CN112794832B

CN112794832B - 一个从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物nby-10及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN112794832B
Application number: CN202110131691.9A
Authority: CN
Inventors: 许菲斐; 刘雅琳; 龚曼; 吕江南; 梁韩晶; 冯庆梅; 池军
Original assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Current assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Priority date: 2021-01-30
Filing date: 2021-01-30
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2041-01-30
Also published as: CN112794832A

Abstract

本发明涉及从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY‑10及其制备方法与应用，可有效解决从牛蒡叶中制备抗炎活性的化合物，并实现化合物在制备抗炎药物中的应用问题，方法是，牛蒡叶用30%乙醇提取，浓缩，浓缩液正丁醇萃取，减压浓缩溶剂，进行硅胶柱层析，以二氯甲烷‑甲醇，减压回收溶剂，二次硅胶柱层析，以石油醚‑乙酸乙酯梯度洗脱，收集100:40洗脱液，减压回收溶剂，进行Sephadex LH‑20柱层析，甲醇洗脱，减压回收溶剂，在甲醇中重结晶，得从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY‑10。本发明原料丰富，其制备方法易操作，导向性强，分离速度快，效率高，产品纯度高，该化合物可有效用于制备抗炎的药物。

Description

一个从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-10及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及医药，特别是一个从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-10及其制备方法与应用。

背景技术

牛蒡叶为菊科植物牛蒡Arctium lappa的干燥基生叶，在全国分布广泛，有着悠久的食用及药用历史，现代研究表明，牛蒡叶营养丰富，富含菊糖、纤维素、胡萝卜素、蛋白质、钙、磷、铁等矿物质和多种维生素，有很强的保健功能。同时具有抗氧化、抗炎等作用，是药食两用滋补佳品。多部本草著作记载了牛蒡叶的食疗经验。如《卫生简易方》“人不治诸疮及金疮用牛蒡叶贴之。”牛蒡叶有望成为新的用于抑制炎症的新资源，从中获得用于抑制炎症的安全、有效的化合物，并用于制备抗炎的药物至今未见有公开报导。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一个从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-10及其制备方法与应用，可有效解决从具有悠久食疗历史牛蒡叶中制备抗炎活性的新化合物，并实现新化合物在制备抗炎药物中的应用问题。

本发明解决的技术方案是，一种从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-10，分子结构式为：

其制备方法是，包括以下步骤：

(1)牛蒡叶粉末20kg，用牛蒡叶粉末重量4-6倍、质量浓度30％乙醇提取1～3次，每次提取1～4h，合并提取液，浓缩至相当于生药0.1～3g/mL的浓缩液；

(2)浓缩液依次用正丁醇2～8L、2～8L、1～4L、0.5～2L萃取4次，合并正丁醇萃取液，减压浓缩溶剂，得组分Fr.A(55～90g)；组分Fr.A进行硅胶柱层析，内径4～8cm，高8～25cm，以体积比二氯甲烷︰甲醇＝100︰2溶液8～25L洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1(15～30g)；

(3)组分Fr.A-1进行二次硅胶柱层析，内径3～7cm，高12～30cm，以体积比石油醚-乙酸乙酯100:5、2～6L，100:10、2～6L，100:20、2～6L，100:40、4～15L洗脱，收集100:40洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1-3(2～6g)；

(4)组分Fr.A-1-3进行Sephadex LH-20柱层析，内径1～3cm，高80～150cm，用甲醇进行洗脱，洗脱体积1～15L，洗脱流速0.5～1mL/min，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1-3-3(700～2000mg)；

(5)组分Fr.A-1-3-3在甲醇中重结晶，得从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-10(350～1000mg，(3aR,5R,5aS,9aR,9bR)-3a,4,5,5a,6,7,9a,9b-octahydro-5-hydroxy-8-(hydroxymethyl)-5-methyl-1-methylenenaphtho[2,1-b]furan-2(1H)-one)。

本发明经鉴定，是一个从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的新化合物，原料丰富，其制备方法易操作，导向性强，分离速度快，效率高，产品纯度高，该化合物可有效用于制备抗炎的药物，开拓了牛蒡叶的新用途和药用价值，经济和社会效益巨大。

附图说明

图1为本发明化合物NBY-10的分子结构式；

图2为本发明化合物NBY-10的主要HMBC及H-H COSY相关图；

图3为本发明化合物NBY-10的NOESY相关图；

图4为本发明化合物NBY-10的¹H-NMR谱图；

图5为本发明化合物NBY-10的¹³C-NMR谱图；

图6为本发明化合物NBY-10的HSQC谱图；

图7为本发明化合物NBY-10的HMBC谱图；

图8为本发明化合物NBY-10的红外光谱图；

图9为本发明化合物NBY-10的紫外光谱图；

图10为本发明化合物NBY-10的质谱图；

图11为本发明化合物NBY-10的工艺流程图。

具体实施方式

以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。

实施例1

本发明一种从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-10的制备方法，包括以下步骤：

(1)牛蒡叶粉末20kg，用牛蒡叶粉末重量5倍、质量浓度30％乙醇提取2次，每次提取2.5h，合并提取液，浓缩至相当于生药0.5g/mL的浓缩液；

(2)浓缩液依次用正丁醇7L、7L、4L、2L萃取4次，合并正丁醇萃取液，减压浓缩溶剂，得组分Fr.A(60g)；组分Fr.A进行硅胶柱层析，内径4cm，高25cm，以体积比二氯甲烷︰甲醇＝100︰2溶液8L洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1(17g)；

(3)组分Fr.A-1进行二次硅胶柱层析，内径3.5cm，高27cm，以体积比石油醚-乙酸乙酯100:5、2L，100:10、2L，100:20、3L，100:40、5L洗脱，收集100:40洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1-3(3g)；

(4)组分Fr.A-1-3进行Sephadex LH-20柱层析，内径1.5cm，高130cm，用甲醇洗脱，洗脱体积3.5L，洗脱流速0.5mL/min，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1-3-3(850mg)；

(5)组分Fr.A-1-3-3在甲醇中重结晶，得从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-10(450mg)。

实施例2

(1)牛蒡叶粉末20kg，用牛蒡叶粉末重量4倍、质量浓度30％乙醇提取3次，每次提取3h，合并提取液，浓缩至相当于生药0.6g/mL的浓缩液；

(2)浓缩液依次用正丁醇6L、6L、3L、2L萃取4次，合并正丁醇萃取液，减压浓缩溶剂，得组分Fr.A(85g)；组分Fr.A进行硅胶柱层析，内径7cm，高20cm，以体积比二氯甲烷︰甲醇＝100︰2溶液24L洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1(27g)；

(3)组分Fr.A-1进行二次硅胶柱层析，内径6cm，高14cm，以体积比石油醚-乙酸乙酯100:5、5L，100:10、5L，100:20、6L，100:40、15L洗脱，收集100:40洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1-3(5.5g)；

(4)组分Fr.A-1-3进行Sephadex LH-20柱层析，内径3cm，高90cm，用甲醇进行洗脱，洗脱体积10L，洗脱流速1mL/min，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1-3-3(1800mg)；

(5)组分Fr.A-1-3-3在甲醇中重结晶，得从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-10(950mg)。

实施例3

(1)牛蒡叶粉末20kg，用牛蒡叶粉末重量6倍、质量浓度30％乙醇提取2次，每次提取2h，合并提取液，浓缩至相当于生药0.5g/mL的浓缩液；

(2)浓缩液依次用正丁醇3L、3L、4L、1L萃取4次，合并正丁醇萃取液，减压浓缩溶剂，得组分Fr.A(75g)；组分Fr.A进行硅胶柱层析，内径6cm，高17cm，以体积比二氯甲烷︰甲醇＝100︰2溶液20L洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1(23g)；

(3)组分Fr.A-1进行二次硅胶柱层析，内径5cm，高15cm，以体积比石油醚-乙酸乙酯100:5、4L，100:10、4L，100:20、5L，100:40、13L洗脱，收集100:40洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1-3(4.5g)；

(4)组分Fr.A-1-3进行Sephadex LH-20柱层析，内径2.5cm，高100cm，用甲醇洗脱，洗脱体积7.8L，洗脱流速0.8mL/min，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1-3-3(1400mg)；

(5)组分Fr.A-1-3-3在甲醇中重结晶，得从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-10(800mg)。

实施例4

(1)牛蒡叶粉末20kg，用牛蒡叶粉末重量6倍、质量浓度30％乙醇提取2次，每次提取1.5h，合并提取液，浓缩至相当于生药0.4g/mL的浓缩液；

(2)浓缩液依次用正丁醇5L、5L、3L、2L萃取4次，合并正丁醇萃取液，减压浓缩溶剂，得组分Fr.A(65g)；组分Fr.A进行硅胶柱层析，内径5cm，高15cm，以体积比二氯甲烷︰甲醇＝100︰2溶液13L洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1(20g)；

(3)组分Fr.A-1进行二次硅胶柱层析，内径4cm，高15cm，以体积比石油醚-乙酸乙酯100:5、3L，100:10、3L，100:20、4L，100:40、10L洗脱，收集100:40洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1-3(4.5g)；

(4)组分Fr.A-1-3进行Sephadex LH-20柱层析，内径2cm，高100cm，用甲醇进行洗脱，洗脱体积5L，洗脱流速0.6mL/min，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1-3-3(1000mg)；

(5)组分Fr.A-1-3-3在甲醇中重结晶，得从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-10(650mg)。

要指出的是，上述实施例仅是用于说明本发明的具体实施方式，以对该从牛蒡叶中提取具有抗炎活性的化合物及其提取方法进行的详细描述，是说明性的，而不是用于限定本发明的保护范围，凡是在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，均应属本发明的保护范围之内。

上述所得化合物经测定，鉴定为从牛蒡叶中提取的一个新化合物，化合物NBY-10((3aR,5R,5aS,9aR,9bR)-3a,4,5,5a,6,7,9a,9b-octahydro-5-hydroxy-8-(hydroxymethyl)-5-methyl-1-methylenenaphtho[2,1-b]furan-2(1H)-one)、分子结构式见图1所示，经实验具有抗炎作用，有关具体测定和实验资料如下：

一、结构鉴定

采用的仪器与材料：

Shimadzu double-beam 210A紫外光谱仪(Shimadzu,Kyoto,日本)；

LTQ orbitrap高分辨质谱仪(Thermo Fisher Scientific,Bremen,德国)；

核磁共振仪：Bruker AVANCEⅢ500-NMR spectrometer(Bruker,Billerica,German)，TMS为内标；

Thermo Fisher Scientific U3000型高效液相色谱仪；

BT25S精密天平(德国赛多利斯公司有限公司)。

柱色谱硅胶(100-200，200-300目)(青岛海洋化工有限公司)；Sephadex LH-20(天津市光复精细化工研究所)。

氘代试剂：DMSO-d₆、CD₃OD和CDCl₃(Cambridge Isotope Laboratories,USA)色谱级甲醇(MeOH)和乙腈(MeCN)均购于美国TEDIA天地试剂公司，石油醚、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯等试剂均为分析纯(天津富宇精细化工有限公司)。

DMEM高糖培养基(以色列BI公司，批号：0024419)；

胎牛血清(以色列BI公司，批号：02-411-9)；

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，美国Sigma-Aldrich公司，批号：L2994，加生理盐水配置储存液)；

OX-LDL(上海源叶生物科技有限公司，批号：S24897)；

BCA蛋白定量试剂盒(武汉博士德生物公司，批号：AR1110)；

RIPA裂解液(武汉博士德生物公司，批号：AR0102)；

生物安全柜(美国赛默飞公司，型号1384-A2)；

二氧化碳培养箱(美国赛默飞公司，型号3111)；

酶标仪(美国赛默飞公司，型号MULTISKAN FC)。

经鉴定，实施例1-4所述方法制备的化合物为相同的化合物，命名为从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的新化合物NBY-10，该化合物NBY-10为淡黄色油状物，

(c＝0.10g/100ml,CH₃OH)；通过HR-ESI-MS[M+Na]⁺计算值为m/z＝287.12595推测分子式为C₁₅H₂₀O₄，不饱和度为6。紫外光谱显示(CH₃OH)λ_max(logε):202(1.020),220(0.738)nm；红外光谱显示有羟基和酯的羰基(3375,1752cm^-1)等特征吸收信号。¹H-NMR(CD₃OD,500MHz)和¹³C-NMR(CD₃OD,125MHz)显示了一个甲基信号[δ_H 1.24(3H,s,H₃-11)；δ_C 22.2(C-11)]，四个亚甲基信号[δ_H 1.47(1H,m,H-6a)，1.67(1H,m,H-6b)，2.15(2H,m,H-7)，1.25(1H,m,H-4a)，2.04(1H,dd,J＝5.5,13.5Hz,H-4b)，4.07(1H,d,J＝13.4Hz,H-12a)，4.03(1H,d,J＝13.4Hz,H-12b)；δ_C 20.1(C-6),20.6(C-7)，39.4(C-4)，66.7(C-12)]，4个次甲基信号[δ_H3.13(1H,m,H-9a)，3.35(1H,m,H-9b)，4.89(1H,m,H-3a)，1.65(1H,m,H-5a)；δ_C 34.2(C-9a)，41.0(C-9b)，78.5(C-3a)，46.4(C-5a)]，一个三取代双键[δ_H 5.93(1H,d,J＝5.0Hz,H-9)；δ_C 140.8(C-8),124.0(C-9)]，一个1,1-二取代双键[δ_H 5.98(1H,d,J＝3.3Hz,H-10)，6.17(1H,d,J＝3.3Hz,H-10a)；δ_C 140.2(C-1)，125.1(C-10)]，一个sp³季碳δ_C 73.2(C-5)，一个酯羰基碳δ_C 173.4(C-2)。化合物NBY-10的¹H和¹³C-NMR数据与Cadinanolide相似，但核磁共振光谱显示存在一个含氧亚甲基信号[δ_H 4.07(1H,d,J＝13.4Hz,H-12a)，4.03(1H,d,J＝13.4Hz,H-12b)；δ_C 66.7(C-12)]，而不是甲基。H-12与C-7和C-9显示出HMBC相关性。HMBC谱显示H₂-7与C-5a/C-6/C-9；H-9a与C-5a/C-6/C-8/C-9；H-9b与C-9a/C-3a/C-4/C-5a；H₂-4与C-3a/C-5/C-11；H-2与C-9b/C-2/C-1；H-10与C-5a；H₃-11与C-4/C-5/C-5a的相关性。H-H COSY谱显示了H-6与H-7/H-5a、H-9b与H-9a/H-3a、H-3a与H-4之间的相关性。因此，确定了化合物NBY-10的平面结构。在NOESY实验的基础上推导出了化合物NBY-10的相对构型。从H-9a到H-9b、H-3a的NOE关联表明它们在同一面，而从H₃-11到H-5a的NOE关联显示在另一个面上。通过理论ECD计算确定了化合物NBY-10的绝对构型。化合物NBY-10的ECD光谱在220nm处表现出正的Cotton效应，与实验结果相符。因此，化合物NBY-10的绝对构型为3aR,5R,5aS,9aR,9bR。

¹H-NMR and ¹³C-NMR date for compound 10in MeOD(J in Hz)

二、活性实验

1.1细胞培养

将RAW264.7细胞培养于DMEM完全培养基(含10％新生牛血清和90％DMEM不完全培养液)中，置37℃、含5％CO₂培养箱内培养。选择对数生长期细胞用于实验。

小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)由河南中医药大学细胞成像实验室培养。

1.2 MTT法检测RAW264.7细胞活力

取对数生长期的RAW264.7细胞，用完全培养基配成1×10⁵个/mL的细胞悬浮液，接种于96孔板中，每孔加入100μl的细胞悬液，置37℃、含5％CO₂培养箱内培养。24h后，弃去孔内上清液，分别加入100μl浓度为160、80、40、20、10、0mM，化合物NBY-10的完全培养基；即给药组和空白组，每组设置3个复孔，置37℃、含5％CO₂培养箱内培养。24h后，每孔加入MTT 10μl，继续培养3h，弃去上清液，每孔加入100μl DMSO，在要床上振摇10min后，紫色结晶充分溶解，用酶标仪在490nm处测定各孔OD值。并计算细胞存活率，细胞存活率＝(A测/A空)×100％。

表1化合物NBY-10对RAW264.7细胞活性的影响

注：与空白比较*p＜0.01，**p＜0.001。

结果分析：

化合物NBY-10不同浓度对RAW264.7细胞活力的影响，如表1在化合物NBY-10浓度为40μM的时候，细胞存活率低于100％，其他浓度下细胞存活率大于100％。我们选择化合物NBY-10对细胞的给药浓度为10、20μM，的时候，用于对细胞下一步实验研究。

1.3 Griess法检测LPS诱导RAW264.7细胞产生NO水平

将处于对数生长期的细胞接种于24孔板(2×10⁵个细胞/孔)，37℃、5％CO₂环境的培养箱中培养12h后加入不同质量浓度的待测样品，温孵培养1h后加人1μg/mL LPS。同时设空白对照组(培养基)、模型(LPS+培养基)组、阳性药组(***+培养基)和药物作用组。继续温孵培养24h。每组重复3次独立实验。将上清液(100mL)与等体积格氏试剂混合，用酶联免疫检检测仪测定混合物在540nm处的OD值，计算NO抑制率，结果见表2。

表2化合物NBY-10对LPS诱导的RAW264.7细胞NO水平影响

注：阳性药(***)

结果分析：

由表2可知，模型组NO的释放量显著高于空白对照组(P<0.01)，表明造模成功。与模型组相比，各浓度处理均能显著降低NO的释放量(P<0.01)，且呈浓度依赖性。由表2可以看出，化合物NBY-10能够较好地抑制炎症因子NO的生成。

实验表明，本发明化合物NBY-10作为具有显著的抗炎活性(作用)，显著降低NO的释放量，抑制炎症因子NO的生成，有效用于制备治疗急性肺炎的药物。

综上所述，本发明是从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的新化合物NBY-10，原料丰富，制备方法易操作，导向性强，产品纯度96％以上，该化合物可有效用于制备抗炎的药物，开拓了牛蒡叶的新用途和药用价值，经济和社会效益巨大。

Claims

1.一种从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-10，该化合物NBY-10的分子结构式为：

2.权利要求1所述的从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-10的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)浓缩液依次用正丁醇2～8L、2～8L、1～4L、0.5～2L萃取4次，合并正丁醇萃取液，减压浓缩溶剂，得组分Fr.A；组分Fr.A进行硅胶柱层析，内径4～8cm，高8～25cm，以体积比二氯甲烷︰甲醇＝100︰2溶液8～25L洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1；

(3)组分Fr.A-1进行二次硅胶柱层析，内径3～7cm，高12～30cm，以体积比石油醚-乙酸乙酯100:5、2～6L，100:10、2～6L，100:20、2～6L，100:40、4～15L洗脱，收集100:40洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1-3；

(4)组分Fr.A-1-3进行Sephadex LH-20柱层析，内径1～3cm，高80～150cm，用甲醇进行洗脱，洗脱体积1～15L，洗脱流速0.5～1mL/min，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1-3-3；

(5)组分Fr.A-1-3-3在甲醇中重结晶，得从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-10。

3.根据权利要求2所述的从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-10的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)浓缩液依次用正丁醇7L、7L、4L、2L萃取4次，合并正丁醇萃取液，减压浓缩溶剂，得组分Fr.A；组分Fr.A进行硅胶柱层析，内径4cm，高25cm，以体积比二氯甲烷︰甲醇＝100︰2溶液8L洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1；

(3)组分Fr.A-1进行二次硅胶柱层析，内径3.5cm，高27cm，以体积比石油醚-乙酸乙酯100:5、2L，100:10、2L，100:20、3L，100:40、5L洗脱，收集100:40洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1-3；

(4)组分Fr.A-1-3进行Sephadex LH-20柱层析，内径1.5cm，高130cm，用甲醇洗脱，洗脱体积3.5L，洗脱流速0.5mL/min，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1-3-3；

4.根据权利要求2所述的从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-10的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)浓缩液依次用正丁醇6L、6L、3L、2L萃取4次，合并正丁醇萃取液，减压浓缩溶剂，得组分Fr.A；组分Fr.A进行硅胶柱层析，内径7cm，高20cm，以体积比二氯甲烷︰甲醇＝100︰2溶液24L洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1；

(3)组分Fr.A-1进行二次硅胶柱层析，内径6cm，高14cm，以体积比石油醚-乙酸乙酯100:5、5L，100:10、5L，100:20、6L，100:40、15L洗脱，收集100:40洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1-3；

(4)组分Fr.A-1-3进行Sephadex LH-20柱层析，内径3cm，高90cm，用甲醇进行洗脱，洗脱体积10L，洗脱流速1mL/min，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1-3-3；

5.根据权利要求2所述的从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-10的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)浓缩液依次用正丁醇3L、3L、4L、1L萃取4次，合并正丁醇萃取液，减压浓缩溶剂，得组分Fr.A；组分Fr.A进行硅胶柱层析，内径6cm，高17cm，以体积比二氯甲烷︰甲醇＝100︰2溶液20L洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1；

(3)组分Fr.A-1进行二次硅胶柱层析，内径5cm，高15cm，以体积比石油醚-乙酸乙酯100:5、4L，100:10、4L，100:20、5L，100:40、13L洗脱，收集100:40洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1-3；

(4)组分Fr.A-1-3进行Sephadex LH-20柱层析，内径2.5cm，高100cm，用甲醇洗脱，洗脱体积7.8L，洗脱流速0.8mL/min，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1-3-3；

6.根据权利要求2所述的从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-10的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)浓缩液依次用正丁醇5L、5L、3L、2L萃取4次，合并正丁醇萃取液，减压浓缩溶剂，得组分Fr.A；组分Fr.A进行硅胶柱层析，内径5cm，高15cm，以体积比二氯甲烷︰甲醇＝100︰2溶液13L洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1；

(3)组分Fr.A-1进行二次硅胶柱层析，内径4cm，高15cm，以体积比石油醚-乙酸乙酯100:5、3L，100:10、3L，100:20、4L，100:40、10L洗脱，收集100:40洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1-3；

(4)组分Fr.A-1-3进行Sephadex LH-20柱层析，内径2cm，高100cm，用甲醇进行洗脱，洗脱体积5L，洗脱流速0.6mL/min，减压回收溶剂，得组分Fr.A-1-3-3；

7.权利要求1所述的从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-10在制备抗炎药物中的应用。

8.权利要求1所述的从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-10在制备治疗急性肺炎的药物中的应用。