CN114685420B

CN114685420B - 一种具有抗肿瘤活性的化合物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN114685420B
Application number: CN202210322818.XA
Authority: CN
Inventors: 黎平; 颜健; 权帆
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2022-03-30
Filing date: 2022-03-30
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2042-03-30
Also published as: CN114685420A

Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的化合物及其制备方法与应用。该化合物的分子式为C₃₁H₄₄O₅，结构式如式(I)所示。本发明中的化合物以大叶藤黄的种子为原料，采用甲醇提取、石油醚萃取，然后将石油醚层萃取物经过硅胶柱梯度洗脱分离后，再经过凝胶柱进行洗脱分离，最后用高效制备液相色谱纯化得到。本发明中获得的化合物对多种肿瘤细胞均具有明显的抗肿瘤活性，如白血病细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞和结肠癌细胞等，因此，可以用于开发新的抗肿瘤药物。

Description

一种具有抗肿瘤活性的化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别涉及一种具有抗肿瘤活性的化合物及其制备方法与应用。

背景技术

恶性肿瘤，又称为癌症，恶性肿瘤细胞的特征是不受控制的生长、永生化、侵袭性和形成远处转移的能力。目前，癌症的主要治疗方法是放射疗法、化学疗法和手术治疗。放疗和化疗可以适当延长患者的生存时间，但它们的毒副作用往往很严重，可能伴随一系列的不良反应，影响患者术后的生活质量，而手术治疗带来的并发症有可能导致患者死亡。由于传统的细胞毒药物大多数具有非特异性且有严重的不良反应，同时也存在耐药性等问题，在临床治疗中受到很多局限。因此，与实际用于癌症治疗的传统化疗药物相比，那些具有抗肿瘤潜力且副作用更小的药物可能更具选择性，而天然产物中的有效活性成分在抗肿瘤中具有低毒高效及依赖性小的优点。因此，从天然产物中开发能够抑制肿瘤的药物已经成为国际抗肿瘤药物研究的热点。

大叶藤黄(Garcinia xanthochymus)是藤黄科(Clusiaceae)藤黄属植物，俗称假山竹、人面果。分布于喜马拉雅山东部，孟加拉东部经缅甸、泰国至中南半岛及安达曼岛也有分布，日本有引种栽培；我国云南南部和西南部至西部及广西西南部有零星分布，广东有引种栽培。大叶藤黄是一种热带树种，新鲜果实可直接食用，制作果酱、制醋、饮料和其他产品，也被用来制作水彩画和织物的黄色染料；种子含油量17.72％，可以作为工业用油。大叶藤黄是我国传统的傣药之一，广泛用于治疗腹泻、痢疾、恶心和呕吐，还用于驱虫和排除食物毒素。研究发现大叶藤黄的树皮、叶子、果实和种子中含有许多有益的植物化学成分，其果实营养丰富，含有碳水化合物、蛋白质和脂肪等初级代谢产物，以及维生素和矿物质，如钠、钾、钙、铁、磷、镁、硫胺、核黄素、烟酸、抗坏血酸和维生素B12。现代植物化学研究表明，大叶藤黄的化学成分为二苯甲酮、黄酮、三萜和多异戊烯基呫吨酮等化合物。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具有抗肿瘤活性的化合物。

本发明的另一目的在于提供所述具有抗肿瘤活性的化合物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述具有抗肿瘤活性的化合物的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种具有抗肿瘤活性的化合物，该化合物的分子式为C₃₁H₄₄O₅，命名为Garxanthochin B，其结构式如式(I)所示：

所述的具有抗肿瘤活性的化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将大叶藤黄的种子自然晾干后用粉碎机粉碎，得到大叶藤黄的种子粉末；然后用体积分数为70％的甲醇溶液在室温下浸泡提取，得到提取液；进一步将提取液旋转蒸发去除溶剂，得到浸膏；再将浸膏用水复溶后用石油醚萃取，旋转蒸发去除溶剂，得到石油醚层萃取物；

(2)将石油醚层萃取物依次通过硅胶柱层析和凝胶柱层析进行分离，然经高效制备液相色谱(HPLC)纯化，得到所述具有抗肿瘤活性的化合物。

步骤(1)中所述的室温为25±5℃。

步骤(1)中所述的粉碎的条件为：30000r/min粉碎2min左右。

步骤(1)中所述的大叶藤黄的种子粉末与甲醇溶液的固液比2～5:1，g/ml；优选为2:1， g/ml。

步骤(1)中所述的浸泡提取的次数优选为3次以上。

步骤(1)中所述的浸膏与石油醚的体积比为1:1。

步骤(1)中所述的水优选为去离子水。

步骤(1)中所述的旋转蒸发的条件为：真空度约90kPa，水浴温度40℃。

步骤(1)中所述的萃取的次数为3次以上；优选为3～5次。

步骤(2)中所述的硅胶柱层析的条件为：200～300目拌样硅胶，拌样硅胶与石油醚层萃取物(样品)的重量比为1:1；300～400目正相分离硅胶，正相分离硅胶与石油醚层萃取物(样品)的重量比为15:1。

所述的硅胶柱层析采用石油醚-丙酮的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱；所述的丙酮的体积百分数从0逐步增加到100％(即洗脱梯度为100:0～0:100石油醚-丙酮混合溶剂)，收集丙酮的体积百分数为1％的洗脱液。

步骤(2)中所述的凝胶柱为Sephadex LH-20凝胶柱。

步骤(2)中所述的凝胶柱层析采用二氯甲烷和甲醇按体积比为1:1的混合溶剂为洗脱剂进行等梯度洗脱。

步骤(2)中所述的高效制备液相色谱采用C18色谱柱，以体积比为95:5乙腈-水溶液为流动相进行纯化。

所述的具有抗肿瘤活性的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的肿瘤为白血病、肺癌、肝癌、乳腺癌和结肠癌中的至少一种。

所述的具有抗肿瘤活性的化合物在体外抑制肿瘤细胞生长和/或增殖中的应用。

所述的肿瘤细胞为白血病细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞和结肠癌细胞中的至少一种；优选为白血病细胞HL-60、肺癌细胞A549、肝癌细胞SMMC-7721、乳腺癌细胞MDA-MB-231或结肠癌细胞SW480。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明以大叶藤黄(Garcinia xanthochymus)种子为原料，依次采用甲醇提取、石油醚萃取，然后将石油醚层萃取物经过一次硅胶柱梯度洗脱分离后，再经过凝胶柱进行洗脱分离，最后用高效制备液相色谱纯化，可以简便、快速的提取分离出新化合物。

2、本发明中分离得到的化合物具有抗肿瘤活性，可用于指导大叶藤黄(Garciniaxanthochymus)种子的应用，也为研究与开发新的抗肿瘤药物提供了候选化合物，研究发现本发明中的化合物对多种肿瘤细胞均具有显著的抗肿瘤活性，包括白血病细胞(HL-60)、肺癌细胞(A549)、肝癌细胞(SMMC-7721)、乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、结肠癌细胞(SW480)。

附图说明

图1为分离纯化得到的化合物1结构的HMBC和¹H-¹H COSY的相关信号图。

图2为分离纯化得到的化合物1的HR-ESI-MS图谱。

图3为分离纯化得到的化合物1的¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)图谱。

图4为分离纯化得到的化合物1的¹³C-NMR(150MHz,CDCl₃)图谱。

图5为分离纯化得到的化合物1的HMQC图谱。

图6为分离纯化得到的化合物1的HMBC图谱。

图7为分离纯化得到的化合物1的¹H-¹H COSY图谱。

图8为分离纯化得到的化合物1的实验CD和计算ECD对比结果图。

图9为分离纯化得到的化合物1对五种人类肿瘤细胞生长的抑制率图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。本发明所述的室温为25±5℃，但不限于此。

实施例1化合物的分离纯化及鉴定

1、化合物的分离纯化

(1)将大叶藤黄的种子(采自云南省西双版纳勐仑镇)自然晾干，用粉碎机以30000r/min 的转速粉碎2min，用体积分数70％的甲醇溶液在室温下浸泡提取3次(固液比2:1，g/ml)，合并3次提取液，用旋转蒸发仪在真空度约90kPa、水浴温度为40℃条件下减压浓缩去除溶剂后得到浸膏。将浓缩后的70％甲醇溶液提取物用去离子水复溶制成水悬液，以等体积石油醚试剂(石油醚：水悬液＝1：1，v/v)萃取3～5次，合并萃取液，通过旋转蒸发仪(真空度约90kPa,水浴温度为40℃)浓缩去除溶剂，最终得到石油醚层萃取物(11g)。

(2)取石油醚层萃取物(10g)进行硅胶柱色谱分离，拌样硅胶(100～200目)与样品重量之比为1:1，正相分离硅胶(300～400目)与样品重量之比为15:1，采用干法装柱(2.5×100 cm)干法上样，以不用比例的石油醚-丙酮(100:0、100:1、100:2、100:4、100:6、100:8、100:10、100:12、100:20、100:30、100:40、100:60、100:80、0:100，v/v)进行梯度洗脱，通过薄层色谱分析，合并相似组分，得到18个组分SP-1～SP-18。

(3)将组分SP-3(1g，100:1石油醚-丙酮的洗脱液)经凝胶柱层析(Sephadex LH-20)，以二氯甲烷：甲醇，v/v＝1:1体系等梯度洗脱，通过薄层色谱分析，合并相似组分，得到8个组分(SP-3-1～SP-3-8)。组分SP-3-5(70mg)通过HPLC半制备柱进行色谱分离，HPLC吸收波长为262nm，采用C18色谱柱(Zorbax 300SB-C18 9.4mm×25cm,4μm)，以乙腈/水 (95：5，v/v)进行等梯度洗脱，得到化合物1(7.8mg)。

2、化合物的结构鉴定

化合物1：黄色油状物，易溶解于甲醇和氯仿，在254nm波长下有特征的紫外吸收。高分辨质谱(HR-ESI-MS)(图2)数据显示该化合物的准分子离子峰为m/z 497.3270[M+H]⁺(calculated C₃₁H₄₅O₅,m/z 497.3267[M+H]⁺)，结合¹H-NMR谱图(图3)，¹³C-NMR谱图(图4)，推断其分子式为C₃₁H₄₄O₅，不饱和度为10。¹H-NMR数据显示有8组甲基信号[δ_H 1.10(H-29), δ_H0.89(H-31),δ_H 1.45(H-26),δ_H 1.46(H-25),δ_H 1.06(H-20),δ_H 1.51(H-21),δ_H 1.61(H-19),δ_H 1.65(H-11)]，6组亚甲基信号[δ_H 1.86(H-16),δ_H 1.83(H-15),δ_H 2.61(H-12a),δ_H2.48(H-12b), δ_H 2.92(H-7a),δ_H 2.50(H-7b),δ_H 4.29(H-10a),δ_H 3.77(H-10b),δ_H 1.35(H-30)]，6组次甲基信号[δ_H 3.81(H-28),δ_H 4.80(H-13),δ_H 4.90(H-8),δ_H 4.95(H-17),δ_H5.36(H-23),δ_H 6.45(H-22)]。进一步分析化合物1的¹³C-NMR(表1)和HMQC谱图(图5)发现该化合物包含一组间苯三酚的典型信号[δ_C 187.03(C-1),δ_C 106.87(C-2),δ_C 171.40(C-3),δ_C 57.79(C-4),δ_C 196.54(C-5), δ_C 107.94(C-6)]。

HMBC图谱(图6)中，H-19(δ_H 1.61)与C-18(δ_C 131.83)、C-20(δ_C 17.82)、C-17(δ_C124.14) 相关，H-17(δ_H 4.95)与C-20(δ_C 17.82)、C-19(δ_C 25.85)、C-15(δ_C 39.97)相关，H-16(δ_H 1.86) 与C-17(δ_C 124.14)、C-18(δ_C 131.83)、C-15(δ_C 39.97)、C-14(δ_C 139.46)相关，H-17和H-16 具有COSY相关信号(图1)，证明结构中存在异戊烯基单元；H-15(δ_H1.83)与C-13(δ_C 117.39)、 C-17(δ_C 124.14)、C-14(δ_C 139.46)、C-16(δ_C 26.90)相关，H-12(δ_H 2.61和δ_H 2.48)与C-13(δ_C 117.39)、C-14(δ_C 139.46)相关，H-21(δ_H 1.51)与C-15(δ_C 39.97)、C-13(δ_C 117.39)、C-14(δ_C 139.46)相关，H-12与H-13具有COSY相关信号，证明结构中存在第二个异戊烯基单元，其中，H-17与C-15，H-16与C-15、C-14，H-15与C-17、C-16具有HMBC远程相关性，证明两个异戊烯基单元通过C-15连接。H-25(δ_H 1.46)和H-26(δ_H1.45)与含氧C-24(δ_C 81.54)以及H-23(δ_H 5.36)与C-25(δ_C 28.95)、C-24(δ_C 81.54)的HMBC相关，并且¹H-¹H COSY图谱(图 7)中，H-22(δ_H 6.45)和H-23(δ_H 5.36)有相关信号，推断该化合物中存在一个含氧戊烯单元。 HMBC图谱中，H-28(δ_H 3.81)与C-27(δ_C 207.62)、C-30(δ_C 26.92)相关，H-30(δ_H 1.35)与C-28 (δ_C 42.12)、C-29(δ_C 16.40)、C-27(δ_C 207.62)C-31(δ_C 12.00)相关，H-31(δ_H 0.89)与C-28(δ_C 42.12)、C-30(δ_C 26.92)相关，H-29和H-28有COSY相关信号，H-30和H-28有COSY相关信号，说明化合物1中存在一个2-甲基丁酰基单元。H-7(δ_H 2.92和δ_H 2.50)与C-4(δ_C 57.83)、 C-3(δ_C 171.41)、C-9(δ_C 138.53)、C-8(δ_C122.09)相关，H-10(δ_H 4.29和δ_H 3.77)与C-11(δ_C 22.32)、 C-9(δ_C 138.53)、C-8(δ_C122.09)相关，H-11(δ_H 1.65)与C-10(δ_C 61.79)、C-9(δ_C 138.53)、C-8(δ_C 122.09)相关，证明该片段为异戊烯基单元；此外，除去6个烯碳、2个羰基以及一个间苯三酚六元环所占有的饱和度，计算还剩余不饱和为1，提示该片段必须成环；H-7与C-4、C-3 远程相关，且亚甲基C-10化学位移值为δ_C 61.80，猜测C-10受到氧的屏蔽效应影响而向低场移动，证明化合物1存在一个七元环，该七元环通过C-4、C-3连于六元环上。

由于H-12与C-5、C-4、C-7的HMBC相关性，证明两个连接的异戊烯基单元连接在C-4； H-22与C-1、C-3，H-23与C-2的HMBC相关性，证明含氧戊烯单元连接在C-2；剩余的一个异丁基单元则连接在C-6。综上分析，可以确定化合物1的平面结构。经Scifinder数据库查阅，确定该化合物为新化合物，命名为Garxanthochin B。

化合物1的结构相对新颖，具有6元环和7元杂氧环组成的母核，核磁波谱数据见表1 和表2，其平面结构的C-4具有手性构型，通过比较CD谱图的实验实测图和ECD的计算模拟图来确定化合物1的绝对构型。化合物1的CD谱图与R型ECD的模拟曲线谱图，趋势基本相似(图8)，因此，化合物1的立体构型为4R型。

表1化合物1的¹H-NMR和¹³C-NMR数据归属

表2化合物1的¹H-NMR和¹³C-NMR数据归属

实施例2化合物的抗肿瘤活性测定

(1)细胞接种培养

本实验选用白血病(HL-60)、肺癌(A549)、肝癌(SMMC-7721)、乳腺癌(MCF-7) 和结肠癌(SW480)五种肿瘤细胞(五种肿瘤细胞均为常规肿瘤细胞，可通过常规途径获得，本实验所用的肿瘤细胞来自中国科学院昆明植物研究所天然药物活性筛选中心)。用含10％(v/v)胎牛血清(FBS)的培养液(DMEM或RMPI640)配成单个细胞悬液，将处于对数生长期的细胞按3000～15000个/孔的密度接种于96孔板，每孔体积100μL，细胞提前12～24 小时接种培养。

(2)MTS法测定肿瘤细胞毒性

细胞培养24小时后进行给药处理，化合物1用DMSO溶剂，以40μM终浓度处理细胞。每孔终体积200μL，每种处理设置三个复孔。在37℃下培养48小时后，贴壁细胞(A549、SMMC-7721、MCF-7、SW480)弃孔内培养液，每孔加20μL MTS溶液和100μL培养液(DMEM 或RMPI640)，而悬浮细胞HL-60弃掉100μL培养上清液，每孔加20μL MTS溶液；设3个空白对照(20μL MTS溶液和100μL培养液的混合液)，继续培养2～4小时使其反应充分进行，用酶标仪在492nm波长下测定光吸收值。以顺铂(DDP)为阳性对照。细胞抑制率的计算方法为：细胞抑制率(％)＝(1-实验组OD值/空白组OD值)×100％。结果如图9所示。

(3)MTS法测定体外肿瘤生长半抑制浓度

化合物用二甲基亚砜(DMSO)溶解，化合物以0.16、0.8、4、20、100μM的终浓度复筛，每孔终体积200μL，每种处理均设3个复孔。37摄氏度培养48小时后，贴壁细胞弃孔内培养液，每孔加MTS溶液20μL和培养液100μL；设3个空白复孔(MTS溶液20μL和培养液100μL的混合液)，继续孵育2～4小时，使反应充分进行后测定光吸收值。选择492nm 波长，多功能酶标仪(MULTISKAN FC)读取各孔光吸收值，记录结果，数据处理后以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(Reed and Muench法)计算化合物IC₅₀值。每次实验均设顺铂(DDP)为阳性对照，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(Reed and Muench法)计算化合物的IC₅₀值。

表3化合物1对人类肿瘤细胞的体外细胞毒性

化合物1对5种人类肿瘤细胞，包括白血病细胞(HL-60)、肺癌细胞(A549)、肝癌细胞(SMMC-7721)、乳腺癌细胞(MCF-7)和结肠癌细胞(SW480)均具有较强的细胞抑制活性。表明本发明发现化合物1能够抑制肿瘤细胞的生长，有可能发展成为具有抗肿瘤作用的药物，丰富了大叶藤黄(Garcinia xanthochymus)种子的研究。由此可知，本发明分离得到的化合物可以在抗肿瘤药物中进行应用，所述的肿瘤为白血病、肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种具有抗肿瘤活性的化合物，其特征在于：该化合物的分子式为C₃₁H₄₄O₅，结构式如式(I)所示：

2.权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将大叶藤黄的种子自然晾干后用粉碎机粉碎，得到大叶藤黄的种子粉末；然后用体积分数为70％的甲醇溶液在室温下浸泡提取，得到提取液；将提取液旋转蒸发去除溶剂，得到浸膏；再将浸膏用水复溶后用石油醚萃取，旋转蒸发去除溶剂，得到石油醚层萃取物；

(2)将石油醚层萃取物依次通过硅胶柱层析和凝胶柱层析进行分离，然经高效制备液相色谱纯化，得到所述具有抗肿瘤活性的化合物；

步骤(2)中所述的硅胶柱层析的条件为：200～300目拌样硅胶，拌样硅胶与石油醚层萃取物的重量比为1:1；300～400目正相分离硅胶，正相分离硅胶与石油醚层萃取物的重量比为15:1；

所述的硅胶柱层析采用石油醚-丙酮的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱；所述的丙酮的体积百分数从0逐步增加到100％，收集丙酮的体积百分数为1％的洗脱液；

步骤(2)中所述的凝胶柱为Sephadex LH-20凝胶柱；

步骤(2)中所述的凝胶柱层析采用二氯甲烷和甲醇按体积比为1:1的混合溶剂为洗脱剂进行等梯度洗脱；

3.根据权利要求2所述的具有抗肿瘤活性的化合物的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的室温为25±5℃；

步骤(1)中所述的大叶藤黄的种子粉末与甲醇溶液的固液比2～5:1，g/ml；

步骤(1)中所述的浸膏与石油醚的体积比为1:1；

步骤(1)中所述的粉碎的条件为：30000r/min粉碎2min；

步骤(1)中所述的旋转蒸发的条件为：真空度90kPa，水浴温度40℃；

步骤(1)中所述的浸泡提取的次数为3次以上；

步骤(1)中所述的萃取的次数为3次以上。

4.权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤为白血病、肺癌、肝癌、乳腺癌和结肠癌中的至少一种。

6.权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的化合物在体外非疾病诊断治疗目的的抑制肿瘤细胞生长和/或增殖中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤细胞为白血病细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞和结肠癌细胞中的至少一种。