CN107474092A - 一种草菇子实体活性成分及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种草菇子实体活性成分制备方法及应用。本发明将草菇干燥子实体粉碎，加乙醇溶液经超声提取、浓缩后获得乙醇浸膏，用二氯甲烷、甲醇溶解后，与硅胶按体积比1:1的量干法拌样，干法装柱，过硅胶色谱柱用氯仿‑甲醇洗脱，洗脱后的组分和硅胶（200‑300目）按体积比1:2的比例拌样，干法装柱，用体积比8:2的二氯甲烷‑丙酮洗脱，经Sephadex LH‑20纯化和HPLC处理后获得3β,5α,9α‑三羟基麦角甾‑7,22‑二烯‑6‑酮，实验结果表明3β,5α,9α‑三羟基麦角甾‑7,22‑二烯‑6‑酮在抑制胃癌 SGC‑7901、人乳腺癌MCF‑7以及人肝癌HepG‑2等肿瘤细胞活性方面效果显著。
Description
技术领域
本发明属中药化学领域，具体涉及一种草菇子实体活性成分及其制备方法和应用。
背景技术
草菇（Volvariella volvacea (Bull. ex Fr.) Sing.）又称南华菇、稻草菇，国际上确认南华草菇是世界人工栽培草菇的起源，由华侨传出国外，故又名“中国菇”、“广东菇”，成为世界上第三大栽培食用菌。我国是世界上草菇主产区之一，分布于广东、广西、四川、福建、湖南、江西和台湾等地区。草菇分为两种品系：一类为黑草菇，一类为白草菇。草菇是喜高温、高湿的腐生真菌，我国作为草菇主产区之一，95年我国草菇产量达15万吨，占全世界产量的60%，居世界之首。草菇口感鲜嫩，肉质细腻，味道鲜美，菌汤如奶，有“素中之荤”佳誉。草菇保健价值高，具有清热解暑、补脾益气、增强免疫力、加速伤口愈合等功效，它还具有降低胆固醇和抗癌等作用。草菇含有丰富的蛋白质、人体必需氨基酸、脂肪、多糖、维生素和多种矿物质，其中核酸类物质占8.8%，含量最高，具有抗病毒、降血糖、降血脂的功效；每100 g鲜菇含维生素C 207.7 mg，糖分2.6 g，粗蛋白2.68 g，脂肪2.24 g，灰分0.91 g；每100 g干草菇含粗蛋白28.03 g、粗脂肪1.24 g、可溶性多糖0.50 g、粗纤维18.9 g、水分10.65 g、灰分9.01 g、维生素C 206.28 mg；草菇蛋白质含人体必需氨基酸，占氨基酸总量的38.2 %。另外，从该属真菌中已分离得到草菇多糖、凝集素、蛋白、氨基酸、三萜类化合物、甾醇等多种成分。有研究表明草菇有抗肿瘤、抗氧化、抗败血酸和调节免疫的作用，但对其***化学成分的研究较少，作为世界上著名的药、食两用菌，有较高的营养价值和药用价值，具有广阔的开发前景。
近年来国内外已对多种食用菌，如双孢菇、灰树花、鸡油菌、凤尾菇、黑木耳、银耳、黄绿蜜环菌等进行了多糖的提取纯化、分离鉴定及功能性方面的研究，大量的数据显示多糖具有抗肿瘤作用，但真菌的化学成分和生物活性的研究仍然欠缺；药用真菌活性成分除多糖和糖蛋白大分子物质外，另一重要活性成分就是真菌小分子化合物，真菌小分子化合物主要有酚类、聚酮类、萜类、生物碱类和甾体多具有抗瘤作用，目前的研究多集中在萜类和甾体类化合物的体外研究，主要以萜类化合物和甾体为主；麦角甾化合物存在于药用真菌中，又称类固醇，可分为麦角甾醇、麦角甾酮及其衍生物；麦角甾类化合物具有多种药理活性 ，其中过氧麦角甾类有15种，因含有过氧桥，其生物活性强，主要有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抑菌等作用。目前，草菇的研究多集中在粗提物、次级代谢产物及草菇多糖的药效试验和草菇的栽培育种，对其化学成分及活性物质的相对分子量和化学结构研究较少。
现今生活中，肿瘤日益严重威胁着人类的生命和健康，致力于抗癌药物的研究与开发是全世界的迫切需求。目前癌症的治疗多以化药为主，从身体和精神上折磨着病人，因此寻找疗效好、毒副作用小的药物势在必行。从真菌代谢产物中开发安全可靠抗癌新药，是一种迅速有效的新途径之一，通过与传统抗癌化药的联合应用，对化疗病人免疫力的提高有深远影响。
发明内容
本发明目的是提供一种草菇子实体活性成分及其制备方法和应用。
一种草菇子实体活性成分，其化学名称为3β, 5α, 9α-三羟基麦角甾-7, 22-二烯-6-酮；
它的化学结构为：
一种草菇子实体活性成分的制备方法，它包括：
1）取草菇干燥子实体粗粉，以95%乙醇为溶剂，按料液比1:4的量加入圆底烧瓶，在30℃下超声30 min，静置过夜，减压回收提取液，残渣用95%乙醇加热回流提取3次，每次3h，合并提取液，减压回收获得乙醇浸膏；；
2）将步骤1）所述的乙醇浸膏用二氯甲烷、甲醇溶解，与硅胶按体积比1:1的量进行干法拌样，干法装柱，过100-200目150 mm × 305 mm的硅胶色谱柱，用氯仿-甲醇体积比（9:1、8：2、7：3、6：4、1：1）进行梯度洗脱，获得氯仿-甲醇（8：2）洗脱组分； 3）将步骤2）所述的洗脱组分和200-300目的硅胶按体积比1:2的比例拌样，干法装柱，用体积比8:2的二氯甲烷-丙酮洗脱，经羟丙基葡聚糖凝胶Sephadex LH-20纯化，经HPLC制备分离，条件为80%~100%甲醇，254 nm，10 ml/min，获得化合物3β, 5α, 9α-三羟基麦角甾-7, 22-二烯-6-酮。3β, 5α,9α-三羟基麦角甾-7, 22-二烯-6-酮，在制备治疗胃癌、人乳腺癌或人肝癌药物中的应用。
本发明提供了一种草菇子实体活性制备方法及应用，它是将草菇干燥子实体粉碎，加乙醇溶液经超声提取、浓缩后获得乙醇浸膏，用二氯甲烷、甲醇溶解后，与硅胶按体积比1:1的量干法拌样，干法装柱，过硅胶色谱柱用氯仿-甲醇梯度洗脱，洗脱后的组分和硅胶（200-300目）按体积比1:2的比例拌样，干法装柱，用体积比8:2的二氯甲烷-丙酮洗脱，经Sephadex LH-20纯化和HPLC处理后获得3β, 5α, 9α-三羟基麦角甾-7, 22-二烯-6-酮，实验结果表明3β, 5α, 9α-三羟基麦角甾-7, 22-二烯-6-酮在抑制胃癌 SGC-7901、人乳腺癌MCF-7以及人肝癌HepG-2肿瘤细胞活性方面效果显著。
附图说明
图1 草菇提取流程图；
图2 化合物4的HPLC图；
图3 化合物5的HPLC图；
图4 化合物6-8的HPLC图；
图5 化合物9的HPLC图；
图6 化合物10的HPLC图；
图7 化合物11的HPLC图；
图8 麦角甾醇化学结构；
图9 麦角甾醇过氧化物化学结构；
图10 2(5H)-呋喃酮-4-丙酸化学结构；
图11 3β, 5α, 9α-三羟基麦角甾-7, 22-二烯-6-酮化学结构；
图12 3β, 5α, 9α, 14α-四羟基麦角甾-7, 22-二烯-6-酮化学结构；
图13 5α, 6α-环氧-24-甲基胆甾-8(14), 22-二烯-3β, 7α-醇化学结构；
图14 化合物对人胃癌细胞SGC-7901的抑制率；
图15 化合物对人***癌细胞PC-3M的抑制率；
图16 化合物对人肺癌细胞NCI-H460的抑制率；
图17 化合物对人乳腺癌细胞MCF-7的抑制率；
图18化合物对人肝癌细胞HepG-2的抑制率。
具体实施方式
实施例1草菇化学成分的提取
草菇干品于2015年5月购于江苏江南生物科技有限公司。经分子鉴定本实验所用草菇（Volvariella volvacea）与Genebank数据库中的草菇为同种
取草菇干燥子实体粗粉5kg，以95%乙醇为溶剂，按料液比1:4的量加入圆底烧瓶，在30℃下超声30 min，静置过夜，减压回收提取液，残渣用95%乙醇回流提取3次，每次3h，合并提取液，减压回收获得乙醇浸膏725 g。将乙醇浸膏用有机试剂溶解，与硅胶（100-200目）按体积比1:1干法拌样，干法装柱，过100-200目的硅胶色谱柱（150 mm × 305 mm），以石油醚-氯仿（1:0、20:1、10:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1）、氯仿-甲醇（1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、0:1）梯度洗脱，得到15个组分。具体流程如图1所示。
实施例2草菇化学成分的分离
将氯仿部位（13.1 g）溶解，与硅胶（100-200目）按1:2的比例拌样，干法上硅胶柱（73mm × 305 mm），用石油醚-乙酸乙酯为流动相梯度洗脱，分为5个部分，其中石油醚-乙酸乙酯（8:2）洗脱部位硅胶拌样装柱（200-300目），用石油醚-乙酸乙酯（15:1）洗脱获得化合物1（500.4 mg）。
将氯仿-甲醇（20:1）部分（9.5 g）溶解拌样进行硅胶柱层析（100-200目），以石油醚-乙酸乙酯（100:1、50:1、20:1、10:1、8:2、7:3）进行梯度洗脱，对石油醚-乙酸乙酯（50:1、7:3）部分进行硅胶柱层析（200-300目），获得化合物2和化合物3；对甲醇部分进行凝胶层析，再进行制备HPLC制备（条件15%-95%甲醇， 254 nm），获得化合物4，HPLC如图2所示。
将氯仿-甲醇（9:1）部分（12.0 mg）按1:2的比例（200-300目）硅胶拌样，干法装住，用二氯甲烷-丙酮（50:1、20:1、10:1、8:2、7:3、6:4）洗脱，获得5个组分。其中二氯甲烷-丙酮（10:1）组分，经Sephadex LH-20纯化，经制备HPLC（20%甲醇，203 nm，10 ml·min-1）得化合物5（16.0 mg），HPLC如图3所示；其中二氯甲烷-丙酮 （8:2）部分，经Sephadex LH-20纯化，经制备HPLC（80%~100%甲醇，254 nm，10 ml·/min-1）得化合物7（5.9 mg，20.293 min）、化合物8（61.3 mg，28.119 min），HPLC如图4所示；其中，二氯甲烷-丙酮（6:4）部分，经Sephadex LH-20纯化，经制备HPLC（15%~40%，30 min甲醇，230 nm，流速10 ml·/min-1）得化合物9（124.8mg，13.02 min），HPLC如图5所示；其中，二氯甲烷-丙酮（1:1）组分，经制备HPLC（15%甲醇，254 nm，流速10ml/min)得化合物10（20.1 mg，12.617 min），HPLC如图6所示。
将氯仿-甲醇（8:2）部分（17.1 g）用甲醇溶解，按硅胶1:3的比例拌样，过硅胶（100-200目）柱层析，用二氯甲烷-甲醇（100:1、50:1、20:1、10:1、9:1、8:2、0:1），获得3个组分；其中二氯甲烷-甲醇（20:1）的12-16组分溶于甲醇，经凝胶柱，经甲醇洗脱，经制备HPLC（20%甲醇，254 nm，10 ml·/min-1），获得化合物11（15.0 mg、11.78min），HPLC如图7所示；其中二氯甲烷-甲醇（10:1、8:2）的22-27组分和10-17组分，经Sephadex LH-20凝胶柱，经甲醇洗脱，获得化合物12（18.5 mg）和化合物13（13.4 mg）。
实施例3化合物6 3β, 5α, 9α-三羟基麦角甾-7, 22-二烯-6-酮的提取
1）取草菇干燥子实体粗粉，以95%乙醇为溶剂，按料液比1:4的量加入圆底烧瓶，在30℃下超声30 min，静置过夜，减压回收提取液，残渣用95%乙醇加热回流提取3次，每次3h，合并提取液，减压回收获得乙醇浸膏；2）将步骤1）所述的乙醇浸膏用二氯甲烷、甲醇溶解，与硅胶按体积比1:1的量进行干法拌样，干法装柱，过100-200目150 mm × 305 mm的硅胶色谱柱，用氯仿-甲醇体积比（9:1、8：2、7：3、6：4、1：1）进行梯度洗脱，获得氯仿-甲醇（8：2）洗脱组分； 3）将步骤2）所述的洗脱组分和200-300目的硅胶按体积比1:2的比例拌样，干法装柱，用体积比8:2的二氯甲烷-丙酮洗脱，经羟丙基葡聚糖凝胶Sephadex LH-20纯化，条件100%甲醇，经HPLC制备分离，条件为80%~100%甲醇，254 nm，10 ml/min，获得化合物3β, 5α,9α-三羟基麦角甾-7, 22-二烯-6-酮。
实施例4草菇化学成分的结构鉴定
对实施例2所分离的化合物进行结构鉴定。
化合物1：白色针状晶体（氯仿）。薄层色谱254 nm有紫外吸收，365 nm无荧光吸收，10% H2SO4溶液显***。1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ：3.62 (1H, m, H-3), 5.18 (1H,m, H-6), 5.57 (1H, m, H-7), 0.63 (3H, s, H-18), 0.95 (3H, s, H-19), 1.05 (3H,d, J=6.8 Hz, H-21), 5.18 (1H, m, H-22), 5.20 (1H, m, H-23), 1.80 (1H, m, H-24), 1.40 (1H, m, H-25), 0.82 (3H, d, J=4.5 Hz, H-26), 0.81 (3H, d, J=4.5 Hz,H-27), 0.91 (3H, d, J=3.9 Hz, H-28)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 39.3 (C-1),32.1 (C-2), 70.6 (C-3), 40.6 (C-4), 139.9 (C-5), 119.9 (C-6), 116.5 (C-7),141.5 (C-8), 46.2 (C-9), 35.5 (C-10), 21.3 (C-11), 38.5 (C-12), 43.0 (C-13),54.7 (C-14), 21.9 (C-15), 28.4 (C-16), 55.9 (C-17), 12.2 (C-18), 16.4 (C-19),40.5 (C-20), 21.2(C-21), 132.9 (C-22), 135.7 (C-23), 42.8 (C-24), 33.3 (C-25), 19.8 (C-26), 20.1 (C-27), 17.7 (C-28) 。鉴定化合物1为麦角甾醇（ergosterol），化学结构如图8所示。
化合物2：白色粉末。ESI-MSm/s：284[M+]，1H-NMR（600MHz，DMSO-d）δ：2.17(2H, t,J=7.0 Hz, CH2-2), 1.47(2H, m, CH2-3), 1.17(28H, m, CH2-4、7), 0.84(3H, t, J=7.0Hz, CH3-18)；13C-NMR(150Hz, DMSO-d)δ: 173.89(C=O-1), 33.55(CH-2), 31.26(CH2-16), 29.01(CH2-15), 24.46(CH3-3), 22.00(CH2-17), 14.00(CH3-18), 28-28.58(CH2-14、4)。鉴定化合物2为十八烷酸（Octadecanoic acid）。
化合物3：白色粉末。薄层色谱254 nm无紫外吸收，365 nm无荧光吸收，10% H2SO4溶液显色后斑点为暗红色。1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ: 6.26 (1H, d, J=9.6 Hz, H-6),6.49 (1H, d, J=9.6 Hz, H-7), 5.14(1H, dd, J=15.2, 8.1 Hz, H-22), 5.42 (1H,dd, J=15.2, 7.4 Hz, H-23), 0.82 (3H, d, J=4.5 Hz, H-26), 0.81 (3H, d, J=4.5Hz, H-27), 0.91 (3H, d, J=3.9 Hz, H-28)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3) δ: 36.9(C-1),30.1 (C-2), 66.4 (C-3), 34.6 (C-4), 82.1 (C-5),135.1 (C-6), 130.7 (C-7), 79.4(C-8), 51.0 (C-9), 36.9(C-10), 20.6 (C-11), 39.3 (C-12), 44.5 (C-13), 51.6(C-14), 23.3 (C-15), 28.6 (C-16), 56.1 (C-17), 12.9 (C-18), 18.1 (C-19), 39.7(C-20), 20.9 (C-21), 135.3 (C-22), 132.3 (C-23), 42.7 (C-24), 33.0 (C-25),19.6 (C-26), 19.9 (C-27), 17.5 (C-28)。鉴定化合物3为麦角甾-5α, 8α-环二氧-6,22-二烯-3β-醇，即麦角甾醇过氧化物（ergosterol peroxide），化学结构如图9所示。
化合物4：淡黄色无定形粉末。ESI-MS m/z: 243.2[M+H]+和507.3[2 M+Na]+ 。1H-NMR (600 MHz, C5D5N) δ: 8.06 (1H, s, H-9), 7.89 (1H, s, H-6), 2.50 (3H, s, 7-CH3), 2.49 (3H, s, 8-CH3). 13C-NMR (150 MHz, C5D5N) δ: 19.87 (7-CH3), 20.44 (8-CH3), 147.7 (C-10a), 143.0 (C-9a), 127.2 (C-9), 139.8 (C-8), 144.8 (C-7),129.7 (C-6), 139.1 (C-5a), 131.0 (C-4a), 162.1 (C-4), 151.8 (C-2)。鉴定化合物4为7,8-二甲基异咯嗪（lumichrome）。
化合物5：白色粉末，ESI-MS m/z: 157.2[M+H]+。1H-NMR (600 MHz, D2O) δ: 5.81(1H, s, H-2), 4.83 (2H, s, H-4), 2.59 (2H, t, J = 7.2 Hz, H-5), 2.39 (2H, t,J = 7.2 Hz, H-6). 13C-NMR (150 MHz, D2O) δ: 181.1 (s, C-8), 178.2 (s, C-2),174.5 (s, C-4), 113.6 (d, C-3), 74.7 (t, C-5), 34.5 (t, C-7), 24.8 (t, C-6)。，再结合该化合物的HMBC、HSQC及COSY谱最终确定化合物5为2(5H)-呋喃酮-4-丙酸（2(5H)-ficifuranone-4-propionic acid），化学结构如图10所示。
化合物6：白色粉末。ESI-MS m/z: 467.3 [M+Na]+；1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ:5.49 (1H, s, H-7), 5.14 (1H, dd, J=15.2, 8.1 Hz, H-22), 3.83 (1H, m, H-3),1.2 (3H, d, J=7.2 Hz, H-21), 0.76 (3H, dd, J=11.7, 6.8 Hz, H-26), 0.85 (3H,d, J=6.8 Hz, H-27), 0.90 (3H, s, H-28), 0.57 (3H, s, H-18), 096 (3H, d, J=6.8Hz, H-19)。13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 36.1 (C-1), 29.1 (C-2), 67.8 (C-3), 26.6(C-3), 75.1 (C-4), 200.1 (C-5), 120.9 (C-7), 165.0 (C-8), 80.1 (C-9), 41.6(C-10), 26.6 (C-11), 34.3 (C-12), 44.3 (C-13), 52.8 (C-14), 21.6 (C-15), 23.4(C-16), 57.4 (C-17), 12.6 (C-18), 20.1 (C-19), 37.1 (C-20), 18.2 (C-21),136.6 (C-22), 133.6 (C-23), 42.8 (C-24), 31.0 (C-25), 18.7 (C-26), 19.0 (C-27), 16.7 (C-28)。鉴定化合物5为3β, 5α, 9α-三羟基麦角甾-7, 22-二烯-6-酮（3β, 5α,9α-trihydroxyergosta-7, 22-dien-6-one），化学结构如图11所示。
化合物7：白色粉末。1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 4.78 (1H, m, H-3), 5.96(2H, s, H-7), 0.76 (3H, dd, J=11.3, 6.8 Hz, H-18), 1.19 (3H, s, H-19), 1.93(1H, m, H-20), 1.03 (3H, s, H-21), 5.17 (1H, dd, J=15.4, 7.7 Hz, H-22), 0.85(3H, d, J=6.4Hz, H-26), 0.88 (3H, s, H-27), 0.95 (3H, d, J=6.4Hz, H-29), 6.36(1H, s, 3-OH), 8.44 (1H, s, 5-OH), 6.63 (1H, s, 9-OH)。13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 25.7 (C-1), 31.1 (C-2), 67.1 (C-3), 36.7 (C-4), 79.9 (C-5), 199.1 (C-6),122.6 (C-7), 159.1 (C-8), 77.8 (C-9), 42.7 (C-10), 31.1 (C-11), 28.8 (C-12),47.9 (C-13), 87.1 (C-14), 27.5 (C-15), 28.8 (C-16), 51.2 (C-17), 16.8 (C-18),20.2 (C-19), 40.65 (C-20), 21.6 (C-21), 136.1 (C-22), 133.4 (C-23), 43.2 (C-24), 34.2 (C-25), 19.9 (C-24), 20.2 (C-27), 18.0 (C-24)。鉴定化合物6为3β, 5α,9α, 14α-四羟基麦角甾-7, 22-二烯-6酮（3β, 5α, 9α, 14α-tetrahydroxyergosta-7,22-dien-6-one），化学结构如图12所示。
化合物8：白色粉末。ESI-MS m/z: 428[M]+，1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 1.41(2H, s, H-1), 1.52 (2H, m, H-2), 2.11 (2H, m, H-4), 3.07 (1H, d, J=3.0 Hz, H-6), 4.43 (1H, d, J=2.3 Hz, H-7), 2.44 (1H, d, J=7.9 Hz, H-9), 1.43 (2H, d, J=2.6 Hz, H-11), 1.22 (2H, s, H-12), 2.13 (2H, m, H-15), 1.43 (2H, d, J=2.6 Hz,H-16), 1.24 (1H, m, H-17), 0.89 (3H, d, J=3.7 Hz, H-18), 2.13 (1H, m, H-20),1.06 (3H, d, J=6.4 Hz, H-21), 5.24 (1H, m, H-23), 1.89 (1H, m, H-24), 1.43(1H, d, J=2.6 Hz, H-25), 0.86 (3H, s, H-26), 0.89 (3H, d, J=3.7 Hz, H-27)。13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 33.4 (C-1), 31.9 (C-2), 69.2 (C-3), 40.4 (C-4), 68.0(C-5), 62.6 (C-6), 65.8 (C-7), 126.6 (C-8), 40.5 (C-9), 37.1 (C-10), 18.5 (C-11), 37.9 (C-12), 44.3 (C-13), 152.8 (C-14), 25.7 (C-15), 28.4 (C-16), 58.2(C-17), 18.2 (C-18), 16.9 (C-19), 40.6 (C-20), 21.7 (C-21), 136.8 (C-22),133.29 (C-23),44.3 (C-24), 20.4 (C-25), 34.4 (C-26), 20.2 (C-27), 20.1 (C-28)。鉴定化合物7为5α, 6α-环氧-24-甲基胆甾-8(14), 22-二烯-3β, 7α-醇（5α, 6α-epoxy-24-methylcholesta-8(14), 22-diene-3β, 7α-diol），化学结构如图13所示。
化合物9：白色无定形固体（甲醇）。1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 9.02 (1H, d, J=2.0 Hz, H-2), 8.68 (1H, dd, J=15.5, 5.0 Hz, H-6), 8.27 (1H, m, H-4), 7.53(1H, dd, J=5.0, 8.0 Hz, H-5)。13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 169.8 (C=O), 152.8(C-6), 149.5 (C-2), 137.3 (C-4), 131.4 (C-3), 125.4 (C-5)。鉴定化合物8为烟酰胺（nicotinamide）。
化合物10：白色无定形粉末。ESI-MS m/z: 268.7 [M＋H] +。1H-NMR (600 MHz,D2O) δ: 8.31 (1H, s, H-2), 8.14 (1H, s, H-8), 5.88 (1H, d, J=6.0 Hz, H-1′),5.18 (3H, m, 2′-OH, 3′-OH, 5′-OH), 4.62 (1H, J=6.0 Hz, H-2′), 4.14 (H, s, H-3′), 3.68 (1H, d, J=12 Hz, H-5′), 3.35 (1H, d, J=12 Hz, H-5′)。13C-NMR (150MHz, D2O) δ: 152.4 (C-2), 148.3 (C-4), 119.0 (C-5), 155.5 (C-6), 140.5 (C-8),88.2 (C-1′), 73.6 (C-2′), 70.6 (C-3′), 85.7 (C-4′), 61.4 (C-5′)。鉴定化合物10为腺苷（Adenosine）。
化合物11：无色针状结晶（甲醇）。1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 9.12 (1H, d, J= 1.8 Hz, H-2), 8.73 (1H, dd, J = 1.2, 4.8 Hz, H-6), 8.41 (1H, dt, J = 1.8,3.6, 7.8 Hz, H-4), 7.56(1H, dd, J = 4.8, 7.8 Hz, H-5)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 167.7 (C=O), 153.6 (C-2), 151.2 (C-6), 139.2 (C-4), 128.7 (C-3), 125.2 (C-5)。鉴定化合物11为烟酸（Nicotinic acid）。
化合物12：白色针状结晶(甲醇)。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 7.36 (1H, d, J =2.0 Hz, H-3), 7.29 (1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz, H-7), 6.79 (1H, d, J = 8.0 Hz,H-6)。13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ:123.9(C-6),115.8(C-2),151.5(C-4),146.4(C-3), 23.0(C-1), 117.7(C-5), 170.3(COOH)。鉴定化合物12为原儿茶酸（protocatechuic acid）。
化合物13：无色晶体(甲醇)。EI-MSm/z:118[M+], 1H-NMR(600 MHz, CD3OD) δ:2.53 (4H, -2CH2 ), 12.2(2H, -2COOH)。13C-NMR(150 MHz, CD3OD)δ: 28.8(C-2, 3),173.8(C-1, 4)。确定该化合物为琥珀酸 (succinic acid)。
实施例5 单体化合物的体外抗肿瘤活性实验
从草菇乙醇提取物中分离得到的六个化合物，麦角甾醇（化合物1）、过氧化物麦角甾醇（化合物3）、2(5H)-呋喃酮-4-丙酸（化合物5）、3β, 5α, 9α-三羟基麦角甾-7, 22-二烯-6-酮（化合物6）、3β, 5α, 9α, 14α-四羟基麦角甾-7, 22-二烯-6酮（化合物7）、5α, 6α-环氧-24-甲基胆甾-8(14), 22-二烯-3β, 7α-醇（化合物8），其中化合物1、3、8是麦角甾醇类化合物，化合物6、7是麦角甾酮类化合物，化合物5是呋喃酮类化合物；利用CCK-8细胞活力检测法对上述六个化合物进行癌细胞增殖抑制作用实验。
1.样品的配置
分别取化合物1、3、6、7、8各4mg加入100μL DMSO溶解，用PBS缓冲液定容到10 mL，配成母液400 μg·mL-1，然后倍比稀释成200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 μg·mL-1。取4 mg化合物5溶于10 mL的PBS缓冲液中，配成浓度400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 μg·mL-1，选取5-氟尿嘧啶10 μg·mL-1为阳性对照，所有样品经0.25μm的无菌滤膜过滤。
2. 细胞浓度的确定
取对数生长期的四种癌细胞，用细胞计数板计数四种细胞悬浮液中的癌细胞数量，配成1mL的母液，浓度为1.6×105 cell·mL-1，再用培养基等比稀释成浓度梯度，1.6×105、0.8×105、0.4×105、0.2×105、0.1×105、0.05×105 cell·mL-1，然后接种细胞到96孔板中，每组重复5个复孔，培养4 h后显微镜下观察细胞贴壁，然后加CCK-8试剂培养4 h后测定OD值，制作出一条以细胞浓度为横坐标（X轴），OD值为纵坐标（Y轴）的标准曲线，根据此标准曲线可以测定出细胞数量。
3.CCK-8法细胞增殖抑制活性筛选
取对数生长期的人胃癌SGC-7901细胞、人肝癌HpepG2细胞、人肺癌NCI-H460细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人***癌PC-3M细胞和人肾胚HEK-293细胞分别用0.25%胰蛋白酶消化成单个细胞， SGC-7901细胞、NCI-H460细胞、MCF-7细胞、PC-3M细胞用10%RPMI-1640完全培养基配成单个细胞悬浮液， HpepG2细胞、HEK-293细胞用10%DMEM完全培养基配成单个细胞悬浮液；进行细胞计数，测定细胞密度为4×104个/孔，接种于96孔板中，每孔100 μL，将96孔板移入37℃、5% CO2培养箱中培养。24 h后，显微镜观察发现细胞完全贴壁，将上清液弃去，换上等量的不完全培养基，加入10 μL不同浓度（400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 μg·mL-1）的样品和10 μL的5-氟尿嘧啶（5-FU），以不含有细胞和样品的孔为空白对照，以含有细胞无样品的孔为对照细胞，重复4个复孔。培养结束后，小心吸取培养上清液，弃去，按10:1的量混合不完全培养基和CCK-8试剂，每孔加入110 μL，继续孵育4 h， 在自动酶标仪上450 nm测定个孔的吸光值（OD值），记录实验结果。（实验重复一次）按下式计算各种浓度药物对细胞的增殖抑制活性：
抑制率（%）=(对照孔平均OD值-加药孔平均OD值)/对照孔平均OD值×100%。
细胞增殖抑制活性IC50测定：根据化合物不同浓度作用于上述癌细胞的抑制率的关系，通过回归方程得到化合物的IC50值。用SPSS统计软件处理，P>0.05 表示无显著性差异，P<0. 05 表示有显著性差异。
首先测定化合物对正常细胞HEK-293的增殖抑制影响（见表1）。从结果的统计分析得出，化合物1、3、5、6、7、8与空白组相比，无显著性差异(P>0.05)，说明在所设定的浓度范围化合物对正常细胞无细胞毒作用；其中以化合物6差异最大，说明化合物6对正常细胞的毒性最低。
以5-FU（10 μg·mL-1）为阳性对照，分别研究化合物对人胃癌 SGC-7901细胞、人***癌细胞PC-3M、人肺癌细胞NCI-H460、人乳腺细胞MCF-7和人肝癌细胞HepG-2经不同浓度作用24 h后细胞增殖抑制的影响（如图14-18）。图14结果表明，化合物1、3、5、6在200-400 μg·mL-1 对癌细胞的抑制率与阳性药相比，两者有极显著性差异(P<0.01)，在12.5-50 μg·mL-1的范围内，化合物6、8与阳性药相比，差异不显著（P>0.05），在一定浓度范围内，抑制效果随着药物作用浓度增加而增强。其中，以化合物5的抑制作用最好。
化合物对人***癌细胞PC-3M经不同浓度作用24 h后细胞增殖抑制的影响如图15所示，在浓度范围内化合物有抑制PC-3M癌细胞增殖的作用，并且随着化合物浓度升高，抑制PC-3M细胞增殖的作用更强。化合物1与阳性药5-FU相比，在200-400 μg·mL-1 ，（P<0.05）差异显著，在12.5 μg·mL-1，抑制率为50.22%，在100 μg·mL-1是，抑制率为78.06%，在200 μg·mL-1时，抑制率达到80.48%，化合物1的抑制效果最好，其次是化合物3、6，而化合物5、7与阳性药相比差异不显著（P>0.05）。
化合物对人肺癌细胞NCI-H460经不同浓度作用24 h后细胞增殖抑制的影响如图16所示，5-FU在10 μg·mL-1 时，抑制率达到47.82%，化合物的抑制率极显著低于阳性药（P<0.01），化合物的抑制率在所设浓度范围内不呈线性关系，说明化合物对人肺癌细胞NCI-H460无抑制作用。
化合物对人乳腺细胞MCF-7经不同浓度作用24 h后细胞增殖抑制的影响如图17，5-FU在10 μg·mL-1时，抑制率为78.9%， 化合物3在100-400 μg·mL-1范围内与阳性药相比，抑制率显著高于阳性药（P<0.05），化合物1、6在50-400 μg·mL-1范围内与阳性药相比，抑制率显著高于阳性药（P<0.05）, 化合物5、7、8与阳性药相比无显著性差异。
化合物对人肝癌细胞HepG-2经不同浓度作用24h后细胞增殖抑制的影响如图18，5-FU在10 μg·mL-1时，抑制率为70.21%，化合物6、7在200-400 μg·mL-1与阳性药相比，抑制率显著高于阳性药（P<0.05），化合物1、3、8与阳性药相比无显著性差异（P>0.05），化合物在所设浓度范围抑制率随浓度的增加而增强。
化合物对细胞增殖抑制活性的IC50值结果如表2所示，从表2可以看出，化合物对四种肿瘤细胞增殖抑制活性大小分别为为：人胃癌 SGC-7901细胞：化合物6>化合物5>化合物3>化合物1>化合物8>化合物7；人***癌PC-3M细胞：化合物3>化合物1>化合物6>化合物7>化合物5>化合物8；人乳腺癌MCF-7：化合物6>化合物1>化合物3>化合物7>化合物5>化合物8；人肝癌HepG-2细胞：化合物6>化合物7>化合物3>化合物8>化合物1>化合物5。
Claims (4)
1. 一种草菇子实体活性成分，其化学名称为3β, 5α, 9α-三羟基麦角甾-7, 22-二烯-6-酮。
2.权利要求1所述的一种草菇子实体活性成分，其特征在于：它的化学结构为：
。
3.一种草菇子实体活性成分的制备方法，它包括：
1）取草菇干燥子实体粗粉，以95%乙醇为溶剂，按料液比1:4的量加入圆底烧瓶，在30℃下超声30 min，静置过夜，减压回收提取液，残渣用95%乙醇加热回流提取3次，每次3h，合并提取液，减压回收获得乙醇浸膏；
2）将步骤1）所述的乙醇浸膏用二氯甲烷、甲醇溶解，与硅胶按体积比1:1的量进行干法拌样，干法装柱，过100-200目150 mm × 305 mm的硅胶色谱柱，用氯仿-甲醇体积比（9:1、8：2、7：3、6：4、1：1）进行梯度洗脱，获得氯仿-甲醇（8：2）洗脱组分；3）将步骤2）所述的洗脱组分和200-300目的硅胶按体积比1:2的比例拌样，干法装柱，用体积比8:2的二氯甲烷-丙酮洗脱，经羟丙基葡聚糖凝胶Sephadex LH-20纯化， 经HPLC制备分离，条件为80%~100%甲醇，254 nm，10 ml/min，获得化合物3β, 5α, 9α-三羟基麦角甾-7, 22-二烯-6-酮。
4. 3β, 5α, 9α-三羟基麦角甾-7, 22-二烯-6-酮在治疗胃癌、人乳腺癌或人肝癌药物中的应用。
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