CN112941052B - 壳聚糖酶ouc-t613及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了壳聚糖酶突变体OUC‑T613,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码壳聚糖酶突变体OUC‑T613的基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述壳聚糖酶OUC‑T613在降解壳聚糖/制备壳寡糖中的应用。本发明的壳聚糖酶OUC‑T613,是通过DNA基因重组技术改造并筛选获得的,相比壳聚糖酶OUC‑CsnPa,催化活性提高了1.92倍,比酶活达到1576.36U/mg。酶解1h的转化率提高46%,相比野生型,达到完全转化的时间提前3h。是特异性制备部分paCOS的理想催化剂。利用本发明的壳聚糖酶OUC‑T613在催化活性和效率方面具有明显的优势。
Description
技术领域
本发明涉及一种经DNA重组得到的壳聚糖酶突变体OUC-T613,及其在降解壳聚糖/制备壳寡糖中的应用,属于功能酶技术和基因工程领域。
背景技术
壳聚糖是β-(1,4)糖苷键联结的N-乙酰基-D-葡萄糖胺(GlcNAc,A)和D-葡萄糖胺(GlcN,D)单元的聚合物,它们是部分N-乙酰化的生物聚合物,可溶于酸性水性介质,被认为是功能最全,最有前途的功能性生物聚合物之一。壳聚糖的更生态,可持续和有效利用非常重要,而低成本且易于控制的酶水解是将大量生物质转化为寡聚降解产物的关键,寡聚降解产物的生物活性功能是壳聚糖的升华和延续,而壳聚糖具有特殊的结构和功能。部分乙酰壳寡糖(paCOS)被证明具有多种生物活性,例如改善食品质量,抗菌活性,抗肿瘤特性以及免疫调节作用,并且已经在食品,营养,制药,化妆品和农业等多种应用中得到应用,例如一种通过脱乙酰壳聚糖生产paCOS的有前途的工具是来自不同糖苷水解酶(GH)家族的壳聚糖酶(E.C.3.2.1.132),其不仅可以在温和的条件下进行,而且可能产生大量的低聚物,同时对不同的乙酰底物有着不同的偏好性。因此,对paCOS的利用与壳聚糖酶的可利用数量有关。考虑到环境,经济和工业生产的需求,迫切需要一种用于有效地水解壳聚糖的更理想壳聚糖酶突变体,其具有出色的催化效率。基于现有壳聚糖酶的蛋白质工程策略为获得具有优异性能的候选基因提供了很好的选择。
蛋白质催化剂的定向进化,DNA改组,在表型改良方面取得了重大突破,模仿了同源重组的自然过程。通过结合多亲本的全部优势,它是有效而可靠地产生所需候选人的强大工具。此外,DNA改组提供了文库的序列多样化,并偶发地在不同点诱导突变,从而导致复杂的表型。此外,作为一种很有前途的技术,DNA改组与传统方法相比,具有更快的传播有益突变的速率,被广泛用于快速增加DNA文库的大小。DNA改组被证明在多种应用中非常有效。革兰氏阴性菌作为宿主的全细胞催化显示出筛选重组蛋白文库的巨大潜力,这使得筛选改良的突变体是可行的。因此,可以采用上述策略来增强壳聚糖酶的催化活性和酶促性质。
发明内容
针对上述现有技术,本发明通过DNA基因重组技术筛选,得到了一种壳聚糖酶突变体,其具有高催化活性,用该突变体催化制备paCOS,可弥补现有酶活力低,表达水平不高的不足。
本发明是通过以下技术方案实现的:
壳聚糖酶突变体OUC-T613,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1:
MMLSGLSGPSPAKAFAEENGTTVQETVDLNEGDNSNEASTESLSLTNEEATSQAAVTATDHDANFSPSTLQFLKANTGLDGEQWDNIMKLVNKPEQDSLKWTEFYGYAEDIGDNRGYTIGIFGATTGGSNDTGPDGPDLFKAFDAASGASSPSIAGGLTRAGLKGKMSGSILKLSDSDSVIKKKIKALQNNEAWREAMWRTFYDTYIKYSVQQAQKRGFNTALTIGSFVDTALNQGATGDSGSLEGILSRSGSSTNEKTFMTNFYAKRTLIVDTNDYNQPPNGKNRVKQWSSLLASGETDLKNADAAVIKVTNWEMK。
一种编码上述壳聚糖酶突变体OUC-T613的基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2:
5’-ATGATGCTGAGTGGCCTGAGTGGTCCGAGTCCGGCCAAAGCATTTGCCGAAGAAAATGGTACAACCGTTCAGGAAACCGTTGATCTGAATGAAGGCGATAATAGCAATGAAGCAAGCACCGAAAGCCTGAGTCTGACCAATGAAGAAGCAACCAGTCAGGCCGCAGTGACCGCCACCGATCATGATGCAAATTTTAGCCCGAGCACCCTGCAGTTTCTGAAAGCCAATACCGGCCTGGATGGTGAACAGTGGGATAATATTATGAAACTGGTTAATAAGCCGGAACAGGATAGCCTGAAATGGACCGAATTTTATGGTTATGCCGAAGATATTGGTGACAATCGCGGTTATACCATTGGCATTTTTGGCGCCACCACCGGCGGTAGTAATGATACCGGCCCGGATGGCCCGGATCTGTTTAAAGCATTTGATGCCGCAAGTGGCGCCAGCAGTCCGAGTATTGCAGGTGGTCTGACCCGTGCCGGTCTGAAAGGTAAAATGAGCGGTAGCATTCTGAAACTGAGCGATAGCGATAGCGTGATTAAGAAAAAGATTAAGGCACTGCAGAATAATGAAGCCTGGCGTGAAGCCATGTGGCGCACCTTTTATGATACCTATATTAAGTATAGCGTGCAGCAGGCCCAGAAACGTGGCTTTAATACCGCACTGACCATTGGTAGTTTTGTTGATACCGCACTGAATCAGGGCGCCACCGGTGACAGCGGTAGCCTGGAAGGTATTCTGAGTCGTAGTGGCAGCAGTACCAATGAAAAAACCTTTATGACCAATTTCTACGCCAAACGTACCCTGATTGTGGATACCAATGATTATAATCAGCCGCCGAATGGCAAAAATCGCGTTAAACAGTGGAGTAGTCTGCTGGCCAGCGGTGAAACCGATCTCAAAAATGCAGATGCAGCCGTGATTAAGGTTACCAATTGGGAAATGAAA-3’。
所述壳聚糖酶OUC-T613在降解壳聚糖/制备壳寡糖中的应用;在制备降解壳聚糖/制备壳寡糖的酶制剂中的应用。
进一步地,在降解壳聚糖时,生成乙酰基壳寡糖。
一种酶制剂,包含有上述的壳聚糖酶OUC-T613。该酶制剂在降解壳聚糖/制备壳寡糖中的应用。
一种降解壳聚糖/制备壳寡糖的方法,采用上述壳聚糖酶OUC-T613降解壳聚糖。
一种重组工程菌,其基因组中***有上述编码壳聚糖酶OUC-T613的基因,其能表达壳聚糖酶OUC-T613。该工程菌在制备壳聚糖酶OUC-T613中的应用。
本发明的壳聚糖酶OUC-T613,是通过DNA基因重组技术改造并筛选获得的新型壳聚糖酶。本发明的壳聚糖酶OUC-T613,相比壳聚糖酶OUC-CsnPa,催化活性提高了1.92倍,比酶活达到1576.36U/mg。酶解1h的转化率提高46%,相比野生型,达到完全转化的时间提前3h。是特异性制备部分paCOS的理想催化剂。利用本发明的壳聚糖酶OUC-T613在催化活性和效率方面具有明显的优势。
本发明所引述的所有文献,它们的全部内容通过引用并入本文,并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时,以本发明的表述为准。此外,本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1:本发明中壳聚糖酶DNA重组过程琼脂糖凝胶电泳图。
图2:筛选到的重组酶高密度发酵酶活测定图。
图3:高活性壳聚糖酶突变体OUC-T613和亲本的性质比较图。
图4:高活性壳聚糖酶突变体OUC-T613催化水解转化率图。
图5:高活性壳聚糖酶突变体OUC-T613和野生型壳聚糖酶OUC-CsnPa结构对其图。
图6:高活性壳聚糖酶突变体OUC-T613和野生型壳聚糖酶OUC-CsnPa结构对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而,本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解,在不背离本发明的精神和范围的前提下,可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等,若无特别说明,均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等,可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法,检测方法等,若无特别说明,均为现有技术中已有的常规实验方法,检测方法等。
实施例1重组壳聚糖酶的制备
(1)壳聚糖酶亲本的扩增
首先通过PCR方法扩增申请人已获得的三种壳聚糖酶蛋白,分别为Paenibacillussp.1-18(OUC-CsnPa)、Paenibacillus tyrfis(OUC-CsnPT)和Chromobacterium sp.ATCC53434(OUC-CsnCA),大小约为1000bp左右,其中OUC-CsnPa的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示,编码基因的序列如SEQ ID NO.4所示;OUC-CsnPT的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示,编码基因的序列如SEQ ID NO.6所示;OUC-CsnCA的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示,编码基因的序列如SEQ ID NO.8所示。然后将PCR产物回收,用微量核酸测定仪测定亲本三个片段的浓度。将三个亲本片段在优化的消化体系下用消化酶DNsae I进行消化,切成100-200bp左右的片段,将酶切产物于琼脂糖凝胶电泳检测并回收(图1)。
其中,OUC-CsnPa的详细情况记载在申请人同日申请的另一项发明专利申请中,壳聚糖酶OUC-CsnPa,在50℃和pH=7条件下其比酶活达539.95U/mg。可作用乙酰度较高的壳聚糖底物,壳聚糖酶OUC-CsnPa酶解产物为壳单糖(DP1)到壳三糖(DP3)。该酶作用高乙酰度壳聚糖底物(DDA 95%、90%、85%、75%)时,可产生更多的乙酰产物,尤其是作用75%脱乙酰度的壳聚糖,有部分甲壳二糖的产生,对乙酰基的A单元展现了相比于一般壳聚糖酶更优的偏好性。
SEQ ID NO.3:
MILLSFTVIA SFSSLSGPSP AKAFAEENGT TVQETVDLNE GDNSNEASTE SLSLTNEEATSQAAVTATDH DANFSPSTLQ FLKANTGLDG EQWDNIMKLV NKPEQDSLKW TEFYGYAEDI GDNRGYTIGIFGATTGGSND TGPDGPDLFK AFDAASGASS PSIAGGLTRA GLKGKMSGSI LKLSDSDSVI KKKIKALQNNEAWREAMWRT FYDTYIKYSV QQAQKRGFNT ALTIGSFVDT ALNQGATGDS GSLEGILSRS GSSTNEKTFMTNFYAKRTLI VDTNDYNQPP NGKNRVKQWS SLLASGETDL KNADAAVIKV TNWEMK。
SEQ ID NO.4:
5’-ATGATCCTGCTGAGCTTTACCGTTATTGCAAGTTTTAGTAGCCTGAGTGGTCCGAGTCCGGCCAAAGCATTTGCCGAAGAAAATGGTACAACCGTTCAGGAAACCGTTGATCTGAATGAAGGCGATAATAGCAATGAAGCAAGCACCGAAAGCCTGAGTCTGACCAATGAAGAAGCAACCAGTCAGGCCGCAGTGACCGCCACCGATCATGATGCAAATTTTAGCCCGAGCACCCTGCAGTTTCTGAAAGCCAATACCGGCCTGGATGGTGAACAGTGGGATAATATTATGAAACTGGTTAATAAGCCGGAACAGGATAGCCTGAAATGGACCGAATTTTATGGTTATGCCGAAGATATTGGTGACAATCGCGGTTATACCATTGGCATTTTTGGCGCCACCACCGGCGGTAGTAATGATACCGGCCCGGATGGCCCGGATCTGTTTAAAGCATTTGATGCCGCAAGTGGCGCCAGCAGTCCGAGTATTGCAGGTGGTCTGACCCGTGCCGGTCTGAAAGGTAAAATGAGCGGTAGCATTCTGAAACTGAGCGATAGCGATAGCGTGATTAAGAAAAAGATTAAGGCACTGCAGAATAATGAAGCCTGGCGTGAAGCCATGTGGCGCACCTTTTATGATACCTATATTAAGTATAGCGTGCAGCAGGCCCAGAAACGTGGCTTTAATACCGCACTGACCATTGGTAGTTTTGTTGATACCGCACTGAATCAGGGCGCCACCGGTGACAGCGGTAGCCTGGAAGGTATTCTGAGTCGTAGTGGCAGCAGTACCAATGAAAAAACCTTTATGACCAATTTCTACGCCAAACGTACCCTGATTGTGGATACCAATGATTATAATCAGCCGCCGAATGGCAAAAATCGCGTTAAACAGTGGAGTAGTCTGCTGGCCAGCGGTGAAACCGATCTGAAAAATGCAGATGCAGCCGTGATTAAGGTTACCAATTGGGAAATGAAA-3’。
OUC-CsnPT记载在申请人之前的发明专利申请中,公开号为:CN 111471667 A。
SEQ ID NO.5:
MSNARPSKSQTKFLLAFLCFTLVASLFGATALFQPSKAAAASPDDNFSPETLQFLRNNTGLDGEQWNNIMKLINKPEQDDLNWIEYYGYCEDITDERGYTIGLFGATTGGSRDTHPDGPELFKAYDAAKGASNPSADGALKRLGINGKMNGSILEIKDSEKVFCGKIKKLQNDAAWRKAMWETFYNVYIRYSVEQARQRGFASAVTIGSFVDTALNQGATGGSNTLQGLLARSGSSSNEKTFMKNFHAKRTLVVDTNKYNKPPNGKNRVKQWDTLVDMGKMNLKNVDSEIAKVTDWEMK。
SEQ ID NO.6:
5’-ATGAGCAATGCCCGCCCGAGCAAAAGCCAGACCAAATTTCTGCTGGCCTTTCTGTGTTTTACCCTGGTGGCCAGCCTGTTTGGCGCAACCGCCCTGTTTCAGCCGAGTAAAGCAGCAGCAGCAAGCCCGGATGATAATTTTAGTCCGGAAACCCTGCAGTTTCTGCGTAATAATACCGGTCTGGATGGCGAACAGTGGAATAATATTATGAAACTGATCAACAAGCCGGAACAGGATGATCTGAATTGGATTGAATATTATGGCTATTGCGAAGATATCACCGATGAACGTGGCTATACCATTGGTCTGTTTGGTGCAACCACCGGCGGCAGCCGTGATACCCATCCGGATGGTCCGGAACTGTTTAAAGCATACGATGCAGCCAAAGGTGCCAGCAATCCGAGCGCCGATGGTGCCCTGAAACGCCTGGGTATTAATGGTAAAATGAATGGCAGCATTCTGGAAATTAAGGATAGCGAAAAAGTTTTCTGTGGCAAAATTAAGAAGCTGCAGAATGATGCAGCCTGGCGTAAAGCAATGTGGGAAACCTTTTATAATGTTTATATCCGCTACAGCGTTGAACAGGCACGCCAGCGCGGTTTTGCAAGCGCCGTGACCATTGGTAGTTTTGTTGATACCGCCCTGAATCAGGGCGCCACCGGTGGCAGTAATACCCTGCAGGGTCTGCTGGCCCGCAGCGGTAGCAGTAGTAATGAAAAAACCTTTATGAAGAACTTCCACGCCAAACGTACCCTGGTGGTTGATACCAATAAGTATAATAAGCCGCCGAATGGTAAAAATCGCGTTAAACAGTGGGATACCCTGGTTGATATGGGTAAAATGAACCTGAAAAATGTTGATAGTGAGATTGCAAAAGTGACCGATTGGGAAATGAAA-3’。
OUC-CsnCA记载在申请人之前的发明专利申请中,公开号为:CN 111500555 A。
SEQ ID NO.7:
MMLSGLGLLAGACNAQGSAAGSSARHAARAEACSAGPHCTVAAARTAANPDDNFSPATLKFLKANTGLDGEQWNNIMKLINKPEQDSLDWTKFYGYCEDIGDKRGYTIGIFGATTGGPNDEGPDGPTLFKEFDAASGAANPSIEGGLSRIGAHGKMQGSILKISDSSKVFCGKIGGLQANAAWRQAMWNTFYKVYIQYSVSQARQRGFNSALTIGSFVDTALNQGAAGDSGTLQGLLSRSGNSADEKTFMTTFYAQRSKIVDTNDYNQPPNGKNRVKQWSTLLNMGETDLKNADAAVAKVTDWEMK。
SEQ ID NO.8:
5’-ATGATGCTGAGTGGCCTGGGTCTGCTGGCAGGCGCCTGCAATGCACAGGGTAGCGCAGCAGGTAGCAGCGCCCGTCATGCAGCCCGTGCCGAAGCATGCAGCGCAGGCCCTCATTGTACCGTTGCCGCCGCACGTACCGCAGCAAATCCGGATGATAATTTTAGCCCGGCCACCCTGAAATTTCTGAAAGCAAATACCGGCCTGGATGGCGAACAGTGGAATAATATTATGAAACTGATCAACAAGCCGGAACAGGATAGTCTGGATTGGACCAAATTTTATGGTTATTGTGAAGATATCGGCGATAAACGTGGCTATACCATTGGCATTTTTGGTGCCACCACCGGCGGCCCGAATGATGAAGGTCCGGATGGTCCGACCCTGTTTAAAGAATTTGATGCCGCCAGCGGCGCAGCAAATCCTAGCATTGAAGGCGGTCTGAGCCGTATTGGTGCCCACGGTAAAATGCAGGGCAGTATTCTGAAAATTAGCGATAGCAGTAAAGTGTTTTGCGGTAAAATTGGCGGTCTGCAGGCCAATGCAGCATGGCGTCAGGCCATGTGGAATACCTTTTATAAAGTGTATATCCAGTACAGCGTTAGCCAGGCACGTCAGCGTGGTTTTAATAGTGCCCTGACCATTGGCAGTTTTGTGGATACCGCCCTGAATCAGGGTGCCGCAGGCGATAGTGGCACCCTGCAGGGTCTGCTGAGCCGCAGCGGCAATAGCGCAGATGAAAAAACCTTTATGACCACCTTTTATGCACAGCGCAGCAAAATTGTTGATACCAATGATTATAACCAGCCGCCGAATGGCAAAAATCGTGTGAAACAGTGGAGCACCCTGCTGAATATGGGCGAAACCGATCTGAAAAATGCCGATGCCGCAGTTGCCAAAGTTACCGATTGGGAAATGAAA-3’。
(2)无引物PCR扩增壳聚糖酶片段
以回收得到的三个基因片段作为模板并互为引物,进行无引物PCR。由于OUC-CsnPa、OUC-CsnPT、OUC-CsnCA三个基因片段都是1000bp左右,反应结束后,将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测(图1),回收1000bp左右的片段。
(3)有引物PCR扩增磷脂酶D片段
以(2)中回收的片段为模板,分别以引物①OUC-CsnPa-F和OUC-CsnPT-R,②OUC-CsnPa-F和OUC-CsnCA-R,③OUC-CsnPa-F和OUC-CsnPa-R,④OUC-CsnPT-F和OUC-CsnPa-R,⑤OUC-CsnPT-F和OUC-CsnCA-R,⑥OUC-CsnPT-F和OUC-CsnPT-R⑦OUC-CsnCA-F和OUC-CsnPT-R,⑧OUC-CsnCA-F和OUC-CsnPa-R,⑨OUC-CsnCA-F和OUC-CsnCA-R 9对互组引物进行PCR扩增得到全长突变文库。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,并切胶回收1000bp左右目的产物(图1)。
9个重组片段与与pET28a进行无缝连接,构建重组质粒,连接产物首先转化至DH5α感受态细胞,用无菌水清洗平板长出的所有菌落,转入LB液体培养基中过夜培养后提取混合质粒。将提取的混合质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中,涂布到含Kana抗性的5052自诱导培养基筛选平板(在ZYM-5052培养基的基础上加入琼脂粉和pH 5.0左右的胶体壳聚糖底物)上进行表达,为下一步的筛选做准备。
实施例2高活性重组壳聚糖酶突变体的筛选
将实施例1中固体平板上通过透明圈比对,透明圈相比亲本更大的克隆子接种到5mL5052培养基试管中培养48h,经过离心和缓冲液清洗菌体后与胶体壳聚糖进行全细胞催化筛选高活性突变体。并进行测序筛选出相对于OUC-CsnPa突变的高活性阳性株。将筛选的高活性阳性株在高密度自诱导培养基ZYP-5052中放大发酵,经过超声破碎得到上清粗酶,以看壳聚糖酶的水解活力作为筛选标准,通过酶活性比较(图2),重组酶OUC-T613的酶活提高最高,提高了近104%,这说明经过DNA改组及筛选后成功获得了更高活性的壳聚糖酶突变体。经过纯化,得到单一条带的蛋白,测定比酶活为1576.36U/mg,比野生型提高1.92倍。
实施例3高活性壳聚糖酶突变体OUC-T613性质测定
亲本和突变体OUC-T613的热稳定性主要通过参数T50值进行评价。T50定义为50%的酶在10分钟内灭活的温度。详细地,纯化的酶(0.01mg/mL)在各种温度(30~70℃)下孵育10分钟,然后测量剩余的活性。确定T50值通过将移位的S型函数拟合到热失活曲线。从结果(图3)可以看出突变体融合了亲本OUC-CsnPT和OUC-CsnCA优异的热稳定性,相比于野生OUC-CsnPa的热稳定性都有所增强。
实施例4高活性壳聚糖酶突变体OUC-T613催化水解壳聚糖
为了验证本发明的高活性壳聚糖酶突变体OUC-T613与亲本酶酶解壳聚糖的能力,检测水解过程中壳聚糖的水解速率。首先,将5ml的2%(w/v)可溶性壳聚糖与纯化壳聚糖酶Pa和T613混合(最终为30u/mL)。然后,将混合物在恒温水浴振荡器中以200rpm的振荡速度在50℃下培养24h。在孵育10、30分钟以及1、2、4、8、12和24小时后,取200ul混合物。将样品煮沸10分钟以停止反应并冷却至室温。然后,将混合物的pH调至8.0,静置30min,使未经酶水解的壳聚糖充分沉淀。最后,混合物在12 000g下离心2min;收集沉淀并干燥至恒重,以分析水解速率。以2%壳聚糖与未经孵育的灭活壳聚糖酶混合液作为对照。根据式1计算壳聚糖水解速率。
式1:水解率(%)=(W0-W)*100/W0
W0为加入壳聚糖的平均干重,W为水解后调pH后析出的固体干重。
以水解时间为横坐标,水解率为纵坐标。由图4可以得到水解速率在10min-1h迅速增加,此后趋于稳定。在1h内突变株OUC-T613水解速率的急剧增加,1h时水解速率就达到了98.27%,此时野生壳聚糖酶OUC-CsnPa的水解率只有54.9%。OUC-T613在1h就相对达到100%的转化率,而OUC-CsnPa在2h时才达到90%的转化率,在4小时之后,水解率都几乎达到了100%。证明了突变株OUC-T613极大地提高了对壳聚糖的水解能力。
实施例5高活性壳聚糖酶突变体OUC-T613序列分析
对高活性壳聚糖酶突变体OUC-T613重组酶进行序列分析,发现OUC-T613相比野生型OUC-CsnPa的远离活性位点的C端部分发生了缺失和突变。但末端14个氨基酸发生了改变,影响了蛋白整个结构的变化。图5结构对齐显示在野生型末端氨基酸的形成的空间结构在氨基酸发生变化之后,结构也发生了变化,从一侧转到了另一侧。该酶通过远端14个氨基酸的突变,造成了结构的巨大变化,形成一种新型酶。
实施例6高活性壳聚糖酶突变体OUC-T613结构对比
对比高活性壳聚糖酶突变体OUC-T613重组酶和野生型OUC-CsnPa的结构(图6),发现远端残基对酶的功能活性有着巨大的影响。远端残基的变化诱导酶分子结构的变化,导致活性位点裂口的更加开放,从而改善催化活性。
实施例7利用重组壳聚糖酶制备酶制剂
利用实施例2制备的重组壳聚糖酶制备酶制剂:发酵破碎后的溶液纯化后,用缓冲液置换咪唑,冻干后保存酶粉。
给本领域技术人员提供上述实施例,以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案,而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 壳聚糖酶OUC-T613及其应用
<141> 2021-02-22
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 317
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Met Met Leu Ser Gly Leu Ser Gly Pro Ser Pro Ala Lys Ala Phe Ala
1 5 10 15
Glu Glu Asn Gly Thr Thr Val Gln Glu Thr Val Asp Leu Asn Glu Gly
20 25 30
Asp Asn Ser Asn Glu Ala Ser Thr Glu Ser Leu Ser Leu Thr Asn Glu
35 40 45
Glu Ala Thr Ser Gln Ala Ala Val Thr Ala Thr Asp His Asp Ala Asn
50 55 60
Phe Ser Pro Ser Thr Leu Gln Phe Leu Lys Ala Asn Thr Gly Leu Asp
65 70 75 80
Gly Glu Gln Trp Asp Asn Ile Met Lys Leu Val Asn Lys Pro Glu Gln
85 90 95
Asp Ser Leu Lys Trp Thr Glu Phe Tyr Gly Tyr Ala Glu Asp Ile Gly
100 105 110
Asp Asn Arg Gly Tyr Thr Ile Gly Ile Phe Gly Ala Thr Thr Gly Gly
115 120 125
Ser Asn Asp Thr Gly Pro Asp Gly Pro Asp Leu Phe Lys Ala Phe Asp
130 135 140
Ala Ala Ser Gly Ala Ser Ser Pro Ser Ile Ala Gly Gly Leu Thr Arg
145 150 155 160
Ala Gly Leu Lys Gly Lys Met Ser Gly Ser Ile Leu Lys Leu Ser Asp
165 170 175
Ser Asp Ser Val Ile Lys Lys Lys Ile Lys Ala Leu Gln Asn Asn Glu
180 185 190
Ala Trp Arg Glu Ala Met Trp Arg Thr Phe Tyr Asp Thr Tyr Ile Lys
195 200 205
Tyr Ser Val Gln Gln Ala Gln Lys Arg Gly Phe Asn Thr Ala Leu Thr
210 215 220
Ile Gly Ser Phe Val Asp Thr Ala Leu Asn Gln Gly Ala Thr Gly Asp
225 230 235 240
Ser Gly Ser Leu Glu Gly Ile Leu Ser Arg Ser Gly Ser Ser Thr Asn
245 250 255
Glu Lys Thr Phe Met Thr Asn Phe Tyr Ala Lys Arg Thr Leu Ile Val
260 265 270
Asp Thr Asn Asp Tyr Asn Gln Pro Pro Asn Gly Lys Asn Arg Val Lys
275 280 285
Gln Trp Ser Ser Leu Leu Ala Ser Gly Glu Thr Asp Leu Lys Asn Ala
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Asp Ala Ala Val Ile Lys Val Thr Asn Trp Glu Met Lys
305 310 315
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<211> 951
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atgatgctga gtggcctgag tggtccgagt ccggccaaag catttgccga agaaaatggt 60
acaaccgttc aggaaaccgt tgatctgaat gaaggcgata atagcaatga agcaagcacc 120
gaaagcctga gtctgaccaa tgaagaagca accagtcagg ccgcagtgac cgccaccgat 180
catgatgcaa attttagccc gagcaccctg cagtttctga aagccaatac cggcctggat 240
ggtgaacagt gggataatat tatgaaactg gttaataagc cggaacagga tagcctgaaa 300
tggaccgaat tttatggtta tgccgaagat attggtgaca atcgcggtta taccattggc 360
atttttggcg ccaccaccgg cggtagtaat gataccggcc cggatggccc ggatctgttt 420
aaagcatttg atgccgcaag tggcgccagc agtccgagta ttgcaggtgg tctgacccgt 480
gccggtctga aaggtaaaat gagcggtagc attctgaaac tgagcgatag cgatagcgtg 540
attaagaaaa agattaaggc actgcagaat aatgaagcct ggcgtgaagc catgtggcgc 600
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accgcactga ccattggtag ttttgttgat accgcactga atcagggcgc caccggtgac 720
agcggtagcc tggaaggtat tctgagtcgt agtggcagca gtaccaatga aaaaaccttt 780
atgaccaatt tctacgccaa acgtaccctg attgtggata ccaatgatta taatcagccg 840
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ctcaaaaatg cagatgcagc cgtgattaag gttaccaatt gggaaatgaa a 951
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
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1 5 10 15
Gly Pro Ser Pro Ala Lys Ala Phe Ala Glu Glu Asn Gly Thr Thr Val
20 25 30
Gln Glu Thr Val Asp Leu Asn Glu Gly Asp Asn Ser Asn Glu Ala Ser
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50 55 60
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65 70 75 80
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Pro Pro Asn Gly Lys Asn Arg Val Lys Gln Trp Ser Ser Leu Leu Ala
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Ser Gly Glu Thr Asp Leu Lys Asn Ala Asp Ala Ala Val Ile Lys Val
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325
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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accaattggg aaatgaaa 978
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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1 5 10 15
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Lys Gly Ala Ser Asn Pro Ser Ala Asp Gly Ala Leu Lys Arg Leu Gly
130 135 140
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Lys Val Phe Cys Gly Lys Ile Lys Lys Leu Gln Asn Asp Ala Ala Trp
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Arg Lys Ala Met Trp Glu Thr Phe Tyr Asn Val Tyr Ile Arg Tyr Ser
180 185 190
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195 200 205
Ser Phe Val Asp Thr Ala Leu Asn Gln Gly Ala Thr Gly Gly Ser Asn
210 215 220
Thr Leu Gln Gly Leu Leu Ala Arg Ser Gly Ser Ser Ser Asn Glu Lys
225 230 235 240
Thr Phe Met Lys Asn Phe His Ala Lys Arg Thr Leu Val Val Asp Thr
245 250 255
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260 265 270
Asp Thr Leu Val Asp Met Gly Lys Met Asn Leu Lys Asn Val Asp Ser
275 280 285
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290 295
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
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ctgaattgga ttgaatatta tggctattgc gaagatatca ccgatgaacg tggctatacc 300
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tttgcaagcg ccgtgaccat tggtagtttt gttgataccg ccctgaatca gggcgccacc 660
ggtggcagta ataccctgca gggtctgctg gcccgcagcg gtagcagtag taatgaaaaa 720
acctttatga agaacttcca cgccaaacgt accctggtgg ttgataccaa taagtataat 780
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35 40 45
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Leu Lys Ile Ser Asp Ser Ser Lys Val Phe Cys Gly Lys Ile Gly Gly
165 170 175
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accgattggg aaatgaaa 918
Claims (10)
1.壳聚糖酶OUC-T613,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述的壳聚糖酶OUC-T613的基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1所述的壳聚糖酶OUC-T613在降解壳聚糖/制备壳寡糖中的应用;在制备降解壳聚糖/制备壳寡糖的酶制剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于:在降解壳聚糖时,生成部分乙酰基壳寡糖。
5.一种酶制剂,其特征在于:包含有权利要求1所述的壳聚糖酶OUC-T613。
6.权利要求5所述的酶制剂在降解壳聚糖/制备壳寡糖中的应用。
7.一种降解壳聚糖/制备壳寡糖的方法,其特征在于:采用权利要求1所述的壳聚糖酶OUC-T613降解壳聚糖。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:在降解壳聚糖时,生成部分乙酰基壳寡糖。
9.一种重组工程菌,其特征在于:其基因组中***有权利要求2所述的编码壳聚糖酶OUC-T613的基因,其能表达权利要求1所述的壳聚糖酶OUC-T613。
10.权利要求9所述的重组工程菌在制备壳聚糖酶OUC-T613中的应用。
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