CN117660485A - 拟南芥erf012基因在调控种子萌发中的应用 - Google Patents

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唐宁
黄榆普
周巧玲
于澳飞
彭会敏
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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及拟南芥ERF012基因在调控种子萌发中的应用。本发明通过基因工程技术、农杆菌花序侵染法转化野生型拟南芥，获得了ERF012基因的超表达和突变体株系，首次验证并公开了ERF012基因调控种子萌发的功能。本发明通过将抑制ERF012基因的CRISPR载体导入目的植物，得到其突变体转基因植物，其在种子萌发阶段对ABA耐受性较野生型株系较高，说明抑制ERF012基因表达能够提高植物种子萌发阶段对于ABA的耐受性，这能够为调控植物ABA耐受性分子育种提供基因资源。

Description

拟南芥ERF012基因在调控种子萌发中的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及拟南芥ERF012基因在调控种子萌发中的应用。
背景技术
种子萌发是植物生活周期中对环境最为敏感阶段之一，对农业生产至关重要。如何在逆境下控制萌发时机，使种子适时整齐萌发，是作物高产稳产的基础，也是植物逆境生物学领域重要研究方向和前沿问题。
种子萌发过程受内、外部等多种因素共同调控，其中植物激素脱落酸(Abscisicacid，ABA)是调控种子萌发主要信号物质。ABA合成代谢、信号传导及相关转录调控网络在种子萌发过程中发挥重要作用。
乙烯响应因子(ethylene response factor，ERF)属于AP2/ERF转录因子超家族，在植物中广泛分布。已有研究发现很多ERF成员参与调控植物生长发育(花和果实发育等)和多种环境胁迫响应(高盐、干旱等)，但ERF成员是否参与调控种子萌发及相关机制尚不清楚。本发明团队课题组前期研究发现ERF012基因(ERF家族DREBA-5亚家族成员)在拟南芥的地上部和根中均有表达，进一步地研究发现在苗期生长阶段，ERF012基因参与调控根系生长发育、激素和逆境应答等多种生物学过程，但其是否参与调控种子萌发过程尚不明确。基于此，本发明团队继续探究ERF012基因对种子萌发过程的影响，这对种子适时整齐萌发、保障作物高产稳产具有重要意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供拟南芥ERF012基因在调控种子萌发中的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
拟南芥ERF012基因在调控种子萌发中的应用，在脱落酸存在条件下所述拟南芥ERF012基因在促进或抑制种子萌发中的应用，所述ERF012基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步地，所述ERF012基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步地，在脱落酸存在条件下，抑制拟南芥ERF012基因的表达促进种子萌发。
进一步地，在脱落酸存在条件下，超表达拟南芥ERF012基因抑制种子的萌发。
本发明的目的之二在于提供一种提高植物种子萌发能力的培育方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种提高植物种子萌发能力的培育方法，包括在脱落酸存在条件下，抑制目的植物中ERF012基因的表达。
进一步地，所述目的植物为拟南芥。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明通过基因工程技术、农杆菌花序侵染法转化野生型拟南芥，获得了促进ERF012基因的超表达株系，抑制ERF012基因的突变体株系，首次验证并公开了ERF012基因调控种子萌发的功能。本发明通过将ERF012基因导入目的植物，得到超表达转基因植物，其在种子萌发阶段对ABA耐受性较野生型株系较低，说明超表达ERF012抑制种子萌发。本发明还通过试验发现将抑制ERF012基因表达的CRISPR载体导入目的植物，得到突变体转基因植物，其在种子萌发阶段对ABA耐受性较野生型株系较高，说明抑制ERF012基因表达能够提高植物种子萌发阶段对于ABA的耐受性，这说明本发明能够为调控植物ABA耐受性分子育种提供基因资源。
附图说明
图1为Pro ERF012:GUS纯合种子萌发处理至不同阶段的GUS染色结果图；
图2为ABA处理后，ERF012基因的表达情况；
图3为ABA处理后，CRISPR突变体株系、超表达株系的种子萌发和幼苗形态建成表型；
图4为ABA处理后，CRISPR突变体株系、超表达株系的种子萌发率情况；
图5为ABA处理后，CRISPR突变体株系、超表达株系的种子绿叶率情况；
图6为ABA处理后，CRISPR突变体株系、超表达株系地上部鲜重测定情况。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案做进一步的解释说明。
以下实施例中，采用的原料和制备方法如无特别说明，均为本领域常规的材料和技术。
下述实施例涉及到的部分生物材料、试剂等情况简要介绍如下：
引物合成及测序由武汉和郑州擎科生物公司完成；
T4 DNA连接酶购买于美国赛默飞公司Thermo ScientificTMT4 DNA连接酶(5U/μL)，EL0011；
同源重组酶One Step Seamless Cloning kit购买于北京艾德莱生物公司，2×OneStep Cloning，CV1901；
总RNA提取试剂盒购买于上海普洛麦格公司EastepTMSuper Total RNAExtraction Kit，LS1040；
逆转录试剂盒购买于诺唯赞公司IIQ RT SuperMix for qPCR(+g DNAwiper)，R223-01；
荧光定量试剂盒购买于北京艾德莱生物公司2×SYBR Green qPCR Mix(PC3302)；
MS培养基购买于北京酷来搏科技有限公司；
GUS染色试剂盒购买于Biosharp公司(BL622A-03)；
实施例中拟南芥ERF012基因的核苷酸/氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示：
SEQ ID NO.1
ATGGTGAAACAAGAACGCAAGATCCAAACCAGCAGCACAAAAAAGGAAATGCCTTTGTCATCATCACCATCTTCTTCTTCTTCTTCATCTTCTTCCTCGTCTTCGTCTTCGTGTAAGAACAAGAACAAGAAGAGTAAGATTAAGAAGTACAAAGGAGTGAGGATGAGAAGTTGGGGATCATGGGTCTCTGAGATTAGGGCACCAAATCAAAAGACAAGGATTTGGTTAGGTTCTTACTCAACAGCTGAAGCAGCTGCTAGAGCTTACGATGTTGCACTCTTATGTCTCAAAGGCCCTCAAGCCAATCTCAACTTCCCTACTTCTTCTTCTTCTCATCATCTTCTTGATAATCTCTTAGATGAAAATACCCTTTTGTCCCCCAAATCCATCCAAAGAGTAGCTGCTCAAGCTGCCAACTCATTTAACCATTTTGCCCCTACTTCATCAGCCGTCTCGTCACCGTCCGATCATGATCATCACCATGATGATGGGATGCAATCTTTGATGGGATCTTTTGTGGACAATCATGTGTCTTTGATGGATTCAACATCTTCATGGTATGATGATCATAATGGGATGTTCTTGTTTGATAATGGAGCTCCATTCAATTACTCTCCTCAACTAAACTCGACGACGATGCTCGATGAATACTTCTACGAAGATGCTGACATTCCGCTTTGGAGTTTCAATTAA
SEQ ID NO.2
MVKQERKIQTSSTKKEMPLSSSPSSSSSSSSSSSSSSCKNKNKKSKIKKYKGVRMRSWGSWVSEIRAPNQKTRIWLGSYSTAEAAARAYDVALLCLKGPQANLNFPTSSSSHHLLDNLLDENTLLSPKSIQRVAAQAANSFNHFAPTSSAVSSPSDHDHHHDDGMQSLMGSFVDNHVSLMDSTSSWYDDHNGMFLFDNGAPFNYSPQLNSTTMLDEYFYEDADIPLWSFN
实施例1
实施例1探究ERF012基因的表达模式，具体过程如下：
(1)通过ERF012自身启动子启动GUS基因的表达，获得Pro ERF012:GUS稳定遗传材料，具体过程如下：
①构建由ERF012基因的启动子驱动的GUS基因的表达载体(Pro ERF012:GUS)：根据ERF012基因的启动子核苷酸序列设计引物，引物序列如下：
pERF012-F：GGTCGACGGATCCCCGTCATTTGTTGGGAACTGGTACGGA(SEQ ID NO:3)；
pERF012-R：AGGGACTGACCACCCTGTGTACGTACAGGCTTTGTAGAGTG(SEQ ID NO:4)；
②以拟南芥野生型Col-0 DNA为模板，进行PCR扩增，纯化回收PCR产物(限制性内切酶SmaⅠ进行酶切Dx2181载体、2x one step cloning Mix同源重组酶连接目的片段和Dx2181载体)，获得Pro ERF012:GUS重组载体；
③将Pro ERF012:GUS重组载体转化至农杆菌GV3101感受态中，再通过花序侵染法转化至拟南芥野生型Col-0中，得到Pro ERF012:GUS表达株系；
④将收到侵染后的Pro ERF012:GUS表达株系的种子做为T0代，将T0代种子在含有潮霉素(50mg/L)的培养基上培养，挑选长根的苗子种在营养土培养基质中，单株收到的种子为T1代，将T1代种子在含有潮霉素的培养基上培养，挑选后代长根：不长根分离比为3：1的株系中的长根苗子种营养土培养基质中，单株收到的种子为T2代，将T2代种子在含有潮霉素的培养基上培养，挑选后代均是长根的株系种在营养土培养基质中，收到的种子即为ProERF012:GUS表达株系的纯合转基因的种子，命名为Pro ERF012:GUS。
(2)将Pro ERF012:GUS纯合种子萌发处理至吸胀阶段(浸水3d)、萌动阶段、萌发1～3日龄幼苗，采用GUS试剂盒染色，结果如图1所示。
图1为将Pro ERF012:GUS纯合种子萌发处理至不同阶段的GUS染色结果图，标尺为100μm。由图1可知，由Pro ERF012驱动的GUS基因在浸水吸胀种子和萌动阶段胚中表达量较低，但发芽之后表达量显着增加，这说明ERF012参与调控种子萌发和萌发后幼苗生长过程。
实施例2
实施例2探究ABA处理对ERF012基因的转录水平的影响，具体过程如下：
(1)将灭菌、冷处理3d的野生型Col-0种子播种在1/2MS培养基中正常生长7日，然后转移到含有100μM ABA的1/2MS培养基中分别于培养0h、1h、6h、12h取样；
(2)使用总RNA提取试剂盒提取各样品的总RNA，逆转录试剂盒进行cDNA的合成，采用荧光定量试剂盒(qRT-PCR检测)检测各样品中ERF012的表达水平，其中qRT-PCR检测的引物序列如下：
Actin qRT-PCR-F：ACAGTGTCTGGATCGGTGGTTC(SEQ ID NO:5)；
Actin qRT-PCR-R：TGCCTCATCATACTCAGCCTTG(SEQ ID NO:6)；
ERF012 qRT-PCR-F：ACTCATTTAACCATTTTGCCCC(SEQ ID NO:7)；
ERF012 qRT-PCR-R：GATCCCATCAAAGATTGCATCC(SEQ ID NO:8)；结果如图2所示。
图2为经ABA处理后，各样品中ERF012基因表达情况。由图2可知，相较于对照组，ERF012基因在ABA处理下表达量降低，这说明ABA处理抑制ERF012基因的表达。
实施例3
实施例3构建抑制ERF012基因表达的CRISPR突变体株系、ERF012基因超表达株系，具体过程如下：
(1)构建抑制ERF012基因表达的重组载体，获得抑制ERF012基因表达的CRISPR突变体：
①利用网站http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch筛选含有酶切位点(离PAM/NGG 3bp处)的两个靶点，靶点序列分别为GTTGAGGAGAGTAATTGAA；TTACACGAAGACGAAGACG，利用两个靶点设计四条引物，引物序列如下：
ERF012-DT1-BsF：ATATATGGTCTCGATTGGTTGAGGAGAGTAATTGAAGTT(SEQ ID NO:9)；
ERF012-DT1-F0：TGGTTGAGGAGAGTAATTGAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(SEQ ID NO:10)；
ERF012-DT2-R0：AACCGTCTTCGTCTTCGTGTAACAATCTCTTAGTCGACTCTAC(SEQ ID NO:11)；
ERF012-DT2-BsR：AACCGTCTTCGTCTTCGTGTAACAATCTCTTAGTC(SEQ ID NO:12)；
②以中间载体pCBC-DT1T2(含有guid RNA Scaffold+U6-26 terminator+U6-29promoter元件)载体为模板，进行四引物PCR扩增。其中，引物ERF012-DT1-BsF/ERF012-DT2-BsR浓度为10μM，ERF012-DT1-F0/ERF012-DT2-R0浓度为0.5μM；
③纯化回收PCR产物，获得抑制ERF012基因表达的重组载体；按照表1配置酶切连接体系，按照表2设置反应程序；
表1
表2
④抑制ERF012基因表达的CRISPR重组载体转化至农杆菌GV3101感受态中，再通过花序侵染法转化至拟南芥野生型Col-0中，获得抑制ERF012基因表达的突变体株系；
⑤将收到侵染后的抑制ERF012基因表达的CRISPR突变体株系的种子做为T0代，用简易绿光灯和红光滤光玻璃挑选发红光的T0代种子，将含有红光的种子种在营养土培养基质中，对苗子进行提取DNA，对含有靶点在内的序列进行PCR扩增，PCR片段送公司进行测序，检测突变类型。编辑过的植株单株收到的种子为T1代，对T1代种子进行观察，红光种子：不发光种子分离比为3：1的株系中将不发红光种子播种在营养土培养基质中，对苗子进行突变类型检测。对编辑的纯和单株收到的种子为T2代，收到的种子即为抑制ERF012基因表达的纯合转基因突变体株系的种子，分别命名为CR2、CR7；
⑥对抑制ERF012基因表达的转基因株系进行突变类型检测的引物序列如下：
ERF012编辑检测-F：CATTACCATGGTGAAACAAGAACG(SEQ ID NO:13)；
ERF012编辑检测-R：CCGTCGGATTAATTGAAACTCCA(SEQ ID NO:14)；
(2)构建ERF012基因的超表达载体，获得ERF012基因超表达株系：
①构建35S驱动的ERF012超表达载体(35S::ERF012)：根据ERF012核苷酸序列设计引物，引物序列如下：
ERF012-F：TCCCCCCGGGATGGTGAAACAAGAACGCAAGATCC(SEQ ID NO:15)
ERF012-R：CCGCTCGAGTTAATTGAAACTCCAAAGCGGAATGT(SEQ ID NO:16)
②以拟南芥野生型Col-0cDNA为模板，进行PCR扩增，纯化回收PCR产物(限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ进行酶切、T4 DNA连接酶连接目的片段和pBin35SRed载体)，获得ERF012基因超表达重组载体；
③将超表达重组载体转化至农杆菌GV3101感受态中，再通过花序侵染法转化至拟南芥野生型Col-0中，得到ERF012基因超表达株系；
④将收到侵染后含有ERF012基因超表达株系的种子做为T0代，用简易绿光灯和红光滤光玻璃挑选发红光的T0代种子进行，将含有红光的种子种在营养土培养基质中，单株收到的种子为T1代，对T1代种子进行观察，红光种子：不发光种子分离比为3：1的株系中的红光种子播种在营养土培养基质中，单株收到的种子为T2代，对T2代种子进行红光观察，挑选后代均是红光种子的株系种在营养土培养基质中，收到的种子即为ERF012基因超表达的纯合转基因株系的种子，分别命名为OE4-6、OE7-6；
⑤对ERF012基因超表达的纯合转基因株系的进行qRT-PCR检测，引物序列如下：
Actin qRT-PCR-F：ACAGTGTCTGGATCGGTGGTTC(SEQ ID NO:5)；
Actin qRT-PCR-R：TGCCTCATCATACTCAGCCTTG(SEQ ID NO:6)；
ERF012 qRT-PCR-F：ACTCATTTAACCATTTTGCCCC(SEQ ID NO:7)；
ERF012 qRT-PCR-R：GATCCCATCAAAGATTGCATCC(SEQ ID NO:8)；
实施例4
实施例4探究ABA处理下，抑制ERF012基因的CRISPR突变体株系、ERF012基因超表达株系的萌发能力情况，具体过程如下：
挑选饱满、大小一致、同一时期收获的野生型Col-0，超表达株系(OE4-6、OE7-6)，CRISPR突变体株系(CR2、CR7)的种子，灭菌清洗后于4℃冰箱低温处理3d，分别播种至对照组培养基(Mock)、含0.5μM ABA的培养基、含1μM ABA的培养基中，从第2天开始记录种子萌发数，第3天开始记录出现子叶数，第11天统计各实验组幼苗地上部鲜重，结果如图3～6所示。
由图3～5可知，在对照培养基上，Col-0株系、超表达株系和突变体株系种子的萌发率和绿叶率无明显差异，在0.5μM、1μM ABA的培养基上超表达株系种子的萌发率和绿叶率明显低于Col-0株系，而突变体株系种子萌发率和绿叶率明显高于Col-0株系，这说明突变体株系对ABA胁迫不敏感。
由图6可知，在对照培养基上，Col-0株系、超表达株系和突变体株系的地上部鲜重无明显差异，而在0.5μM ABA的培养基上，超表达株系的地上部鲜重显着低于Col-0株系，而突变体株系的地上部鲜重显着高于Col-0株系，这说明突变体株系对ABA胁迫不敏感。可见，在ABA胁迫下，ERF012基因负调控种子的萌发能力。
综上，本发明通过基因工程技术构建，采用农杆菌花序侵染法转化野生型拟南芥，获得了促进ERF012基因的超表达株系，抑制ERF012基因的突变体株系，首次验证并公开了ERF012基因调控种子萌发的功能。本发明通过将ERF012基因导入目的植物，得到超表达转基因植物，其在种子萌发阶段对ABA耐受性较野生型株系较低，说明超表达ERF012抑制种子萌发。本发明还通过试验发现将抑制ERF012基因的表达的CRISPR载体导入目的植物，得到转基因植物，其在种子萌发阶段对ABA耐受性较野生型株系较高，说明抑制ERF012基因表达能够提高植物种子萌发阶段对于ABA的耐受性，这说明本发明能够为调控植物ABA耐受性分子育种提供基因资源。
以上仅为本发明的优选实施例，不限于上述的举例，对于本领域的技术人员来说，在本发明的原理下，可以有各种更改和变化。所作的任何修改、改进等，均应视为在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.拟南芥ERF012基因在调控种子萌发中的应用，其特征在于，在脱落酸存在条件下所述拟南芥ERF012基因在促进或抑制种子萌发中的应用，所述ERF012基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述拟南芥ERF012基因在调控种子萌发中的应用，其特征在于，所述ERF012基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述拟南芥ERF012基因在调控种子萌发中的应用，其特征在于，在脱落酸存在条件下，抑制拟南芥ERF012基因的表达促进种子萌发。
4.根据权利要求1所述拟南芥ERF012基因在调控种子萌发中的应用，其特征在于，在脱落酸存在条件下，超表达拟南芥ERF012基因抑制种子的萌发。
5.一种提高植物种子萌发能力的培育方法，其特征在于，所述方法包括在脱落酸存在条件下，抑制目的植物中ERF012基因的表达。
6.根据权利要求5所述提高植物种子萌发能力的培育方法，其特征在于，所述目的植物为拟南芥。
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