CN112684600A - 用于定位在流体通道的内表面上的结构的显微镜 - Google Patents

Abstract

本申请涉及用于定位在流体通道的内表面上的结构的显微镜。显微镜具有基准掩模和将准直掩模图像生成到分束器上的基准透镜，分束器将光学图像引导至物镜，在物镜处，光学图像被引导至由流体通道的内表面的折射率的变化形成的光学不连续点。反射光能通过物镜、分束器和检测器透镜被引导到检测器。当流体通道的内表面在离物镜的焦距处时，聚焦图像形成，提供在流体通道的内表面处的荧光标记物的成像。

Description

用于定位在流体通道的内表面上的结构的显微镜

发明领域

本发明涉及显微镜。特别是，本发明涉及用于在部分反射界面上聚焦和定位在部分反射界面处的结构的显微镜，其中存在多个部分反射界面。

发明背景

在某些行业(例如基因测序和基因研究)中，检测核苷酸是需要的，核苷酸是构成核酸的核苷酸的特征性化学部分(characteristic chemical moieties)。五种核酸碱基——腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)——被称为初级的或标准的。它们起遗传密码的基本单位的作用，碱基A、G、C和T存在于DNA中，而A、G、C和U存在于RNA中。在自然界中也发现了稀有碱基，例如5-甲基胞嘧啶和其他甲基化碱基、5-羟甲基胞嘧啶、5-甲酰胞嘧啶和5-碳酰胞嘧啶。其他非标准碱基包括异鸟嘌呤、异胞嘧啶和通用碱基(例如肌苷)。

可以使用对每种类型的核酸碱基特定的荧光标记法(fluorescent labeling)来检测这些核苷酸。荧光标记法的类型包括直接标记法和间接标记法，直接标记法是通过核酸与荧光标记物的共价标记法或者通过荧光染料至核酸的非共价结合或嵌入而进行的，以及间接标记法是经由二级标记物至核酸的共价附着且然后将其结合到荧光标记的配体结合剂而进行的。可选的间接策略涉及核酸到用荧光团标记的核酸结合剂分子(例如，抗体、抗生素、组蛋白、抗体、核酸酶)的结合。用于核酸的荧光标记物包括有机荧光染料、金属螯合物、碳纳米管、量子点、金颗粒和荧光矿物。

荧光标记物优选地在暴露于宽带光源时在独特的波长处发荧光，从而提供用于在二维(2D)空间图像中识别受试者核苷酸中的每一个的方法。

荧光标记物结合到位于流体通道的表面上的核苷酸，且荧光标记物对激发源的不必要的暴露引起“光漂白”，一种时间现象(temporal phenomenon)，其中标记物的激发随着时间的推移导致减少的荧光光输出。这是在现有技术中的一个问题，在现有技术中，施加标记物活化能，并且通过使用荧光标记物作为聚焦目标来聚焦显微镜，从而在显微镜聚焦间隔期间将标记暴露于光漂白能。因为荧光标记物小且放大倍数大，所以显微镜图像聚焦的范围短，并且荧光标记物直到在锐聚焦的窄范围内才出现。在显微镜聚焦的这个时间间隔期间，光漂白出现，这减少了使荧光标记物成像可采用的光能，从而降低了在检测器处的信噪比。另外，荧光标记光强相对较低，在使用荧光标记物作为聚焦目标时增加了聚焦的难度。

希望提供一种显微镜，该显微镜提供用于聚焦流体通道的内表面(例如核苷酸和相关联的荧光标记物可以聚集的表面)，接着施加荧光活化能以使流体通道的内表面和相关联的荧光标记物成像。

发明目的

本发明的第一个目的是具有被照亮的基准图案的显微镜，被照亮的基准图案位于距基准透镜的基准透镜焦距处，来自基准透镜的光能被引导至分束器和物镜，该物镜位于距具有内表面的流动池的可调节距离处，物镜在检测器透镜的光轴上，检测器透镜接收通过分束器的光能并将光能聚焦到检测器，显微镜由此被配置为将基准图案定位到足以形成部分反射界面的流动池的折射率的变化上，并使显微镜聚焦到流体通道的内表面上。

本发明的第二个目的是一种用于在具有折射率的变化的界面处使流体通道的内表面成像的方法，该方法包括形成准直基准图案光能并将准直基准图案光能引导到离流动池可调节距离的物镜，其中从流体通道界面反射的光能被引导到检测器透镜并聚焦到检测器上，该方法包括首先调节可调节距离，直到基准图案在检测器处呈现为聚焦图像为止，以及随后用操作来使在流体通道的内表面处的标记物发荧光的光能照射流动池，并在检测器处形成图像。

本发明的第三个目的是一种用于检测形成部分反射光学界面的折射率的不连续点的***，该***包括形成准直图像的基准图案生成器，准直图像例如通过分束器被引导到物镜；物镜，其位于离形成部分反射光学界面的折射率的不连续点的可变焦距处，来自部分反射界面的反射光能通过物镜被引导并到达检测器透镜和检测器，检测器位于离检测器透镜的焦距处。

本发明的第四个目的是一种用于定位流体通道的表面的方法，该方法包括：

将来自基准图案的准直光能引导通过位于离流体通道的表面的可调节距离处的物镜；

将来自流体通道的表面的反射光能引导通过物镜通过检测器透镜并到达位于离检测器透镜的检测器透镜焦距处的检测器；

调节从物镜到流动池的距离，直到基准图案的聚焦图像出现在检测器中为止。

本发明的第五个目的是一种用于使相邻于流体通道的内表面的荧光标记物成像的方法，该方法包括：

将来自基准图案的准直光能引导通过物镜，该物镜在离流体通道的内表面的可调节长度处；

将来自流体通道的内表面的反射光能通过物镜引导到检测器透镜并到位于离检测器透镜的检测器透镜焦距处的检测器；

调节从物镜到流体通道内表面的距离，直到基准图案的聚焦图像出现在检测器中为止；

用光能照射流动池，使标记物发荧光，并在检测器处提供聚焦图像。

发明概述

显微镜用于使精细结构(例如在流体通道的内表面处的荧光标记的核苷酸)成像。特别是，显微镜提供了对流体通道的上或下内表面的定位和对结构(例如相邻于流体通道的上或下内表面的荧光标记的核苷酸)的随后测量。

在本发明的一个示例中，流体通道具有在期望观察的区域中的基本平坦的上或下内表面。基本平坦的内表面在可调节距离内，该可调节距离包括当流体通道存在时物镜的焦距。检测器透镜位于与物镜相同的轴上，并且检测器位于离检测器透镜的检测器透镜焦距处。具有基准图案的被照亮的图像掩模位于距基准透镜的基准透镜焦距处，并且实质上垂直于物镜的轴。优选地，来自基准透镜的低强度照明能量被引导至位于物镜和检测器透镜之间的分束器，该分束器将光能从基准透镜引导至物镜，在距物镜的焦距处它形成基准图案的图像，使聚焦或未聚焦的光能由于在流体通道的基本平坦的内表面处的折射率的不连续性被反射。当物镜在距流体通道的基本平坦的表面的焦距处时，来自物镜的聚焦反射光能行进到检测器透镜，并在检测器上形成基准图案的聚焦图像，提供精确地定位内表面并相对于该表面执行测量的能力。物镜具有优选地短的焦距，以对待测量的相邻结构的测量提供最小景深。组合的流动池顶层厚度和流体通道深度被限制为小于物镜的焦距，以确保显微镜聚焦在流体通道的上和下内表面上的能力。

在使用用于基准照明的相对较低强度光定位流体通道表面之后，使用适合于使与核苷酸相关联的荧光标记物成像的高强度光能来执行相邻于流体通道表面的荧光特征的成像。荧光标记物的聚焦图像由此被提供给检测器，并且在荧光标记照明能量的施加之前的低强度基准照明能量极大地减少了不期望的光漂白。

附图简述

图1是根据本发明的方面的显微镜的截面图100。

图2是图1的流动池的透视图。

图3是与图1的显微镜一起使用的示例基准掩模的投影图。

图4是根据本发明的另一方面的显微镜的截面图400。

图5A是用于使图1和图4的显微镜聚焦的示例基准掩模。

图5B、图5C、图5D、图5E是针对离流动池的物镜间隔距离如在检测器处测量的强度分布。

图6是棋盘基准图案。

图7是示例流动池结构。

图8A示出了具有多个部分反射界面的流动池的详细视图。

图8B示出了示例棋盘基准图案。

图8C示出了图8B的基准图案的示例检测器图像。

图8D示出了图8B的基准的详细视图。

发明的详细描述

图1示出了根据本发明的方面的显微镜。在每个附图中显示参考坐标x、y、z，用于参考其他附图。流体通道120在透明壳体122中形成，并且包括基本平坦的内表面116。壳体122的折射率被选择成与在流体通道120中传送的流体的折射率相差足以形成部分反射界面(例如返回入射光能的至少0.06％的部分反射界面)的比率，该比率对应于在部分反射界面处至少大于或小于5％的折射率的差异，或者大于或小于1％的折射率的最小差异，返回入射光能的约25ppm。示例反射界面由在水(1.33)之上的玻璃(1.5)的情况形成，并且这两个折射率的较大比率是优选的，因为该比率与被引导到检测器102用于图像形成的反射光能成比例，并且折射率的变化在玻璃/液体界面处形成反射界面。在多个部分反射表面中遇到内部流体通道界面的情况下，每个部分反射表面根据众所周知的菲涅耳比率

反射一定百分比的入射光能。

其中：

n1和n2是如由入射光能遇到的折射率序列；

R是由部分反射界面返回的反射系数。对于反射界面，例如流体通道上表面，通过后续光学界面传输的光能T对于后续光学界面为1-R。

反射光能的增加的比例提高了分辨率，并减少了在流体通道内表面上执行显微镜的初始聚焦的所需光能。此外，基准光源的光能可以是使荧光标记物变得可见所需的光能的1/10、1/100、1/1000、1/10,000或1/100,000的数量级，从而降低光漂白的可能性，同时还提供具有更大对比度的特征用于聚焦物镜。因此，提高的聚焦准确度在建立物镜到反射表面聚焦时提供更高的准确度和分辨率，大大减少了荧光标记物的光漂白，因为基准源的减少的光能远低于光漂白阈值。

光源146生成未准直的光能，其从后面照亮将图像掩模图案投影到基准透镜108上的基准图像掩模110。图像掩模110包括在光学不透明和透明特征中形成的图案，基准图像掩模110在距离基准透镜108的焦距L2 142处，产生准直光能，该准直光能从分束器106反射到轴150上的物镜112，在物镜112处它聚焦在物镜112下方的焦距处的图像平面处，并通过流体通道120的内表面116处的折射率不连续点反射。

基准图像被投影到内表面116中，并且当从物镜112到内表面116的距离L3 144等于物镜112的焦距时，清晰的图像将被内表面116反射。当间隔距离L3略大于物镜112的焦距时，在114处的图像焦平面导致在折射率的不连续点所位于的内表面116(和反射表面)处的离焦图像的反射。类似地，较短的距离L3 144将在118处产生清晰的焦平面，而从表面116处的折射率不连续点反射的光能将类似地是离焦的。反射到检测器102的离焦基准图像图案的特定性质由众所周知的模糊圈和点扩散函数控制，并且取决于所使用的特定基准图像图案。

当物镜112聚焦在内表面116处的焦点的基准图像上时，反射光能被物镜112准直，并在光轴150上通过分束器106行进到检测器透镜104，检测器透镜104在距离检测器102的固定焦点间隔L1 140处，从而将来自内表面116的聚焦图像形成到检测器102上。

在示例实施例中，例如通过沿着图1所示的z轴相对于物镜112移动保持流动池组件120/122的载物台，物镜112的焦距是可变的。基准透镜108在离基准掩模110的基准图案的固定焦距L2 142处，且检测器102在离检测器透镜102的固定焦距L1 140处。根据该示例实施例，例如通过流动池组件120/122在z轴上的移动，直到基准图案的清晰焦点出现在检测器102处的内表面116的位移，提供了内表面116的精确测定。

图4示出了提供具有用于多波长荧光标记成像的附加能力的在图1中描述的聚焦功能的本发明的示例。与其他附图的结构执行相同功能的参考数字使用相同的参考数字。在流体通道120的内表面116上聚焦的操作如前所述通过调节距离L3 144直到基准图案110的清晰图像出现在检测器102(也被称为基准检测器，其中多个检测器存在)上而发生。在距离L3 144的焦点调节完成之后，外部的荧光标记光源(未示出)照亮流体通道120的场，使与在流体通道的内表面116上的核苷酸相关联的荧光标记物发射光能，每个荧光标记物以不同于其他荧光标记物的独特波长发射光能，导致沿着光轴150通过分束器106被引导并到达分束器103的多色荧光标记图案。光能被引导到透镜104B至荧光标记检测器102B，并且还被引导到透镜104A至荧光标记检测器102A。尽管示出了两个检测器，但本发明可以使用任何数量的透镜/分束器/检测器光路来操作，每个光路用于由特定荧光标记物发射的波长的每个范围。在本发明的示例中，为了用四个荧光标记物使RNA或DNA成像，可以使用四个光路和相关联的荧光标记检测器，每个光路和相关联的荧光标记检测器对相关联的荧光标记做出响应。每个检测器路径(包括二向色反射器或分束器、检测器透镜和检测器)通常对与特定荧光标记物的发射波长相关联的波长范围是敏感的。在本发明的一个示例中，分束器103具有二向色反射涂层，其将特定范围的波长反射到荧光标记检测器102B，并且以最小的透射损耗将其他波长传递到荧光标记检测器102A。在本发明的另一个示例中，二向色反射器103的级联系列可以设置在光轴150上，每个二向色反射器、透镜和检测器与特定的荧光标记波长相关联。在用于用单个检测器使荧光标记物同时成像的本发明的另一个示例中，可以使用单个多波长颜色检测器，其具有足够的空间分辨率和波长分辨率以在按波长可分离的形式中显示荧光标记物。例如，可以使用对特定波长特定的四通道或五通道检测器，而不是RGB(红、绿、蓝)固态图像检测器，或者可以线性地组合RGB通道以将RGB图像响应隔离到特定荧光波长内。

在本发明的一个方面中，透镜104、108和112是抗反射的或者具有如前所述的消色差涂层。在本发明的另一方面中，光源146可以是窄带可见光源，例如发光二极管(LED)，以减少透镜104、108和112的色像差(chromatic aberration)和色失真(chromaticdistortion)。在本发明的另一个方面中，图像掩模110是具有图案化铬的石英或玻璃基底，该图案化铬形成沉积在面向基准透镜108的基底表面上的基准图案，其中图案化铬位于透镜108的焦平面处。将认识到，光路可以合并附加的部件，例如反射镜、透镜、分束器和光源，只要保持本发明的光路的基本特征即可。

图2示出了由对用于基准照明的波长和对于荧光标志物波长透明的材料形成的示例流体通道。

图3示出了可以分别应用于基准掩模110A和110B的示例基准图案302和304。当内表面116相对于x-y平面不合乎需要地倾斜时，在需要校正内表面116的非平面性的情况下，由同心圆形成的基准图案302可能是有用的，因为离焦区域将指示倾斜的方向和角度以用于校正。可选地，由线的阵列或具有主要在x轴或y轴上的特征的其他图案形成的基准图案304可以用于使用沿着大致垂直于线的阵列的检测器光电传感器的一条线的检测器响应来自动聚焦。在本发明的另一方面中，基准图案可以包括具有特定间隔距离的图案以实现在x和y方向上结合到表面116的结构的视觉测量。

在本发明的另一个示例中，自动聚焦操作由机械***执行，该机械***调节间隔距离L3 144，直到最小基准图案宽度和最大振幅差被实现为止。图5A示出了示例基准聚焦掩模图案，以及图5B、图5C和图5D示出了当距离L3变化时的检测器响应。离焦检测器响应(沿2D检测器的一条线)被示为图5B的曲线图。当距离L3改变得更靠近焦点时，沿着检测器的这一条线的基准检测器响应具有在图5C和图5D中所示的空间检测器响应，其中基准检测器响应曲线图510对应于最佳焦点。当距离L3进一步增加而超出图5E的焦点时，基准检测器响应依次进展到曲线图508、506和504。

自动聚焦算法的一个困难在于，它可能试图在基准检测器针对聚焦范围的大部分产生曲线图504的输出的情况下自动聚焦在图5A的基准图案502上，这对于用于光学聚焦的流动池移动的方向是不确定的。可选的基准图案在图6中被示为包括精细结构和粗略结构的交替棋盘图案，从而在结构602和中间间隙604上提供粗略聚焦，在此之后聚焦算法可以如对图5A-5E所描述的那样在602的基准线上操作。

检测器102可以是半导体或固态检测器阵列，或者可选地是用于直接观察的目镜。在本发明的一个示例中，检测器102是具有足够的光电传感器单元的密度的光电传感器的2D阵列以形成聚焦基准图案的清晰图像。在本发明的相关示例中，光电传感器单元的密度是聚焦在检测器上的基准图案的线宽的至少4个分辨率线宽。在本发明的另一相关示例中，光电传感器单元密度使得当显微镜被聚焦时，至少四个光电传感器被基准图案覆盖。

分束器106可以是在光学透射非色散基底(例如玻璃)上的二向色涂层或部分反射表面。在本发明的一个示例中，反射涂层可以约为5％反射率和95％透射率，并且源146的光强度被选择成在表面116处形成具有至少6db信噪比(SNR)的反射图像。

透明壳体122优选地是具有与在通道120中输送的流体的折射率不同的折射率并且足够不同以形成足以在检测器处形成图像的光学反射界面的材料。图7示出了由粘合剂706中的空隙形成的示例流体通道708，该粘合剂分离上玻璃板702和下玻璃板704。在这个示例中，为了使用基准光路聚焦***，使用菲涅耳方程的空气(n1＝1.0)/玻璃(n2＝1.5)界面的反射率为

且因此光能的T＝0.96继续到流体通道玻璃/水界面，在玻璃/水界面处，剩余光能的

被反射，其中96％的该能量通过玻璃/空气界面被返回到光路作为可用的检测器光能。关于检测器可用的光能，对于进入流动池的给定照明I，0.04I在第一空气/玻璃界面处被反射，以及0.96*0.0036*0.96I＝0.0033I在流体通道的上表面处被反射并返回到检测器。总之，从空气/玻璃界面到检测器的形成伪像(artifact)的反射比期望的流体通道内表面反射强约10倍。这些是用于理解本发明的结构的示例，且并不意欲将本发明限制于所提供的示例。

图6的棋盘图案的缺点在于，在存在多个反射界面的情况下，基准图案602的模糊可能由于来自在流体通道的期望反射界面上方和下方的其他反射界面的离焦图像而发生，这些离焦图像叠加到来自期望反射界面的期望基准图像上。特别是，关于图8A，先前计算的结果显示从空气/玻璃界面810返回到检测器的光能比从在图8A的界面116处的玻璃/水反射返回到检测器的光能多了大约10倍。为了解决这个问题，图8B示出了交替棋盘图案的另一个示例，其减少了流动池的多个反射层(例如上反射表面810和如前所述的具有间隔件706的流体通道708的下反射界面812)的影响，上反射表面810在本示例中是强反射器，它的反射与作为聚焦物镜的期望的内部上反射界面116竞争。物镜112可以将基准图像聚焦到期望反射界面116上，然而上反射表面810和下反射界面812也贡献叠加到期望反射界面116响应上的反射光能。图8B的交替棋盘图案包括例如以规则间隔布置在大开放区域804内的基准图案802。图8D示出了图8B的每个基准的详细视图820，基准可以是如前所述的任何图案，并且在图8D中被示为水平线830。图8C示出了在检测器处的合成图像。当观看图8C的合成检测器图像时，使用稀疏地布置的基准图案的优点变得明显，其中聚焦图像具有代表聚焦图案830的图案822，但还包括来自从下表面812反射的散焦基准的弱(与图案822相比相对较暗)的模糊圈伪像824，以及从顶表面810反射的非常强的模糊圈伪像826，其如之前计算的返回比期望基准图像802多大约10倍的光能。当显微镜聚焦在反射表面116上时，对于点光源(与反射表面间隔距离相比非常小的基准范围802)来说，可以通过来自图8A的透镜112的射线跟踪几何形状来确定每个伪像824和826的近似直径，使得上反射表面伪像826可以通过射线811与上表面810的相交来近似，并且下反射表面伪像824可以通过射线811与下表面812的相交来近似，每个伪像在近似中分别形成模糊圈伪像和检测器，其中基准范围802与从反射表面116到812或者从反射表面116到810的间隔距离相比是可忽略的尺寸。当焦点在表面810和812之间改变时，所得到的模糊圈824和826将在相反方向上改变直径，并且每个模糊圈的尺寸将指示到期望反射界面(例如116)的间隔距离，并且可以用于初始聚焦。因此，可以根据模糊圈伪像824和826的直径结合流动池的反射表面间距来确定期望反射界面116，并且此后聚焦算法可以改变为使用基准本身的图案(例如830)来精细地调节的聚焦算法，如前面对图5A至5E所描述的。为了最小化相对较强的伪像826对相对较弱的基准图像802的影响，可以期望在图8B的基准图案802之间布置间距以为了合理的流体通道/物镜间隔距离而确保模糊圈伪像826不进入相邻的基准图案内。还可以期望在形成多个反射界面的810/116和116/812之间设置间隔距离以最小化模糊圈伪像824和826对期望基准图像822的影响。

在本申请中，在标称值的数量级内的引用包括标称值的1/10到标称值的10倍的范围，例如大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、110％、120％、150％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％或900％。对近似值的引用(其中“～”用于指示近似值)应被理解为在标称值的1/2到标称值的2倍的范围内，例如大约60％、70％、80％、90％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％或190％。尽管基准透镜108的轴近似垂直于物镜112的轴是优选的，但可以选择分束器106的任何任意角度(其提供基准图像到表面116上的照射)，例如大约20°、30°、40°、45°、50°、60°、70°、80°、90°、100°、110°、120°、130°、135°、140°、150°或160°。流体通道的基本平坦的区域被理解为足够平坦以提供聚焦区域，使得在模糊圈中的直径从一个区域到另一个区域的变化改变小于10倍。可选地，显微镜可以在流体通道的基本平坦的区域从光轴倾斜或者是不平坦的情况下正确地操作，但是具有受限的聚焦区域，这将仅限制聚焦的基准图像的范围和聚焦的荧光标记检测器图像的范围。在倾斜的或非平坦区域的这个示例中，基本平坦被理解为仅指被聚焦或可以被聚焦的图像的区域。

当前的示例仅为了说明的目的被提供，且并不意欲将本发明限制为仅示出的实施例。

Claims (23)

1.一种显微镜，包括：

基准图像掩模，其能够在一个表面上被照亮，并且位于距基准透镜的焦距处；

物镜，其位于与检测器透镜共有的轴上；

分束器，其位于所述物镜和所述检测器透镜之间，所述分束器能够从所述基准透镜接收光能并将所述光能引导到所述物镜；

检测器，其位于距所述检测器透镜的焦距处并且能够接收从多个部分反射表面反射的光能，所反射的光能被引导通过所述物镜、所述分束器和所述检测器透镜。

2.根据权利要求1所述的显微镜，其中所述基准图像掩模包括线的阵列或圆的阵列。

3.根据权利要求2所述的显微镜，其中，所述线的阵列形成交替的棋盘图案。

4.根据权利要求1所述的显微镜，其中，所述多个部分反射表面包括具有至少一个平坦区域的流体通道。

5.根据权利要求1所述的显微镜，其中，所述多个部分反射表面中的至少一个部分反射表面具有比不同的部分反射表面大于或小于至少1％的折射率。

6.根据权利要求1所述的显微镜，其中，至少一个部分反射表面由具有基本平坦的内表面的流体通道形成。

7.根据权利要求1所述的显微镜，其中，所述检测器是光电检测器单元的2D阵列，操作来从所述多个部分反射表面中的至少一个部分反射表面形成反射基准光能的2D图像以及还有直接荧光标记能量的2D图像。

8.根据权利要求1所述的显微镜，其中，所述分束器位于相对于所述物镜和检测器透镜的轴成大约45度角处。

9.一种显微镜，包括：

流动池，其具有基本平坦的内表面区域，所述流动池具有操作来运送流体的流体通道；

基准图像掩模，其产生准直光束并耦合到分束器，所述分束器将所述准直光束引导到物镜并引导到位于离所述物镜的可调节距离处的所述流体通道的基本平坦的区域上；

检测器透镜，其在与所述物镜的共有光轴上并接收来自所述基本平坦的区域的反射光能，所述反射光能穿过所述分束器，且之后到达检测器透镜和基准检测器，所述基准检测器位于离所述检测器透镜的检测器透镜焦距处；

光源，其用于激发在所述流动池中的荧光标记物；

一个或更多个荧光标记光路，其耦合到在所述共有光轴上的荧光标记光能，每个荧光标记光路将特定范围的波长引导到相关联的荧光标记检测器；

从所述物镜到所述基本平坦的区域的所述可调节距离操作来将所述基准图案的聚焦图像提供到所述基准检测器上；

每个荧光标记光路的一个或更多个检测器操作来当所述光源启动时提供附着到所述流体通道的表面的荧光标记物的聚焦图像。

10.根据权利要求9所述的显微镜，其中，所述基准检测器控制所述可调节距离以在所述基准检测器处形成聚焦图像。

11.根据权利要求9所述的显微镜，其中，所述流体通道的所述基本平坦的区域是所述流体通道的上表面。

12.根据权利要求9所述的显微镜，其中，每个荧光标记路径包括二向色反射器、检测器透镜和检测器。

13.根据权利要求9所述的显微镜，其中，每个荧光标记光路操作来独立地指示与腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)中的至少一个相关联的荧光标记。

14.根据权利要求9所述的显微镜，其中，流体路径在垂直于所述基本平坦的区域的区域中具有至少10％的折射率变化。

15.根据权利要求9所述的显微镜，其中，所述基准图像掩模包括线的阵列或圆的阵列。

16.根据权利要求9所述的显微镜，其中，所述流体通道在至少一侧上由玻璃表面界定。

17.一种用于使流体通道中的荧光标记物成像的方法，所述流体通道具有与所述流体通道相邻的反射界面，所述方法在显微镜中操作，所述显微镜具有在离所述反射界面的可调节距离处的物镜、通过所述物镜将准直基准图案耦合到所述反射界面上的基准图案生成器、接收从所述反射界面反射的光能并在基准检测器处形成图像的检测器透镜和所述基准检测器、以及从所述反射界面处的荧光标记物接收光能的一个或更多个荧光标记光路，所述方法包括：

激活所述基准图案生成器；

调节从物镜到所述反射界面的距离，直到聚焦图像出现在所述基准检测器处为止；

应用荧光标记光源以使所述荧光标记物发荧光；

在相应的荧光标记光路的每个荧光标记检测器处形成荧光标记物的聚焦图像。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，当所述荧光标记光源被启用时，所述基准图案生成器不被启用。

19.根据权利要求17所述的方法，其中，所述流体通道具有上表面，并且所述反射界面相邻于所述流体通道的上表面。

20.根据权利要求17所述的方法，其中，每个荧光标记光路操作来独立地指示与腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)中的至少一个相关联的荧光标记。

21.根据权利要求17所述的方法，其中，每个荧光标记光路包括操作来反射特定范围的波长并使其他波长通过的二向色反射器，每个二向色反射器将特定范围的波长引导到相应的检测器透镜和相应的荧光标记检测器。

22.根据权利要求17所述的方法，其中，利用交替的棋盘基准图案来执行调节从所述物镜到所述反射界面的所述距离，所述交替的棋盘使用一系列细线和大间隙形成，所述基准检测器使从所述物镜到所述反射界面的所述距离变化，直到所述基准检测器基于解析交替的棋盘图案感测到聚焦图像为止，所述基准检测器使从所述物镜到所述反射界面的所述距离沿相同的方向变化，直到所述棋盘的各条线被聚焦为止。

23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述基准检测器使用基准特征的宽度的变化和峰至峰振幅的变化来确定是增加还是减小从所述物镜到所述反射界面的所述距离。

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