CN114585958B - 显微镜和用于使流体通道中的荧光标记成像的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种显微镜和用于使流体通道中的荧光标记成像的方法。显微镜具有基准图像掩模和基准透镜，所述基准透镜在分束器上产生准直基准图案，所述分束器将光学图像引导到物镜，在物镜处，光学图像被引导到由流体通道的内表面的折射率变化形成的光学不连续点。反射的光能通过物镜、分束器和检测器透镜被引导到检测器。当流体通道的内表面在距物镜的焦距处时，形成聚焦图像，从而提供流体通道的内表面处的荧光标记的成像。

Description

显微镜和用于使流体通道中的荧光标记成像的方法
交叉引用相关申请
本申请是2019年10月19日提交的题为“Microscope for Locating Structureson the Inner Surface of a Fluidic Channel[SEQ-11]”的美国申请序列号16/658,052以及2020年3月19日提交的、要求了2019年3月20日提交的题为“Large Field ImagingSystem[CHE-11p]”的美国临时申请62/821,393的优先权权益的、题为“Large FieldImaging for Sequencing Instruments[CHE-21]”的美国申请序列号16/824,632的部分继续申请，所有这些申请的全部内容通过引用结合于此。
技术领域
本发明涉及一种显微镜和用于使流体通道中的荧光标记成像的方法。具体地，本发明涉及用于在部分反射界面上聚焦和定位在部分反射界面处的结构的显微镜，其中存在多个部分反射界面。
背景技术
在某些行业(例如基因测序和基因研究)中，检测核苷酸是需要的，核苷酸是构成核酸的核苷酸的特征性化学部分(characteristic chemical moieties)。五种核酸碱基——腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)——被称为初级的或标准的。它们起遗传密码的基本单位的作用，碱基A、G、C和T存在于DNA中，而A、G、C和U存在于RNA中。在自然界中也发现了稀有碱基，例如5-甲基胞嘧啶和其他甲基化碱基、5-羟甲基胞嘧啶、5-甲酰胞嘧啶和5-碳酰胞嘧啶。其他非标准碱基包括异鸟嘌呤、异胞嘧啶和通用碱基(例如肌苷)。
可以使用对每种类型的核酸碱基特定的荧光标记法(fluorescent labeling)来检测这些核苷酸。荧光标记法的类型包括直接标记法和间接标记法，直接标记法是通过核酸与荧光标记的共价标记法或者通过荧光染料至核酸的非共价结合或嵌入而进行的，以及间接标记法是经由二级标记物至核酸的共价附着且然后将其结合到荧光标记的配体结合剂而进行的。可选的间接策略涉及核酸到用荧光团标记的核酸结合剂分子(例如，抗体、抗生素、组蛋白、抗体、核酸酶)的结合。用于核酸的荧光标记包括有机荧光染料、金属螯合物、碳纳米管、量子点、金颗粒和荧光矿物。
荧光标记优选地在暴露于宽带光源时在独特的波长处发荧光，从而提供用于在二维(2D)空间图像中识别受试者核苷酸中的每一个的方法。
荧光标记结合到位于流体通道的表面上的核苷酸，且荧光标记对激发源的不必要的暴露引起“光漂白”，一种时间现象(temporal phenomenon)，其中标记物的激发随着时间的推移导致减少的荧光光输出。这是在现有技术中的一个问题，在现有技术中，施加标记物活化能，并且通过使用荧光标记作为聚焦目标来聚焦显微镜，从而在显微镜聚焦间隔期间将标记暴露于光漂白能。因为荧光标记小且放大倍数大，所以显微镜图像聚焦的范围短，并且荧光标记直到在锐聚焦的窄范围内才出现。在显微镜聚焦的这个时间间隔期间，光漂白出现，这减少了使荧光标记成像可采用的光能，从而降低了在检测器处的信噪比。另外，荧光标记光强相对较低，在使用荧光标记作为聚焦目标时增加了聚焦的难度。
希望提供一种显微镜，该显微镜提供用于聚焦流体通道的内表面(例如核苷酸和相关联的荧光标记可以聚集的表面)，接着施加荧光活化能以使流体通道的内表面和相关联的荧光标记成像。
此外，对于基于成像的DNA测序仪的吞吐量来说，成像采集速度是一个非常重要的因素。传统上，通过增加用于并行成像多个区域的相机的数量来缩短成像时间。本发明提供了一种光学方案，该光学方案采用了明显更大的视场以及显著提高了图像捕获速度而没有目前的DNA测序仪的复杂性的传感器。
以前解决此问题的尝试包括TDI(时间延迟和积分)线扫描，其中，扫描速度可以很快，但需要精确的时间和高精度的运动。另一种尝试涉及多成像头，这需要多个检测/照明子***，每个子***都有自己的聚焦机制。
发明目的
本发明的第一个目的是具有被照亮的基准图案的显微镜，该被照亮基准图案位于距基准透镜的基准透镜焦距处，来自基准透镜的光能被引导至分束器和物镜，该物镜位于距具有内表面的流动池可调距离处，该物镜位于检测器透镜的光轴上，检测器透镜接收通过分束器的光能，并将光能聚焦在检测器上，从而显微镜被配置为将基准图案定位到足以形成部分反射界面的流动池的折射率变化处，并用于将显微镜聚焦在流体通道的内表面上。
本发明的第二个目的是一种用于在具有折射率的变化的界面处使流体通道的内表面成像的方法，该方法包括形成准直基准图案光能并将该准直基准图案光能引导到距流动池可调距离的物镜，其中，从流体通道界面反射的光能被引导到检测器透镜并聚焦到检测器上，该方法包括首先调节可调距离，直到基准图案在检测器处呈现为聚焦图像为止，随后用光能照射流动池，该光能用于在流体通道的内表面发出标记荧光并在检测器处形成图像。
本发明的第三个目的是一种用于检测形成部分反射光学界面的折射率不连续点的***，该***包括形成准直图像的基准图案发生器，该准直图像例如通过分束器被引导到物镜，该物镜位于距形成部分反射光学界面的折射率不连续点的可变焦距处，来自部分反射界面的反射光能通过物镜被引导到检测器透镜和检测器，检测器位于距检测器透镜的焦距处。
本发明的第四个目的是一种用于定位流体通道的表面的方法，该方法包括：
将来自基准图案的准直光能引导通过物镜，该物镜位于距流体通道的表面可调距离处；
将来自流体通道的表面的反射光能引导通过物镜、通过检测器透镜并到达与检测器透镜相距检测器透镜焦距的检测器；
调节从物镜到流动池的距离，直到检测器中出现基准图案的聚焦图像为止。
本发明的第五个目的是一种用于使相邻于流体通道的内表面的荧光标记成像的方法，该方法包括：
将来自基准图案的准直光能引导通过物镜，该物镜在离流体通道的内表面的可调节长度处；
将来自流体通道的内表面的反射光能引导通过物镜、引导至检测器透镜、并引导至与该检测器透镜相距检测器透镜焦距的检测器；
调节从物镜到流体通道内表面的距离，直到在检测器中出现基准图案的聚焦图像为止；
用光能照射流动池，使标记发出荧光并在检测器上提供聚焦图像。
本发明的第六个目的是一种用于高分辨率和大视场成像的***和方法。
发明内容
显微镜用于使精细结构(例如在流体通道的内表面处经荧光标记的核苷酸)成像。具体而言，显微镜提供了对流体通道的上或下内表面的定位和结构(例如相邻于流体通道的上或下内表面的荧光标记的核苷酸)的随后测量。
在本发明的一个示例中，流体通道在期望观察的区域中具有基本平坦的上或下内表面。基本平坦的内表面在可调距离内，该可调距离包括当流体通道存在时物镜的焦距。检测器透镜位于与物镜相同的轴上，并且检测器相对于检测器透镜位于检测器透镜焦距处。可选地，具有基准图案的被照亮的图像掩模位于距基准透镜的基准透镜焦距处，并且大致垂直于物镜的轴。优选地，来自基准透镜的低强度照明能量被引导至位于物镜和检测器透镜之间的分束器，该分束器将来自基准透镜的光能引导至物镜，在物镜处，该分束器在物镜的焦距处形成基准图案的图像，导致聚焦或未聚焦的光能能够由于在流体通道的基本平坦的内表面处的折射率不连续性被反射。当物镜在距流体通道的基本平坦的表面的焦距处时，来自物镜的聚焦反射光能传播到检测器透镜，并在检测器上形成基准图案的聚焦图像，提供精确定位内表面并对该表面执行测量的能力。物镜的焦距最好短，以便为测量相邻的待测结构提供最小的景深。流动池顶层厚度和流体通道深度的组合被限制为小于物镜的焦距，以确保显微镜聚焦于流体通道的上和下内表面的能力。
在使用相对低强度的光进行基准照明来定位流体通道表面之后，使用适于对与核苷酸相关的荧光标记进行成像的高强度光能来对相邻于流体通道的表面的荧光特征进行成像。荧光标记的聚焦图像由此被提供给检测器，并且在应用荧光标记照明能量之前的低强度基准照明能量极大地减少了不期望的光漂白。
此外，本发明提供了一种高分辨率透镜***，其具有比传统显微镜大得多的视场，并与具有大得多的像素数(>3000万像素)的高分辨率成像传感器耦合。
附图说明
图1是根据本发明的一个方面的显微镜的剖视图100；
图2是图1的流动池的透视图；
图3是用于图1的显微镜的示例性基准掩模的投影图；
图4是根据本发明的另一方面的显微镜的剖视图400；
图5A是用于使图1和图4的显微镜聚焦的示例性基准掩模；
图5B、图5C、图5D、图5E是针对离流动池的物镜间隔距离如在检测器处测量的强度分布；
图6是棋盘基准图案；
图7是流动池结构的示例；在一个实施例中，下玻璃板704可以是不透明的；
图8A示出了具有多个部分反射界面的流动池的详图视图；
图8B示出了示例性棋盘基准图案；
图8C示出了图8B的基准图案的示例性检测器图像；
图8D示出了图8B的基准的详细视图；
图9示出了使用DMD901来产生基准图案。
具体实施方式
图1示出了根据本发明的一个方面的显微镜。在每个图中示出参考坐标x、y和z，以参照其他图。流体通道120形成在透明的壳体122中，并且包括基本平坦的内表面116。壳体122的折射率被选择成与在流体通道120中输送的流体的折射率相差足以形成部分反射界面的比率，例如，返回入射光能的至少0.06％的折射率，该比率对应于在部分反射界面处至少大于或小于5％的折射率的差异，或者大于或小于1％的折射率的最小差异，返回入射光能的约25ppm。示例性反射界面由在水(1.33)之上的玻璃(1.5)的情况形成，并且两个折射率的较大比率是优选的，因为该比率与被引导到用于图像形成的检测器或传感器102的反射光能成比例，并且折射率的变化在玻璃/液体界面处形成反射界面。在多个部分反射表面中遇到内部流体通道界面的情况下，每个部分反射表面根据公知的菲涅耳比R＝|(n1-n2)/(n1+n2)|2反射一定百分比的入射光能。
其中：
n1和n2是入射光能遇到的折射率序列；
R是部分反射界面返回的反射系数。对于反射界面，例如流体通道上表面，通过后续光学界面传输的光能T对于后续光学界面为1-R。
反射光能比例的增加提高了分辨率，并减少了在流体通道内表面上执行显微镜初始聚焦所需的光能。另外，基准光源的光能可以是使荧光标记变得可见所需的大约1/10、1/100、1/1000，1/10,000或1/100,000的量级的光能，从而降低光漂白的可能性，同时也为物镜的聚焦提供具有更大对比度的特征。因此，改进的聚焦精度在建立物镜到反射表面的聚焦时提供了更高的准确度和分辨率，大大减少了荧光标记的光漂白，因为基准源的减少的光能远低于光漂白阈值。
光源146产生未校准的光能，该光能从背后照亮基准图像掩模110，将图像掩模图案投影到基准透镜108上。图像掩模110包括形成有光学不透明和透明特征的图案，基准图像掩模110在距离基准透镜108的焦距L2142处，该准直光能从分束器106反射到轴150上的物镜112，其被聚焦在物镜112下方的焦距处的像平面处，并被流体通道120的内表面116处的折射率不连续点反射。
基准图案被投射到内表面116中，并且当从物镜112到内表面116的距离L3144等于物镜112的焦距时，清晰的图像将被内表面116反射。当分离距离L3略大于物镜112的焦距时，在114处的图像焦平面导致在折射率的不连续点所位于的内表面116(和反射表面)处的离焦图案的反射。类似地，较短的距离L3144将在118处产生清晰的焦平面，而从内表面116处的折射率不连续点反射的光能将类似地是离焦的。反射到检测器102的离焦基准图案的特定性质由众所周知的模糊圈和点扩散函数控制，并且取决于所使用的特定基准图案。
当物镜112聚焦于在内表面116上聚焦的基准图案时，反射的光能被物镜112准直，并通过分束器106在光轴150上进行到检测器透镜104(例如，管透镜)，该检测器透镜104在距离检测器102的固定焦点间隔L1140处，从而在检测器102上形成来自内表面116的聚焦图像。
在示例性实施方式中，例如，通过沿着图1所示的z轴相对于物镜112移动保持流动池组件120/122的载物台，物镜112的焦距可变。基准透镜108在离基准掩模110的基准图案的固定焦距L2142处，并且检测器102在离检测器透镜102的固定焦距L1140处。根据该示例性实施方式，直到基准图案的清晰焦点出现在检测器102处为止的内表面116的位移(例如，通过流动池组件120/122在z轴上的移动)提供了内表面116的精确测定。
图4示出了本发明的一个示例，提供了图1中描述的聚焦功能，并具有多波长荧光标记成像的额外能力。与其他图的结构执行相同功能的附图标记使用相同的附图标记。聚焦在流体通道120的内表面116上的操作如前所述通过调节距离L3144进行，直到基准图案110的清晰图像出现在检测器102上(也称为基准检测器，其中，存在多个检测器)。在完成距离L3144的焦点调节之后，外部的荧光标记光源(未示出)照亮流体通道120的视场，使得与流体通道120的内表面116上的核苷酸相关联的荧光标记发射光能，每个荧光标记发射与其他荧光标记不同的独特波长的光能，使得多色荧光标记图案沿着光轴150通过分束器106被引导并到达分束器103。光能被引导到透镜104B，到达荧光标记检测器102B，并且也被引导到透镜104A，到达荧光标记检测器102A。尽管示出了两个检测器，但是本发明可以使用任意数量的透镜/分束器/检测器光路来操作，每个光路用于特定荧光标记发射的每个波长范围。在本发明的一个示例中，为了用四个荧光标记对RNA或DNA成像，可以使用四个荧光标记光路和相关的荧光标记检测器，每个检测器响应相关的荧光标记。每个检测器路径(包括二向色反射器或分束器、检测器透镜和检测器)通常对与特定荧光标记的发射波长相关的波长范围敏感。在本发明的一个示例中，分束器103具有二向色反射涂层，该涂层将特定范围的波长反射到荧光标记检测器102B，并且以最小的透射损失将其他波长传递到荧光标记检测器102A。在本发明的另一示例中，可以在光轴150上设置级联的一系列二向色反射器103，每个二向色反射器、透镜和检测器与特定的荧光标记波长相关联。在本发明的另一示例中，用单个检测器同时成像荧光标记，可以使用具有足够的空间分辨率和波长分辨率的单个多波长颜色检测器，以波长可分离的形式显示荧光标记。例如，可以使用特定波长的四通道或五通道检测器，而不是RGB(红、绿、蓝)固态图像检测器，或者可以线性组合RGB通道，以将RGB图像响应隔离到特定荧光波长中。
在本发明的一个方面，透镜104、108和112是抗反射的或具有如前所述的消色差涂层。在本发明的另一方面，光源146可以是窄带可见光源，例如发光二极管(LED)，以减少透镜104、108和112的色差(chromatic aberration)和色彩失真(chromatic distortion)。在本发明的另一方面，图像掩模110是石英或玻璃基板，图案化的铬形成沉积在面对基准透镜108的基底表面上的基准图案，其中图案化的铬位于透镜108的焦平面处。可以理解的是，只要保持本发明光路的基本特征，光路可以包含额外的部件，例如，反射镜、透镜、分束器和光源。
图2示出了由对用于基准照明的波长以及荧光标记波长透明的材料形成的示例性流体通道。
图3示出了可以分别应用于基准掩模110A和110B的示例性基准图案302和304。当内表面116相对于x-y平面不合乎需要地倾斜时，在需要校正内表面116的非平面性的情况下，由同心圆形成的基准图案302可能是有用的，因为离焦区域将指示倾斜的方向和角度以用于校正。或者，由线的阵列或具有主要在x轴或y轴上的特征的其他图案形成的基准图案304可以用于使用沿着大致垂直于线的阵列的检测器光电传感器的一条线的检测器响应来自动聚焦。在本发明的另一方面中，基准图案可以包括具有特定间隔距离的图案以实现在x和y方向上结合到内表面116的结构的视觉测量。
在本发明的另一示例中，由机械***执行自动聚焦操作，该机械***调节分离距离L3144，直到获得最小基准图案宽度和最大振幅差实现为止。图5A示出了示例性基准焦掩模图案，图5B、图5C和图5D示出了距离L3变化时的检测器响应。。离焦检测器响应(沿2D检测器的一条线)被示为图5B的曲线图。当距离L3改变得更靠近焦点时，沿着检测器的这一条线的基准检测器响应具有在图5C和图5D中所示的空间检测器响应，其中基准检测器响应曲线图510对应于最佳焦点。当距离L3进一步增加而超出图5E的焦点时，基准检测器响应依次进展到曲线图508、506和504。
自动聚焦算法的一个困难在于，可能在基准检测器对于大部分聚焦范围产生曲线504的输出的情况下(对于流动池为了光学聚焦而移动的方向来说，是不确定的)试图在图5A的基准图案502上自动聚焦。替代基准图案在图6中示出，为包括精细结构和粗略结构的交替棋盘图案，从而在基准图案602和中间间隙604上提供粗略聚焦，在此之后聚焦算法可以如对图5A-5E所描述的那样在基准图案602的基准线上操作。
检测器102可以是半导体或固态检测器阵列，或者是用于直接观察的目镜。在本发明的一个示例中，检测器102是光电传感器单元的2D阵列，具有足够密度的光电传感器单元，以形成所聚焦的基准图案的清晰图像。在本发明的相关示例中，光电传感器单元的密度是聚焦在检测器上的基准图案的线宽的至少4个分辨率线宽。在本发明的另一相关示例中，光电传感器单元密度使得当显微镜聚焦时，至少四个光电传感器被基准图案覆盖。
分束器106可以是光学透射非色散基板(例如，玻璃)上的二向色涂层或部分反射表面。在本发明的一个示例中，反射涂层可以约为5％反射率和95％透射率，并且，选择光源146的光强度，以在内表面116处形成具有至少6db信噪比(SNR)的反射图像。
透明的壳体122优选地是具有与在通道120中输送的流体的折射率不同的折射率并且足够不同以形成足以在检测器处形成图像的光学反射界面的材料。。图7示出了由粘合剂706中的空隙形成的示例性流体通道708，粘合剂将上下玻璃板702和704分开。在另一实施例中，下玻璃板704可以是不透明的，或者比上玻璃板702相对不透明。在这个示例中，为了使用基准光路来聚焦***，使用菲涅耳方程的空气(n1＝1.0)/玻璃(n2＝1.5)界面的反射率是R＝|(1-1.5)/(1+1.5)|2＝0.04，因此，T＝0.96的光能继续到达流体通道玻璃/水界面，其中，R＝|(1.5-1.33_/(1.5+1.33)|2＝0.36％的剩余光能被反射，其中96％的光能通过玻璃/空气界面返回到光路，作为可用的检测器光能。关于检测器可用的光能，对于进入流动池的给定的照明I，0.04I在第一空气/玻璃界面被反射，0.96×0.0036×0.96I＝0.0033I在流体通道的上表面反射并返回到检测器。总之，从空气/玻璃界面到检测器的形成伪像(artifact)的反射比期望的流体通道内表面反射强约10倍。这些是用于理解本发明的结构示例，并不旨在将本发明限制于所提供的示例。
图6的棋盘图案的缺点在于，在存在多个反射界面的情况下，基准图案602的模糊可能由于来自在流体通道的期望反射界面上方和下方的其他反射界面的离焦图案而发生，这些离焦图案叠加到来自期望反射界面的期望基准图案上。特别是，关于图8A，先前计算的结果显示从空气/玻璃界面(上反射表面810)返回到检测器的光能比从在图8A的内部上反射界面116(前述的内表面)处的玻璃/水反射返回到检测器的光能多了大约10倍。为了解决这个问题，图8B示出了交替棋盘图案的另一个示例，其减少了流动池的多个反射层(例如上反射表面810和如前所述的具有间隔件706的流体通道708的下反射表面812)的影响，上反射表面810在本示例中是强反射器，它的反射与作为聚焦物镜的期望的内部上反射界面116竞争。物镜112可以将基准图案聚焦到期望内部上反射界面116上，然而上反射表面810和下反射表面812也贡献叠加到期望内部上反射界面116响应上的反射光能。图8B的交替棋盘图案包括例如以规则间隔布置在大开放区域804内的基准图案802。图8D示出了图8B的每个基准的详细视图820，基准可以是如前所述的任何图案，并且在图8D中被示为水平线的基准图案830。图8C示出了在检测器处的合成图像。当观看图8C的合成检测器图像时，使用稀疏地布置的基准图案的优点变得明显，其中聚焦图像具有代表基准图案830的基准图像822，但还包括来自从下反射表面812反射的散焦基准的弱(与基准图像822相比相对较暗)的模糊圈伪像824，以及从上反射表面810反射的非常强的模糊圈伪像826，其如之前计算的返回比期望基准图案802多大约10倍的光能。当显微镜聚焦在内部上反射界面116上时，对于点光源(与反射表面间隔距离相比非常小的基准图案802)来说，可以通过来自图8A的透镜112的射线跟踪几何形状来确定每个伪像824和826的近似直径，使得上反射表面伪像826可以通过射线811与上反射表面810的相交来近似，并且下反射表面伪像824可以通过射线811与下反射表面812的相交来近似，每个伪像在近似中分别形成模糊圈伪像和检测器，其中基准范围802与从内部上反射界面116到下反射表面812或者从内部上反射界面116到上反射表面810的间隔距离相比是可忽略的尺寸。当焦点在上反射表面810和下反射表面812之间改变时，所得到的模糊圈伪像824和826将在相反方向上改变直径，并且每个模糊圈的尺寸将指示到期望反射界面(例如116)的间隔距离，并且可以用于初始聚焦。因此，可以根据模糊圈伪像824和826的直径结合流动池的反射表面间距来确定期望内部上反射界面116，并且此后聚焦算法可以改变为使用基准本身的图案(例如基准图案830)来精细地调节的聚焦算法，如前面对图5A至5E所描述的。为了最小化相对较强的伪像826对相对较弱的基准图案802的影响，可以期望在图8B的基准图案802之间布置间距以为了合理的流体通道/物镜间隔距离而确保模糊圈伪像826不进入相邻的基准图案内。还可以期望在形成多个反射界面的810/116和116/812之间设置间隔距离以最小化模糊圈伪像824和826对期望基准图像822的影响。
在本申请中，所涉及的标称值的数量级范围包括标称值的1/10到标称值的10倍的范围，例如，大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％，90％、110％、120％、150％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％或900％。所涉及的近似值(其中，“约”用于表示近似值)应理解为在标称值的1/2至2倍标称值的范围内，例如，约60％、70％、80％、90％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％或190％。尽管优选地，基准透镜108的轴大致垂直于物镜112的轴，但是可以选择分束器106的任意角度，其提供基准图案到内部上反射界面116上的照明，例如，大约20°、30°、40°、45°、50°、60°、70°、80°、90°、100°、110°、120°、130°、135°、140°、150°或160°。流体通道的基本平坦的区域被理解为足够平坦，以提供聚焦区域，使得模糊圈的直径在不同区域之间的变化小于10倍。或者，显微镜可以在流体通道的基本平坦的区域是非平坦的或者从光轴倾斜的情况下正确操作，但是具有受限的聚焦区域，这将仅限制聚焦的基准图案的范围和聚焦的荧光标记检测器图像的范围。在这个倾斜或非平坦区域的示例中，基本平坦被理解为仅指图像中被聚焦或可以被聚焦的区域。
在另一实施方式中，本发明提供了一种高分辨率透镜***，其具有比传统显微镜大得多的视场，并与具有大得多的像素数(>3000万像素)的高分辨率成像传感器耦合。
透镜***可以具有以下或类似的特征：
波长：500nm到720nm是一个有用的范围。其他有用的波长包括在10nm、20nm、50nm、100nm、200nm、250nm、300nm、350nm(通常为紫外线)、380nm、400nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、740nm(通常为可见光)、750nm、800nm、900nm、1μm、10μm、100μm以及1mm(通常为红外线)中的任意波长之间的范围。
放大倍数：4x到6x是一个有用的范围。其他范围包括从lx、2x、3x或4x到6x、7x、8x、9x、10x、12x、14x、16x、18x或20x。大于6x的放大率可用于更大的成像传感器。
传感器分辨率：6000万像素(mp)是一个有用的分辨率。其他范围包括在20、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、175、200、250、300、350和400mp中的任意分辨率。
数值孔径(NA)(物侧空间)：0.5是典型的NA。其他范围包括0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5和1.53中的任意NA。
分辨率(物侧空间)：可以小于1μm，或优于每毫米500线对。其他范围包括300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nm、1100nm、1200nm、1300nm、1400nm、1500nm、1600nm、1700nm、1800nm、1900nm和2000nm中的任意分辨率。
视场角(FOV)(物侧空间)：7.5mmx5.6mm(直径9.4mm)是典型的FOV面积。其他有用的FOV包括至少4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、45、50、60、70、80、90、100、200、500、750和1000mm2。
顶部固体支撑物厚度：通常为170-250μm；
顶部固体支撑物折射率：通常为1.50-1.53；
水层厚度：通常为170-250μm；
浸没介质：空气/干燥。
镜筒镜头孔径：通常为35至60mm。其他范围包括30、35、40、45、50、55、60和65nm中的任意孔径。可以选择其他范围来与物镜和分束器的尺寸兼容。
大视场要求基板高度平坦，因此流动池需要更严格的制造公差。这可以通过在不同的焦点拍摄多幅图像，并使用计算成像算法在整个视野范围内从样本中提取信号来解决。
由于相对较低的放大倍数和较大的视野，来自厚底部固体支撑物的荧光背景和流动池下的任何碎片可能会妨碍对样本表面信号的检测。通过使用在生物化学上也与测序方案兼容的不透明低荧光基板材料，例如，UG-1玻璃(德国美因茨Schott AG)，可以显著减少或几乎消除这种情况，该材料在进行测序成像的可见范围内不透明。使用不透明玻璃作为流动池的固体支撑物减少了荧光背景。
为了进一步区分信号与焦平面外的背景，通过诸如数字微镜器件(DMD)的器件产生图案化照明，并使用计算方法。
例如参见James B.Pawley(ed.)Handbook of Confocal Microscopy(Springer2006)第265-279页Rainer Heintzmann的“结构化照明方法”。在基于大视场成像的测序设备中，结构化照明的使用进一步抑制了焦平面外的荧光背景。
如图9所示，DMD901不仅可以用于产生照明，还可以用于产生和控制基准图案。因为在成像和聚焦期间可配置多个图案，这样的DMD可用于基准聚焦，可通过使速度最大化、使倾斜量化以及适应意外信号来优化工作流程。
镜头***的放大倍数和分辨率应与成像传感器的像素大小、特征密度、特征尺寸和感测面积匹配或对应，以优化图像采集速度。照明光源还应在样本表面产生足够的功率密度和强度均匀性。
结果，该实施方式提供了低荧光背景和具有非常高分辨率的大视场图像。可以通过每个周期的总成像时间(考虑通道切换和建立时间)、区分碱基的灵敏度、读取长度和总运行时间来衡量性能的提高。该实施方式可应用于高通量细胞成像，例如，用于药物筛选。
提供这些实施例，仅仅是为了说明的目的，而不是为了将本发明仅限于所示的实施方式。

Claims (19)

1.一种显微镜，其特征在于，包括：
基准图像掩模，能够在一个表面被照亮，并且位于距基准透镜的焦距处；
物镜，位于与检测器透镜共有的轴上；
分束器，位于所述物镜和所述检测器透镜之间，其中，所述分束器能够从所述基准透镜接收光能，并且能够将所述光能引导到所述物镜；以及
检测器，位于距所述检测器透镜的焦距处，能够接收从流动池的多个部分反射表面反射的光能，所述多个部分反射表面包括所述流动池的上玻璃板的下表面，所述多个部分反射表面还包括所述上玻璃板的上表面和/或所述流动池的下玻璃板的上表面，所述反射的光能能够被引导通过所述物镜、所述分束器和所述检测器透镜。
2.根据权利要求1所述的显微镜，其特征在于，所述多个部分反射表面包括所述流动池的流体通道的至少一个基本平坦的内表面。
3.根据权利要求1所述的显微镜，其特征在于，所述多个部分反射表面中的至少一个部分反射表面具有比不同的部分反射表面大于或者小于至少1％的折射率。
4.根据权利要求1所述的显微镜，其特征在于，所述多个部分反射表面中的至少一个部分反射表面具有比不同的部分反射表面大于或者小于至少5％的折射率。
5.根据权利要求1所述的显微镜，其特征在于，所述检测器是光电检测器单元的2D阵列，所述光电检测器单元用于形成反射基准光能的2D图像、以及来自所述多个部分反射表面中的至少一个所述部分反射表面的直接荧光标记能量的2D图像。
6.根据权利要求1所述的显微镜，其特征在于，所述基准图像掩模包括线的阵列或圆的阵列。
7.根据权利要求6所述的显微镜，其特征在于，所述线的阵列形成棋盘图案。
8.根据权利要求1所述的显微镜，其特征在于，所述分束器位于相对于所述物镜和所述检测器透镜的轴成大约45度角处。
9.一种显微镜，其特征在于，包括：
基准图像掩模，照亮所述基准图像掩模的光能穿过基准透镜产生准直光束并耦合到分束器，所述分束器能够将所述准直光束引导到物镜并引导到流动池的上玻璃板和下玻璃板之间的流体通道的基本平坦的区域上，所述基本平坦的区域位于距所述物镜的可调距离处；
检测器透镜，设置在与所述物镜在共有的光轴上，并且能够接收来自所述基本平坦的区域的反射光能，其中，所述反射光能穿过所述分束器，并且此后到达检测器透镜和检测器，所述检测器位于距所述检测器透镜的检测器透镜焦距处；
光源，用于激发所述流动池中的荧光标记；以及
一个或多个荧光标记光路，耦合到在所述共有的光轴上的荧光标记的光能，其中，每个荧光标记光路能够将特定范围的波长的荧光标记的光能引导到相关的用于检测荧光标记的检测器；
所述检测器能够接收从所述流动池的多个部分反射表面反射的光能，其中，所述反射的光能能够被引导通过所述物镜、所述分束器和所述检测器透镜，所述多个部分反射表面包括所述流动池的上玻璃板的下表面，所述多个部分反射表面还包括所述上玻璃板的上表面和/或所述流动池的下玻璃板的上表面。
10.根据权利要求9所述的显微镜，其特征在于，所述检测器控制所述可调距离，以在所述检测器处形成聚焦图像。
11.根据权利要求9所述的显微镜，其特征在于，所述流体通道的基本平坦的区域是所述流体通道的上表面。
12.根据权利要求9所述的显微镜，其特征在于，每个荧光标记光路包括二向色反射器、检测器透镜和检测器。
13.根据权利要求9所述的显微镜，其特征在于，流体路径在垂直于所述基本平坦的区域的区域中具有至少10％的折射率变化。
14.一种用于使流动池的流体通道中的荧光标记成像的方法，其特征在于，所述流体通道具有与所述流体通道相邻的反射界面，所述反射界面包括所述流动池的上玻璃板的下表面，所述反射界面还包括所述上玻璃板的上表面和/或所述流动池的下玻璃板的上表面，
其中，所述方法在显微镜中操作，所述显微镜包括相对所述反射界面距离可调的物镜、被照亮后产生基准图案的基准图像掩模、接收穿过基准图像掩模的光能并产生准直光束的基准透镜、将准直光束引导至所述反射界面的分束器、接收从所述反射界面反射的光能并能够在基准检测器处形成图像的检测器透镜和所述基准检测器、以及能够接收来自所述流体通道内所述反射界面处的荧光标记的光能的一个或多个荧光标记光路，
所述方法包括：
(a)照亮所述基准图像掩模；
(b)调节从所述物镜到所述反射界面的距离，直到聚焦图像出现在所述基准检测器上；
(c)应用荧光标记光源，以使所述荧光标记发荧光；以及
(d)在相应的荧光标记光路的每个荧光标记检测器处形成荧光标记的聚焦图像。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，当启用所述荧光标记光源时，不照亮所述基准图像掩模。
16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述流体通道具有上表面，并且所述反射界面相邻于所述流体通道的上表面。
17.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，每个荧光标记光路包括二向色反射器，所述二向色反射器用于反射特定范围的波长并使其他波长通过，其中，每个二向色反射器将特定范围的波长引导到相应的检测器透镜和相应的荧光标记检测器。
18.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，利用交替棋盘的基准图案来执行调节从所述物镜到所述反射界面的距离，其中，使用一系列细线和大间隙来形成所述交替棋盘，所述基准检测器使得从所述物镜到所述反射界面的距离改变，直到所述基准检测器基于解析所述交替棋盘的图案而感测到聚焦图像为止，其中，所述基准检测器使得从所述物镜到所述反射界面的距离在相同方向上变化，直到所述棋盘的各条线被聚焦为止。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述基准检测器使用基准特征的宽度的变化和峰间振幅的变化来确定是增加还是减小所述物镜和所述反射界面之间的距离。
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