CN114716427B - 一种作为rip抑制剂的化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

一种作为rip抑制剂的化合物及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种作为RIP抑制剂的化合物及其制备方法和用途，属于化学医药领域。该化合物是式(I)所示的化合物、或其盐、或其立体异构体、或其溶剂合物、或其前药。本发明化合物对人源RIP1激酶有良好的抑制活性，效果优于现有技术化合物，可用于制备RIP1抑制剂；同时，本发明化合物对TNF诱导胰腺癌细胞、结肠癌细胞、淋巴癌细胞和永生角质细胞程序性坏死的抑制效果显著优于现有化合物，所述本发明化合物可以有效抑制细胞程序性坏死。进而本发明化合物可以用于制备治疗各种炎症、银屑病及肿瘤等与RIP1以及细胞程序性坏死相关的疾病的药物，具有广阔的应用前景。

Description

一种作为RIP抑制剂的化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于化学医药领域，具体涉及一种作为RIP抑制剂的化合物及其制备方法和用途。
背景技术
程序性坏死(programmed necrosis)，也称为坏死性凋亡(necrosis)，是一种新型的可调控的具有坏死性形态特征的细胞死亡方式。程序性坏死在胚胎发育和成年机体的动态平衡中发挥关键作用，同时广泛参与多种疾病的病理生理过程。受体相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1，RIP1)位于程序性坏死通路的关键位置，是一种处于上游起调节作用的激酶，作为信号通路的上游调控分子，其异常激活可引起一系列反应，RIP1已经成为死亡受体信号通路中决定细胞命运的“中央控制器”。
大量研究表明，通过激活RIP1和程序性坏死通路介导的细胞死亡和炎症反应涉及多种人类疾病，包括卒中、心肌梗死、视网膜损伤、致死性全身炎症反应综合征和慢性肠炎以及恶性肿瘤等。RIP1激酶作为程序性坏死通路中的潜在靶点，抑制其激酶活性可以抑制疾病的发展进程。RIP1抑制剂对治疗炎症、心脑血管疾病、神经退行性疾病和肿瘤等疾病具有重要的应用价值。因此RIP抑制剂，特别是RIP1抑制剂受到了药物化学研究者的极大关注。
Philip A.Harris等报道了一类具有如下代表性结构的RIP抑制剂，并且发现其具有治疗炎症或肿瘤的应用前景。但其治疗效果仍有待进一步提高，具有更好治疗效果的RIP抑制剂仍然是临床比较急需的。
发明内容
本发明的目的是提供一种作为RIP抑制剂的化合物及其制备方法和用途。
本发明提供了式(I)所示的化合物、或其盐、或其立体异构体、或其溶剂合物、或其前药：
其中，
R1选自氢、甲基、氘代甲基；
R2、R3分别独立选自氢、卤素；
X选自O、CH2；
R4选自S构型-CH3或R构型-CH3；
A环选自五元杂环。
进一步地，
A环选自
进一步地，所述化合物为式(II)所示：
其中，
R1选自氢、甲基、氘代甲基；
R2、R3分别独立选自氢、卤素；
R4选自S构型-CH3或R构型-CH3；
A环选自五元杂环；
优选地，
A环选自
进一步地，所述化合物为式(III)所示：
其中，
R1选自氢、甲基、氘代甲基；
R2、R3分别独立选自氢、卤素；
A环选自五元杂环；
优选地，
A环选自
进一步地，所述化合物为式(IV)所示：
其中，
R1选自氢、甲基、氘代甲基；
A环选自五元杂环；
优选地，
A环选自
进一步地，所述盐为甲磺酸盐、盐酸盐、硫酸盐、有机酸盐。
进一步地，所述化合物为如下化合物之一：
本发明还提供了前述的化合物、或其盐、或其立体异构体、或其溶剂合物、或其前药在制备RIP抑制剂中的用途；
优选地，所述RIP抑制剂为RIP1抑制剂；
更优选地，所述RIP抑制剂为抑制细胞程序性坏死的药物。
本发明还提供了前述的化合物、或其盐、或其立体异构体、或其溶剂合物、或其前药在制备治疗与细胞程序性坏死相关的疾病的药物中的用途；
优选地，所述药物为抗炎、预防和/或***、预防和/或治疗银屑病的药物；
更优选地，所述药物是预防和/或治疗胰腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、淋巴癌的药物；
和/或，所述药物是预防和/或治疗风湿性关节炎、溃疡性结肠炎的药物。
本发明还提供了一种药物，它是由前述的化合物、或其盐、或其立体异构体、或其溶剂合物、或其前药为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成。
本发明中，“氘代”指化合物或基团中的一个或多个氢被氘(D)所取代。如氘代甲基为-CH2D、-CHD2或-CD3。
本发明中，卤素为氟、氯、溴或碘。
本发明中，室温是25±5℃，过夜为12±2h。
本发明化合物对人源RIP1激酶有良好的抑制活性，效果优于现有技术化合物，可用于制备RIP1抑制剂；同时，本发明化合物对TNF诱导胰腺癌细胞、结肠癌细胞、淋巴癌细胞和永生角质细胞程序性坏死的抑制效果显著优于现有化合物，所述本发明化合物可以有效抑制细胞程序性坏死。进而本发明化合物可以用于制备治疗各种炎症、银屑病及肿瘤等与RIP1以及细胞程序性坏死相关的疾病的药物，具有广阔的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
A环中间体的合成
1、中间体A-1的合成
步骤1：20毫升乙醇降温至-5摄氏度，滴加10克乙酰氯(0.13mol)，滴完后再低温(0-5℃)反应半小时得到新鲜制备的乙醇盐酸气。低温(0-5℃)下滴加12.5克氰基甲酸乙酯(0.13mol)和30毫升二氯甲烷的混合溶液，0-5摄氏度搅拌反应过夜，过滤反应产生的固体即为亚胺中间体盐酸盐，将该盐酸盐悬浮在50毫升甲基叔丁基醚中，加三乙胺20克室温搅拌5小时，过滤除去三乙胺盐酸盐，减压浓缩甲基叔丁基醚得到12.3克中间体AM1-1。
步骤2：将9.6克步骤1制备的中间体AM1-1(66.1mmol)溶解在40毫升乙醇和120毫升甲基叔丁基醚混合溶液中，加10克苯乙酰肼(66.6mmol)，室温搅拌过夜，过滤，固体用乙醇洗涤两次，烘干得到8.7克中间AM1-2，用于下步反应。
步骤3：将5克中间体AM1-2(20.0mmol)悬浮于100毫升二甲苯中，170摄氏度回流反应24小时，冷却至室温，过滤得4.3克中间体AM1-3。
步骤4：将4克中间体AM1-3(17.3mmol)悬浮于40毫升水中，加入1.2克氢氧化锂(50.1mmol)，室温搅拌3小时，用2M稀盐酸调pH值至2，有固体析出，过滤，固体用水洗两次，烘干得3.3克中间体A-1。
2、中间体A-2的合成
步骤1：5克市售1，2，4-三氮唑-3-羧酸甲酯(39.3mmol)溶解在100毫升丙酮中，加入8.1克碳酸钾(58.6mmol)，6.7克溴化苄(39.1mmol)，室温搅拌过夜，TLC检测原料反应完全。加入100毫升水，用150毫升乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，有机层有饱和食盐水洗1次后，用50克无水硫酸钠干燥。过滤除去硫酸钠，减压浓缩至干，加50毫升石油醚结晶，得湿品6.6克。将6.6克湿品用30毫升乙酸乙酯石油醚混合溶液(EA:PE＝1:1)重结晶，过滤并烘干得中间体AM2-1共4.1克。
步骤2：取2克中间体AM2-1(9.2mmol)溶于20毫升甲醇，将0.7克氢氧化锂(29.2mmol)溶于20毫升水中，并加入甲醇体系中，室温搅拌5小时，TLC检测原料反应完全，用2M稀盐酸调节pH值至2-3，有固体析出，过滤，固体用水洗至中性，烘干得1.7克中间体A-2，
3、中间体A-10的合成
以1-H-咪唑-4-甲酸甲酯为原料，合成方法与中间体A-2类似，得到中间体A-10。
其余中间体A-3、A-4、A-5、A-6、A-7、A-8、A-9均为市售购得，其结构如下：
实施例1、化合物I-1的合成
合成路线如下：
i：NaH/DMF；ii：H2，Pd/C，MeOH；iii：TBTU，DIPEA，DMSO；iv：MeI，Cs2CO3，DMF；v：HCl，MTBE；vi：TBTU，DIPEA，DCM
具体操作如下：
1、中间体M1-1的合成：
将5克BOC-L-苏氨酸(cas:2592-18-9,22.8mmol)溶解于50毫升DMF中，冰盐浴降温至0摄氏度，将1.4克NaH(57.0mmol)混悬于10毫升DMF中并逐滴滴入，撤去冰盐浴，室温搅拌至气泡消失，滴入3.2克1-氟-2-硝基苯(22.7mmol)，室温搅拌4小时，加入冰水淬灭反应。向反应体系中加入2M稀盐酸至pH值2-3，分别用50毫升乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，有机层水洗干燥后减压浓缩，残余物经柱层析纯化得到6.1克黄色半固体，即为中间体M1-1(分子量340.13)。
2、中间体M2-1的合成：
将上述中间体M1-1用60毫升甲醇溶解后，以钯碳为催化剂，室温下催化氢化反应，反应完全后过滤除去钯碳，滤液减压浓缩，残余物用甲基叔丁基醚搅拌结晶，过烘干得到的固体溶解于25毫升DMSO中，加入5.7克TBTU(17.9mmol)以及2.3克DIPEA(17.9mmol)，室温搅拌过夜，加入25毫升冰水淬灭，分别用30毫升乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，有机层水洗干燥后减压浓缩，残余物经石油醚结晶，过滤干燥后得到4.7克白色固体，即为M2-1中间体(分子量292.14)。
3、中间体M3-1的合成：
将上述2.0克中间体M2-1(6.8mmol)溶解于50毫升DMF中，加入3.3克碳酸铯(10.2mmol)，1.4克碘甲烷(10.2mmol)，室温搅拌直至反应完全。加入50毫升冰水淬灭后，分别用80毫升乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，有机层水洗干燥后减压浓缩，石油醚结晶，过滤后得到固体。上述固体加入20毫升盐酸气饱和的甲基叔丁基醚，室温搅拌6小时后，减压浓缩溶剂，残余物用石油醚结晶得到1.7克淡黄色固体，即为中间体M3-1(分子量242.70)。
4、目标物I-1的合成：
将上述1.7克中间体M3-1(7.0mmol)、4.5克TBTU(14.0mmol)、1.36克DIPEA(10.5mmol)溶解于20毫升DCM中，加入1.7克A-1环(5-苄基-4H-1,2,4-***-3-羧酸，8.4mmol)，室温搅拌过夜，加入冰水淬灭反应后，有机层水洗干燥减压浓缩，残余物经柱层析分离得到1.5克化合物I-1。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：14.41(s,1H),7.90(s,1H),7.52-7.43(m,1H),7.38-7.21((m,8H),4.90-4.79(m,2H),4.16(s,2H),3.36(s,3H),1.28(d,J＝5.1Hz,3H).
ESI-MS m/z:390.11[M-1]-
实施例2：化合物I-2的合成：
合成路线如下：
iv：CD3I，Cs2CO3，DMF；v：HCl，MTBE；vi：TBTU，DIPEA，DCM
具体操作如下：
1、M3-2的合成
以M2-1为原料，合成方法类似实施例1中间体M3-1的制备方法，用氘代碘甲烷代替碘甲烷，得到中间体M3-2。
2、I-2的合成
同实施例1的I-1的制备方法，得到目标物I-2。
ESI-MS m/z:393.13[M-1]-
实施例3：化合物I-3的合成：
合成路线如下：
v：HCl，MTBE；vi：TBTU，DIPEA，DCM
具体操作如下：
以M2-1为原料，加入盐酸气饱和的甲基叔丁基醚，室温搅拌6小时后，减压浓缩溶剂，残余物用石油醚结晶得到中间体M3-3(分子量228.68)。
以上述中间体M3-3、中间体A-1为原料，合成方法类似于实施例1中步骤4，得到化合物I-3。
ESI-MS m/z:376.15[M-1]-
实施例4：化合物I-4的合成：
合成路线如下：
i：NaH/DMF；ii：H2，Pd/C，MeOH；iii：TBTU，DIPEA，DMSO；iv：MeI，Cs2CO3，DMF；v：HCl，MTBE；vi：TBTU，DIPEA，DCM
具体操作如下：
以BOC-D-苏氨酸为原料，合成方法类似实施例1，得到化合物I-4。
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ：8.22(d,J＝8.9Hz,1H),7.33-7.19((m,7H),7.17-7.07(m,1H),4.84-4.74(m,1H),4.70-4.58(m,1H),4.26-4.13(m,2H),2.83(s,3H),1.38(d,J＝6.2Hz,3H).
ESI-MS m/z:390.08[M-1]-
实施例5：化合物I-5的合成：
合成路线如下：
iv：CD3I，Cs2CO3，DMF；v：HCl，MTBE；vi：TBTU，DIPEA，DCM
具体操作如下：
以中间体M4-2位原料，合成方法类似实施例2，得到化合物I-5。
ESI-MS m/z:393.12[M-1]-
实施例6：化合物I-6的合成：
类似化合物I-1的方法，采用A-2环为原料，制备得到化合物I-6。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：8.85(s,1H),7.95(d,J＝5.8Hz,1H),7.50-7.43(m,1H),7.42-7.23(m,8H),5.55-5.40(m,2H),4.89-4.77(m,2H),3.35(s,3H),1.30-1.21(m,3H).
ESI-MS m/z:390.08[M-1]-
实施例7：化合物I-7的合成：
类似化合物I-2的方法，采用A-2环为原料，氘代碘甲烷为原料，制备得到化合物I-7。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.8(s,1H),8.00-7.91(m,1H),7.50-7.43(m,1H),7.43-7.22(m,8H),5.52-5.46(m,2H),4.89-4.80(m,2H),1.33-1.23(m,3H).
ESI-MS m/z:393.12[M-1]-
实施例8：化合物I-8的合成：
类似化合物I-3的方法，采用A-2环为原料，制备得到化合物I-8。
ESI-MS m/z:376.15[M-1]-
实施例9：化合物I-9的合成：
类似化合物I-1的方法，采用A-3环为原料，制备得到化合物I-9。
ESI-MS m/z:390.07[M-1]-
实施例10：化合物I-10的合成：
类似化合物I-1的方法，采用A-4环为原料，制备得到化合物I-10。
ESI-MS m/z:390.07[M-1]-
实施例11：化合物I-11的合成：
类似化合物I-1的方法，采用A-5环为原料，制备得到化合物I-11。
ESI-MS m/z:389.03[M-1]-
实施例12：化合物I-12的合成：
类似化合物I-1的方法，采用A-6环为原料，制备得到化合物I-12。
ESI-MS m/z:391.09[M-1]-
实施例13：化合物I-13的合成：
类似化合物I-1的方法，采用A-7环为原料，制备得到化合物I-13。
ESI-MS m/z:391.09[M-1]-
实施例14：化合物I-14的合成：
类似化合物I-1的方法，采用A-8环为原料，制备得到化合物I-14。
ESI-MS m/z:390.08[M-1]-
实施例15：化合物I-15的合成：
类似化合物I-1的方法，采用A-9环为原料，制备得到化合物I-15。
ESI-MS m/z:391.12[M-1]-
实施例16：化合物I-16的合成：
类似化合物I-1的方法，采用A-10环为原料，制备得到化合物I-16。
ESI-MS m/z:389.03[M-1]-
实施例17：化合物I-17的合成：
类似化合物I-2的方法，采用A-10环，以及氘代碘甲烷为原料，制备得到化合物I-17。
ESI-MS m/z:392.15[M-1]-
实施例18：化合物I-18的合成：
类似化合物I-3的方法，采用A-10环，制备得到化合物I-18。
ESI-MS m/z:375.11[M-1]-
实施例19：化合物I-19的合成：
类似化合物I-1的方法，采用2,4-二氟硝基苯为原料，制备得到化合物I-19。
ESI-MS m/z:408.12[M-1]-
实施例20：化合物I-20的合成：
类似化合物I-3的方法，采用2,4-二氟硝基苯为原料，制备得到化合物I-20。
ESI-MS m/z:394.06[M-1]-
实施例21：化合物I-21的合成：
类似化合物I-1的方法，采用2,6-二氟硝基苯为原料，制备得到化合物I-21。
ESI-MS m/z:408.12[M-1]-
实施例22：化合物I-22的合成：
/>
类似化合物I-3的方法，采用2,6-二氟硝基苯为原料，制备得到化合物I-22。
ESI-MS m/z:394.06[M-1]-
实施例23：化合物I-23的合成：
类似化合物I-2的方法，采用2,6-二氟硝基苯为原料，制备得到化合物I-23。
ESI-MS m/z:411.13[M-1]-
实施例24：化合物I-24的合成：
类似化合物I-1的方法，采用2,4,6-三氟硝基苯为原料，制备得到化合物I-24。
ESI-MS m/z:412.09[M-1]-
实施例25：化合物I-25的合成：
类似化合物I-8的方法，采用2,4,6-三氟硝基苯为原料，制备得到化合物I-25。
ESI-MS m/z:412.09[M-1]-
实施例26：化合物I-26的合成：
类似化合物I-8的方法，采用2,6-二氟硝基苯为原料，制备得到化合物I-26。
ESI-MS m/z:394.06[M-1]-
实施例27：化合物I-27的合成：
类似化合物I-11的方法，采用2,4,6-三氟硝基苯为原料，制备得到化合物I-27。
ESI-MS m/z:411.09[M-1]-
以下通过具体的试验例证明本发明的有益效果。
试验例1、本发明化合物对RIP1激酶的抑制活性
在测定缓冲液(50mM Hepes pH 7.5、50mM NaCl，30mM MgCl2、1mM DTT，0.02％CHAPS，0.5mg/mL BSA)中溶解本发明化合物和对照化合物，并以22点滴定法按1：1.5的顺序稀释(高浓度2μM)并添加到384孔板上。将3.5μL每种浓度的抑制剂和3.5μL溶解于测定缓冲液中的人源RIP酶(25nM)添加到板上。37摄氏度预温1小时后，将3.5μL ATP(15μM至1.5mM)的缓冲液添加到平板中以启动反应。在室温下反应进行5小时。反应完成后，将5μL含有0.02％CHAPS的ADP-Glo试剂添加到每个孔中，并在室温下孵育1小时，以终止了激酶反应，并耗尽所有剩余的ATP。然后将5μL含有0.02％CHAPS的ADP-Glo检测溶液添加到每个孔中，并在室温下孵育30分钟，测量发光度。对于每个ATP浓度，将发光数据扣除对照，表示为活性数据。
通过计算确定每个ATP浓度下的IC50，结果如下表1：
表1.本发明化合物对人源RIP1激酶的抑制活性IC50
化合物 IC50(nM)
I-1 10.19
I-2 8.68
I-4 8.97
I-6 7.36
I-7 8.18
I-16 14.40
对照化合物1 20.35
对照化合物2 18.29
对照化合物3 22.64
试验结果表明：本发明化合物对人源RIP1激酶抑制的IC50值显著低于现有化合物，说明本发明化合物可以用于制备RIP抑制剂，且效果优于现有化合物。
试验例2、本发明化合物对TNF-α诱导U937程序性坏死的抑制活性
收集对数生长期人组织细胞淋巴瘤细胞U937(购自ATCC)，用1640培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度60个/μl，得细胞悬浮液，接种384孔板，每孔板加20μL细胞悬浮液。细胞在37℃，5％CO2培养箱中孵育24小时后，用培养基将本发明待测化合物和对照化合物稀释至所设置的相应作用浓度，按5μl/孔加入384孔板中。化合物作用终浓度从0nM至1000nM，10倍梯度稀释。同时加入程序性坏死诱导剂，按5μl/孔加入384孔中，坏死诱导剂成分为TNF-α(100ng/ml)、Smac Mimetics(AT-406，1μM)、z-VAD-FMK(20μM)。加入待测化合物及坏死诱导剂后，细胞置于37℃，5％CO2培养箱中孵育24小时。然后每孔加入30μl CellTiter-Glo发光液，震荡2分钟，在室温下放置10min后用酶标仪检测吸光度。坏死诱导率及坏死抑制率由以下公式计算得到：
坏死诱导率(％)＝100×(1-B/A)；A为无坏死诱导剂组，B为有坏死诱导剂组
A为无坏死诱导剂组，B为有坏死诱导剂组，X为有化合物及坏死诱导剂组。
通过GraphPad计算待测化合物对诱导程序性坏死的抑制IC50，结果如下表2(实验中每组平行样为3个)：
表2.本发明化合物对TNF-α诱导U937程序性坏死的抑制活性IC50
化合物 IC50(nM)
I-1 2.11
I-2 0.61
I-4 0.55
I-6 0.41
I-7 0.45
I-16 4.87
对照化合物1 7.81
对照化合物2 10.36
对照化合物3 6.92
试验结果表明：本发明化合物对TNF-α诱导人组织细胞淋巴瘤细胞程序性坏死的抑制IC50值显著低于现有化合物。说明本发明化合物能够有效抑制人组织细胞淋巴瘤细胞程序性坏死。
试验例3、本发明化合物对TNF-α诱导人结肠癌细胞HT-29和人胰腺癌细胞PANC-1程序性坏死的抑制活性
收集对数生长期人结肠癌细胞HT-29和人胰腺癌细胞PANC-1(购自ATCC)，用1640培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度20个/μl，得细胞悬浮液，接种384孔板，每孔板加20μL细胞悬浮液。细胞在37℃，5％CO2培养箱中孵育24小时后，用培养基将本发明待测化合物和对照化合物稀释至所设置的相应作用浓度，按5μl/孔加入384孔板中。化合物作用终浓度从0nM至1000nM，10倍梯度稀释。同时加入程序性坏死诱导剂，按5μl/孔加入384孔中，坏死诱导剂成分为TNF-α(100ng/ml)、Smac Mimetics(AT-406，1μM)、z-VAD-FMK(20μM)。加入待测化合物及坏死诱导剂后，细胞置于37℃，5％CO2培养箱中孵育24小时。然后每孔加入30μlCellTiter-Glo发光液，震荡2分钟，在室温下放置10min后用酶标仪检测吸光度。坏死诱导率及坏死抑制率由以下公式计算得到：
坏死诱导率(％)＝100×(1-B/A)；A为无坏死诱导剂组，B为有坏死诱导剂组
A为无坏死诱导剂组，B为有坏死诱导剂组，X为有化合物及坏死诱导剂组。
通过GraphPad计算待测化合物对诱导程序性坏死的制活性IC50，结果如下表3(实验中每组平行样为3个)：
表3.本发明化合物对TNF-α诱导程序性坏死的抑制活性
化合物 HT-29IC50(nM) PANC-1IC50(nM)
I-1 44.56 6.01
I-2 37.46 4.77
I-4 43.19 4.98
I-6 23.37 3.07
I-7 24.99 3.32
I-16 89.04 8.95
对照化合物1 >100 44.10
对照化合物2 >100 52.87
对照化合物3 >100 55.12
实验结果表明：本发明化合物对TNF诱导人结肠癌细胞HT-29和人胰腺癌细胞PANC-1程序性坏死的IC50值显著低于现有化合物。说明本发明化合物能够有效抑制人结肠癌细胞和人胰腺癌细胞程序性坏死。
试验例4、本发明化合物对TNF-α诱导HacaT细胞程序性坏死的抑制活性
收集对数生长期HacaT细胞(购自ATCC)，用1640培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度20个/μl，得细胞悬浮液，接种384孔板，每孔板加20μL细胞悬浮液。细胞在37℃，5％CO2培养箱中孵育24小时后，用培养基将本发明待测化合物和对照化合物稀释至所设置的相应作用浓度，按5μl/孔加入384孔板中。化合物作用终浓度从0nM至1000nM，10倍梯度稀释。同时加入程序性坏死诱导剂，按5μl/孔加入384孔中，坏死诱导剂成分为TNF-α(100ng/ml)、SmacMimetics(AT-406，1μM)、z-VAD-FMK(20μM)。加入待测化合物及坏死诱导剂后，细胞置于37℃，5％CO2培养箱中孵育24小时。然后每孔加入30μl CellTiter-Glo发光液，震荡2分钟，在室温下放置10min后用酶标仪检测吸光度。坏死诱导率及坏死抑制率由以下公式计算得到：
坏死诱导率(％)＝100×(1-B/A)；A为无坏死诱导剂组，B为有坏死诱导剂组
A为无坏死诱导剂组，B为有坏死诱导剂组，X为有化合物及坏死诱导剂组。
通过GraphPad计算待测化合物对诱导程序性坏死的抑制活性IC50，结果如下表4(实验中每组平行样为3个)：
表4.本发明化合物对TNF-α诱导HacaT细胞程序性坏死的抑制活性IC50
化合物 IC50(nM)
I-1 6.11
I-2 4.57
I-4 4.62
I-6 3.18
I-7 3.55
I-16 8.84
对照化合物1 10.4
对照化合物2 16.8
对照化合物3 9.9
试验结果表明：本发明化合物对TNF-α诱导HacaT细胞程序性坏死的抑制的IC50值显著低于现有化合物，说明本发明化合物能够有效抑制HacaT细胞程序性坏死，进而可以用于防治银屑病。
综上，本发明化合物对人源RIP1激酶有良好的抑制活性，效果优于现有技术化合物，可用于制备RIP1抑制剂；同时，本发明化合物对TNF诱导胰腺癌细胞、结肠癌细胞、淋巴癌细胞和永生角质细胞程序性坏死的抑制效果显著优于现有化合物，所述本发明化合物可以有效抑制细胞程序性坏死。进而本发明化合物可以用于制备治疗各种炎症、银屑病及肿瘤等与RIP1以及细胞程序性坏死相关的疾病的药物，具有广阔的应用前景。

Claims (12)

1.一种化合物、或其盐，其特征在于：所述化合物为式(II)所示：
其中，
R1选自甲基、氘代甲基；
R2、R3选自氢；
R4选自S构型-CH3或R构型-CH3；
A环选自
所述表示取代位点。
2.根据权利要求1所述的化合物、或其盐，其特征在于：所述化合物为式(III)所示：
其中，
R1选自甲基、氘代甲基；
R2、R3选自氢；
A环选自
所述表示取代位点。
3.根据权利要求2所述的化合物、或其盐，其特征在于：所述化合物为式(IV)所示：
其中，
R1选自甲基、氘代甲基；
A环选自
所述表示取代位点。
4.根据权利要求1～3任一项所述的化合物、或其盐，其特征在于：所述盐为甲磺酸盐、盐酸盐、硫酸盐、有机酸盐。
5.根据权利要求1～3任一项所述的化合物、或其盐，其特征在于：所述化合物为如下化合物之一：
6.权利要求1～5任一项所述的化合物、或其盐在制备RIP抑制剂中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述RIP抑制剂为RIP1抑制剂。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述RIP抑制剂为抑制细胞程序性坏死的药物。
9.权利要求1～5任一项所述的化合物、或其盐在制备治疗与细胞程序性坏死相关的疾病的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述药物为抗炎、预防和/或***、预防和/或治疗银屑病的药物。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述药物是预防和/或治疗胰腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、淋巴癌的药物；
和/或，所述药物是预防和/或治疗风湿性关节炎、溃疡性结肠炎的药物。
12.一种药物，其特征在于：它是由权利要求1～5任一项所述的化合物、或其盐为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成。
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CN109071504A (zh) * 2016-02-05 2018-12-21 戴纳立制药公司 受体相互作用蛋白激酶1的抑制剂

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