，将步骤(1)细胞在所述的细胞培养基中活化、分化并扩增为Th17细胞，所述组合物中的TGF-β在细胞培养基中的浓度为1-10ng/ml，优选2.5-10ng/ml，更优选的是2.5ng/ml；IL-6在细胞培养基中的浓度为10-50ng/ml，优选30ng/ml；所述IL-6与TGF-β的浓度比为5-12；所述组合物进一步包含IL-1β在细胞培养基中的浓度为20ng/ml，IL-23在细胞培养基中的浓度为30ng/ml，IL-2在细胞培养基中的浓度为10-30U/ml；所述的基础细胞培养基可以是无血清的细胞培养基，也可以是包含10-20％FBS的细胞培养基；
(3)收获步骤(2)获得的Th17细胞并检测Th17细胞的表面标志物或细胞表面抗原、转录因子和分泌的细胞因子。
12.一种通过权利要求1所述方法和/或权利要求11所述方法得到的Th17细胞在研究免疫学机制和/或检测与Th17细胞失调相关疾病或病症治疗药物的生物学功能中的用途。
13.如权利要求12所述用途，其特征在于，所述与Th17细胞失调相关疾病或病症包括但不限于自身免疫疾病以及其他特应性和慢性炎症性疾病，所述自身免疫疾病包括多发性硬化症、类风湿性关节炎、炎症性肠病、银屑病和牛皮癣。
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