CN114672511A

CN114672511A - 玉米ZmBES1/BZR1-3基因在增加植物种子产量中的应用

Info

Publication number: CN114672511A
Application number: CN202210270506.9A
Authority: CN
Inventors: 于好强; 冯文奇; 刘媛; 付凤玲; 杨青青; 李晚忱
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2022-03-18
Filing date: 2022-03-18
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2042-03-18
Also published as: CN114672511B

Abstract

本发明公开了玉米ZmBES1/BZR1‑3基因在增加植物种子产量中的应用，本发明利用玉米幼苗叶片克隆出玉米ZmBES1/BZR1‑3基因，并从转基因拟南芥和水稻的表型特征对该基因的功能进行了研究，为水稻高产育种及提高水稻经济效益等提供新选择。

Description

玉米ZmBES1/BZR1-3基因在增加植物种子产量中的应用

技术领域

本发明涉及玉米ZmBES1/BZR1-3基因在增加植物种子产量中的应用，属于基因工程领域。

背景技术

粮食产量一直是人民关注的重要内容，提高粮食产量对我国经济发展和粮食安全意义重大。产量是一个复杂的数量性状，受株型、穗粒、生育期等多种因素影响。水稻是主要的粮食作物，水稻单株产量的形成主要决定于有效穗数、每穗粒数、千粒重等性状，千粒重在产量构成因子中是遗传力最高的性状，是由粒形和充实度决定的，而粒形是由粒长、粒宽和粒厚决定的。现有的技术中主要是一些水稻自有基因对水稻产量的应用，GS3是第一个通过图位克隆方法获得的粒长和粒重的主效QTL，对粒宽和粒厚有微弱作用，同时发现GS3蛋白含有一个植物特有的器官大小调控结构域(OSR)，该结构域缺失或突变后导致形成大粒，推出OSR负调控粒形大小。DEP1也是G蛋白的一个亚基，不仅影响穗形还影响粒形。QTL GL7/GW7编码一个LONGIFOLIA蛋白，上调表达GW7可以减缓横向细胞***促使形成细长谷粒。qSW5/GW5是水稻第5染色体上控制水稻粒宽和粒重的基因，GW5可以和多聚泛素相互作用通过泛素蛋白酶体途径调节粒宽和粒重。GW2负调控水稻粒宽，增加GW2的表达可以导致种子粒宽变窄。

近年来，开始逐渐通过将单一玉米基因引入水稻植株中提高水稻产量，通常是通过提高水稻的光合速率增加水稻产量，将C4光合相关酶引入水稻等C3作物中，例如PEPCase是C4途径的关键酶，将玉米PEPC基因成功转入水稻中，这些转基因水稻的CO2补偿点和光呼吸速率显著降低，表观净光合速率提高，产量也有不同程度的提高。而对光合作用之外的其他基因研究相对较少。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供玉米ZmBES1/BZR1-3基因在增加植物种子产量中的应用，本发明利用玉米幼苗叶片克隆出玉米ZmBES1/BZR1-3基因，并从转基因拟南芥和水稻的表型特征方面对该基因的功能进行了研究，为水稻高产育种及提高水稻经济效益等提供新选择。

玉米ZmBES1/BZR1-3基因在增加植物种子产量中的应用，所述玉米ZmBES1/BZR1-3基因的核苷酸序列如SED ID NO.1所示。

玉米ZmBES1/BZR1-3基因在改善植物种子表型中的应用，所述玉米ZmBES1/BZR1-3基因的核苷酸序列如SED ID NO.1所示。

进一步的，上述植物种子表型指种子粒长、粒宽和千粒重。

进一步的，上述植物指拟南芥或水稻中的一种。

一种培育高产植物的方法：上调植物中玉米ZmBES1/BZR1-3基因的表达，得到ZmBES1/BZR1-3基因过表达的植株，从而获得高产植物。

进一步的，上述方法的具体步骤：在玉米幼苗叶片中分离获得玉米ZmBES1/BZR1-3基因，设计玉米ZmBES1/BZR1-3基因的扩增引物，通过PCR方法扩增玉米ZmBES1/BZR1-3基因的cDNA序列，然后利用ZmBES1/BZR1-3的cDNA序列构建菌介导35S-ZmBES1/BZR1-3-eGFP载体，利用农杆法将前述载体转化入目标植物，提高ZmBES1/BZR1-3基因的表达，得到ZmBES1/BZR1-3基因过表达的植株，从而获得高产植物。

进一步的，上述玉米ZmBES1/BZR1-3基因的核苷酸序列如SED ID NO.1所示。

进一步的，上述玉米ZmBES1/BZR1-3基因的扩增引物的核苷酸序列如SED ID NO.2和SED ID NO.3所示。

进一步的，上述35S-ZmBES1/BZR1-3-eGFP载体的核苷酸序列如SED ID NO.10所示。

进一步的，上述植物指拟南芥或水稻中的一种。

有益效果：

发明首次提供一种利用玉米ZmBES1/BZR1-3基因来提高拟南芥和水稻种子产量的方法，本方法通过提高玉米ZmBES1/BZR1-3基因的表达来提高拟南芥或水稻产量，为培养高产水稻优良品种提供了一种新的分子育种途径，具有广阔的应用前景。本发明可显著增加拟南芥或水稻植株的粒宽、粒长和千粒重。

附图说明

图1纯合转基因拟南芥种子表型。

图2转基因拟南芥种子粒长、粒宽。

图3转基因水稻种子表型。

图4转基因水稻种子粒长、粒宽。

图5纯合转基因水稻千粒重。

具体实施方式

为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。

实施例

1.基因克隆及载体构建

取五叶期玉米B73幼苗叶片，液氮速冻研磨，使用总RNA提取试剂盒Trizol(TaKaRa)并按照其说明书提取总RNA。用PrimeScript^TM RT regeant Kit试剂盒(Takara公司)，以总RNA为模板进行cDNA的合成。利用Primer 5.0设计克隆引物，以B73 cDNA为模板，具体PCR引物如表1。使用PrimerStar(Takara公司)高保真酶进行扩增，PCR扩增反应体系如表2，温度循环程序为：94℃，3min；98℃，10s，最适退火温度10s；72℃，20s；30个循环；72℃5min；4℃保持。

表1 ZmBES1/BZR1-3克隆引物

表2 PCR扩增反应体系

1.1转化拟南芥载体35S-ZmBES1/BZR1-3-eGFP构建

根据双子叶植物表达载体pCAMBIA2300-35S-eGFP多克隆位点,在其上游引物入BamH I酶切位点，下游引物引入Sal I位点，具体序列如下：

表3构建pCAMBIA2300-35S-eGFP载体引物

按表1所示反应体系加样，进行扩增。温度循环程序为：94℃3min；98℃10s，最适退火温度10s，72℃20s，30个循环；72℃5min；4℃保持。

对PCR产物进行回收。将回收产物，pCAMBIA2300-35S-eGFP质粒进行双酶切，按表反应体系进行加样。将酶切体系混匀，置于30℃水浴锅中，酶切6～8h，酶切产物加入上样缓冲液后，直接电泳，回收酶切产物，使用ClonExpress II One Step Cloning Kit(诺唯赞)，反应体系如表5，反应条件：37℃30mins。

表4双酶切反应体系

表5连接体系

连接产物转化大肠杆菌，并进行菌落PCR检测。提取重组质粒经限制性内切酶酶切鉴定之后，组质粒菌液送测序公司进行DNA的序列测序鉴定，经测序正确的质粒将于下一步拟南芥转化。

1.2转化水稻载体构建

根据单子叶植物表达载体pCAMBIA1300-35S-eGFP多克隆位点,在其上游引物入Hind III酶切位点，下游引物引入BamH I位点，具体序列如表6。利用PrimerStar(Takara公司)高保真酶进行扩增，PCR扩增反应体系如表2。之后对PCR产物进行回收。

表6构建pCAMBIA1300-35S-ZmBES1/BZR1-3-eGFP载体引物

将表达载体pCAMBIA1300-35S-eGFP质粒进行双酶切，按使用ClonExpress II OneStep Cloning Kit(诺唯赞)，反应体系如表5，反应条件：37℃30mins。

表44反应体系进行加样。将酶切体系混匀，置于30℃水浴锅中，酶切6～8h，酶切产物加入上样缓冲液后，直接电泳，回收酶切产物，使用ClonExpress II One Step CloningKit(诺唯赞)，反应体系如表5，反应条件：37℃30mins。

连接产物转化大肠杆菌，并进行菌落PCR检测。提取重组质粒经限制性内切酶酶切鉴定之后，组质粒菌液送测序公司进行DNA的序列测序鉴定，经测序正确的质粒将于下一步水稻转化。

2.拟南芥、水稻转化及阳性鉴定

2.1利用花絮侵染法转化拟南芥

探索玉米ZmBES1/BZR1-3的功能，我们用农杆菌介导的花絮浸染法将pCAMBIA2300-35S-ZmBES1/BZR1-3-eGFP载体转化拟南芥BES1突变体(bes1-D)。

2.1.1花序浸染法转化

(1)取含有重组质粒的农杆菌，在含有Kana和Rif的YEP平板上划线，28℃培养2～3d。

(2)挑取农杆菌单菌落接种在3mL含Kana和Rif的YEP液体培养基中，28℃，200r/min，振荡过夜培养。

(3)在100mL液体YEP培养基中(含Kana和Rif)，接种1mL过夜培养的起始农杆菌菌液，28℃振荡培养至菌液OD₆₀₀值为1.2～1.5。

(4)4℃5000r/min离心10min收集细胞，用5％蔗糖溶液悬浮菌体并调OD₆₀₀值至0.8～1.0，按1％～2％的比例加入表面活性剂silwetL-77。

(5)用拟南芥专用营养土盆栽培养拟南芥BES1突变体，开花后修剪已形成果荚和已经开放的花，用上述侵染液浸泡花序1.5～2.0min，黑暗培养10h。

(6)在适宜的条件下培养3～4周，收集种子，进行下一步筛选处理。

2.1.2转基因株系筛选

(1)将收获的侵染后种子，分装至1.5mL的EP管，用500μL的70％酒精浸泡30s。

(2)吸掉酒精后，用500μL的10％次氯酸钠浸泡5～10min，期间不断摇晃离心管以至种子与次氯酸钠充分接触。

(3)用灭菌水清洗种子4～6次，待种子沉下后，弃上层ddH₂O；200μL的0.1％琼脂水悬浮种子。

(4)将种子点播至含40mg/L的卡那霉素(Kana)的1/2MS培养基中培养。

(5)重复上述步骤，收获转化的拟南芥T₂代种子消毒后，播种于含有卡那霉素的1/2MS固体培养基上，7～8d后，全部为绿色健壮的植株即纯合转化体，而非纯和转化体则表现为3:1的分离(正常生长和黄化死亡植株所成的比例)。奠定为纯合的T₃代种子用作进一步分析。

2.2.水稻转化

将构建好的载体送未米生物公司(南京)转化水稻野生型“日本晴”(NIP)。

2.2.1基因组PCR鉴定

对获得的阳性株系进行DNA提取并PCR鉴定

(1)取植物新鲜组织100mg，加入液氮充分碾磨。加入400μL缓冲液FP1和6μL的RNaseA(10mg/mL)，漩涡振荡1min，室温放置10min。

(2)加入130μL缓冲液FP2，充分混匀，涡旋振荡1min，12000r/min(13400×g)离心5min，将上清转移至新的离心管中。

(3)可选步骤：将上清液再次12000r/min(13400×g)离心5min，将上清转移至新的离心管中。

(4)向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，此时会出现絮状基因组DNA。12000r/min(13400×g)离心2min，弃上清，保留沉淀。

(5)加入600μL 70％乙醇，涡旋振荡5s，12000r/min(13400×g)离心2min，弃上清。

(6)重复步骤(6)。

(7)开盖倒置，室温5～10min，彻底晾干残余的乙醇。

(8)加入适量洗脱缓冲液TE，65℃水浴10～60min溶解DNA，期间颠倒混匀数次助溶，最终得到DNA溶液。

(9)使用PCR引物如表8，以提取的基因组DNA为模板进行PCR检测，程序为94℃，3min；94℃30s，最适退火温度30s，72℃60s/kb，35个循环；72℃5min；4℃保存。

表7转基因水稻检测引物

(10)收获转化的水稻种子T₂代，播种后检测后代全为阳性株系的种子用作进一步分析。

3.转基因株系产量分析

3.1拟南芥种子表型鉴定

将纯合的转基因拟南芥株系L3-1、L3-10和突变体(bes1-D)用5％次氯酸钠溶液消毒后，播种于含有1/2MS培养基上，15d后移栽至含有营养土：蛭石＝3:1土壤的50mm×50mm的花盆中，每盆播种4株，放在相同条件下培养直收种，测量种子粒长、粒宽。

3.2水稻种子表型鉴定

将纯合的转基因水稻株系L3-1和L3-10和野生型(NIP)播种于水田中，相同条件下培养直收种，测量种子粒长、粒宽和千粒重。

4.转基因株系产量分析

4.1转基因拟南芥产量分析

通过抗性筛选，确定目的基因ZmBES1/BZR1-3在拟南芥稳定表达，对纯合转基因拟南芥的种子粒长、粒宽分析(图1)，结果表明过表达株系L3-10种子的粒长极显著增加，L3-1和L3-10种子粒宽显著增大(图2，*与**分别表示p<0.05，p<0.01)。

4.2转基因水稻产量分析

通过PCR对目的基因检测，确定阳性株系。对阳性株系的粒长、粒宽和千粒重分析(图3)，结果表明过表达株系R3-3和R3-4的粒长极显著增加，粒宽无明显变化(图4，*与**分别表示p<0.05，p<0.01)。千粒重相比于对照NIP显著增加(图5，*与**分别表示p<0.05，p<0.01)。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 玉米ZmBES1/BZR1-3基因在增加植物种子产量中的应用

<130> 2022

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1311

<212> DNA

<213> 序列

<400> 1

atggagggag gggtaggagc gggaggaagt cggggtgatg agggttgggc tagggcagga 60

gacggggacg ggaagaacgg gaagcagggg acggtgcgcg agcgcgagcc gtcgtggcgt 120

gagcgggaga acaacaacca gcgccgggag cgccgtcgtc gggtggtcgc gtcgaggatc 180

ttcgccgggc tgcgcagata cggcaactac gccctcccca ggcactacga caacaacgtc 240

gtgctcatgg cgctctgcga ggaggccggc tggaccgtgg aggccgacgg caccacctac 300

cgcaggggag gaaagcctcc ggcaggtgat cagcatatgg ccgacattgg cgggtctgct 360

gctccggtga cccaccaggg agcttccgac ggtgggggca gcgctagcgg cggagccgac 420

cccgttccgg cgtggctcaa gaacctgtcc aagcagctca gcgactcgtc gtaccccaac 480

tacttcgcga gctcctccag ctccaacgcg ccggcgacgc cgcacaacgg ctcgccatcc 540

tcgtccccgc ggcgcctccg caagatggcg cgctactcct ccccgccgtc caccccgccg 600

ccgagcccgg cgagggcctc cgacatgctg ccgccatggg ccatacgcga tggtggcggc 660

agccgctact ccttccaggc gttctcattc cacgggagcg gcgatgggga gcaggcgggc 720

gcgaaggagg gggagggaaa aggaggagga gaaggtgcaa cgccacgagg aagaggttgc 780

agccacatat gccggggtgc aagccatgag gaggaggtct cgagcataga tgatggggtg 840

caggaccatg agaaggtcca ggcggatgac gagaccatcg aggctcctgc ctttcgacgg 900

aggggcactc ggaagggcca ctttgtcctt cctttgtcag agcctgcaca atcagatgct 960

cggagacgct atcgtgtgga acctgaggct caggagcatg ccgaccaagt attagagaaa 1020

aacgtgaaga aggttgtgaa tgtgtacatg aagcgtcgag gatattctat aaataacttt 1080

cggcaatatt cagatgtcta cttgaatgtg gaccagtaca tagagataca ggagtcttac 1140

aggcaggaga tagttaggaa atattctatg tttatcggtg tgatcgattc gacggagtta 1200

cggtctcgtg ggctgcttct tcgttgcagg caggttatgg tagcagttgt tagtcggggg 1260

ctccgagcat gggaggagtc tatgagggag cagcaagaaa ggttttcgtg a 1311

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcacgaaaac ctttcttgct gc 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcctctagag tcgacatgga gggaggggta ggagcgggag gaag 44

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tggagaggac agcccaagct tatggaggga ggggtaggag c 41

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<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

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ctcaccatga ccggtggatc cgaaaacctt tcttgctgct ccc 43

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

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<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tcacgaaaac ctttcttgct gc 22

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<211> 2840

<212> DNA

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cgaacagttc atacagagtc tcttacgact caatgacaag aagaaaatct tcgtcaacat 120

ggtggagcac gacacgcttg tctactccaa aaatatcaaa gatacagtct cagaagacca 180

aagggcaatt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg 240

cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg 300

ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa 360

agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc 420

aaagcaagtg gattgatgtg atatctccac tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta 480

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cccggggatc ctctagagtc gacatggagg gaggggtagg agcgggagga agtcggggtg 600

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gcgagcgcga gccgtcgtgg cgtgagcggg agaacaacaa ccagcgccgg gagcgccgtc 720

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cctccccgcc gtccaccccg ccgccgagcc cggcgagggc ctccgacatg ctgccgccat 1200

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gcggcgatgg ggagcaggcg ggcgcgaagg agggggaggg aaaaggagga ggagaaggtg 1320

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tctcgagcat agatgatggg gtgcaggacc atgagaaggt ccaggcggat gacgagacca 1440

tcgaggctcc tgcctttcga cggaggggca ctcggaaggg ccactttgtc cttcctttgt 1500

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atgccgacca agtattagag aaaaacgtga agaaggttgt gaatgtgtac atgaagcgtc 1620

gaggatattc tataaataac tttcggcaat attcagatgt ctacttgaat gtggaccagt 1680

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ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg 1980

gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc 2040

tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc 2100

gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg 2160

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tggacgagct gtacaagtaa ctgcaggcat gccagggctc tcaatggagt ttgaatcaaa 2640

tcttccagct gctttaatga gatatgcgag acgcctatga tcgcatgata tttgctttca 2700

attctgttgt gcacgttgta aaaaacctga gcatgtgtag ctcagatcct taccgccggt 2760

ttcggttcat tctaatgaat atatcacccg ttactatcgt atttttatga ataatattct 2820

ccgttcaatt tactgattga 2840

Claims

1.玉米ZmBES1/BZR1-3基因在增加植物种子产量中的应用，其特征在于，所述玉米ZmBES1/BZR1-3基因的核苷酸序列如SED ID NO.1所示。

2.玉米ZmBES1/BZR1-3基因在改善植物种子表型中的应用，其特征在于，所述玉米ZmBES1/BZR1-3基因的核苷酸序列如SED ID NO.1所示。

3.如权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，上述植物指拟南芥或水稻中的一种。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的植物种子表型指种子粒长、粒宽和千粒重。

5.一种培育高产植物的方法，其特征在于，上调植物中玉米ZmBES1/BZR1-3基因的表达，得到ZmBES1/BZR1-3基因过表达的植株，从而获得高产植物。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，具体步骤：在玉米幼苗叶片中分离获得玉米ZmBES1/BZR1-3基因，设计玉米ZmBES1/BZR1-3基因的扩增引物，通过PCR方法扩增玉米ZmBES1/BZR1-3基因的cDNA序列，然后利用ZmBES1/BZR1-3的cDNA序列构建35S-ZmBES1/BZR1-3-eGFP载体，利用农杆菌介导法将前述载体转化入目标植物，提高ZmBES1/BZR1-3基因的表达，得到ZmBES1/BZR1-3基因过表达的植株，从而获得高产植物。

7.如权利要求5-6任一项所述的方法，其特征在于，所述的玉米ZmBES1/BZR1-3基因的核苷酸序列如SED ID NO.1所示。

8.如权利要求5-6任一项所述的方法，其特征在于，所述的玉米ZmBES1/BZR1-3基因的扩增引物的核苷酸序列如SED ID NO.2和SED ID NO.3所示。

9.如权利要求5-6任一项所述的方法，其特征在于，上述植物指拟南芥或水稻中的一种。