CN114574401A - 乙偶姻在提高根际促生菌在植物根际定殖上的应用 - Google Patents

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CN114574401A CN202210364181.0A CN202210364181A CN114574401A CN 114574401 A CN114574401 A CN 114574401A CN 202210364181 A CN202210364181 A CN 202210364181A CN 114574401 A CN114574401 A CN 114574401A
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Abstract

本发明公开了乙偶姻在提高根际促生菌在植物根际定殖上的应用。本发明筛选获得一种提高根际促生菌在根际定殖的信号分子乙偶姻，研究发现，乙偶姻显著增加植物根际促生菌的泳动作用以及生物膜的形成，显著增加根际促生菌在植物根际的定殖，有效促进植物生长，增强对盐胁迫的耐受性。

Description

乙偶姻在提高根际促生菌在植物根际定殖上的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及乙偶姻在提高根际促生菌在植物根际定殖上的应用。
背景技术
植物根际促生菌(Plant growth promoting rhizobacterial,PGPR)是指存在于植物根际周围的一类可促进植物生长及其对营养的吸收和利用，提高作物对非生物胁迫的抗性，防治病害并有效降低病原菌对植物危害的有益细菌的总称，是植物根际生物群落的重要组成部分。PGPR对植物生长发育促进作用的机制复杂，路径较多。其在根际的定殖是其发挥功效的先决条件。
菌株的生物膜形成能力和泳动能力是PGPR在植物根际定殖的有效指标。细菌生物膜是指细菌为适应自然环境，菌体通过附着在物体表面，释放一系列物质，形成了***性的菌体群落。Chen等人(Chen Y,Fang Y,Chai Y,et al.Biocontrol of tomato wiltdisease by Bacillus subtilis isolates from natural environments depends onconserved genes mediating biofilm formation[J].Environmental Microbiology,2013,15(3):848-864.)研究发现植物根际促生菌枯草芽孢杆菌通过在番茄根系形成浓密的生物膜来提高其定殖能力。而泳动能力在细菌生物膜形成的早期起着关键性作用。研究发现(朱耀磊,侯红漫,张公亮,等.蜂房哈夫尼菌群体感应对其生物膜及泳动性的调控作用[J].食品科学,2020,41(14):169-174.)H.alvei H4在luxRI基因敲除后，其泳动性显著降低，从而影响了细菌与介质表面的接触，进一步导致生物膜形成的减少。因此简单有效地提高植物根际促生菌泳动能力和生物膜的形成是其在根际定殖的有效途径。
乙偶姻是一种挥发性生物活性物质，其化学名为3-羟基-2-丁酮，是一种在食品、化工、制药和烟草行业中广泛使用的化合物，也是多种微生物的次生代谢产物。作为信号分子提高根际促生菌在植物根际定殖的研究未见报道。
发明内容
本发明提出了乙偶姻作为信号分子在提高根际促生菌在植物根际定殖上的应用
其中，乙偶姻显著提高根际促生菌的泳动直径和生物膜形成。
其中，所述根际促生菌为枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilissubsp.subtilis)NRCB002、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NRCB005、白色芽孢杆菌(Bacillus albus)Lv5A和施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)NRCB010中的任意一种。
其中，枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)NRCB002已于2019年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.17213，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其详细信息披露于专利CN201910191640.8中。解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)NRCB005已于2019年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.17214，其详细信息披露于CN201910191639.5中。白色芽孢杆菌(Bacillus albus)Lv5A已于2021年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.21616，其详细信息披露于CN202110232414.7中。施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)NRCB010已于2019年12月02日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNO.19067，其详细信息披露于CN202010071098.5中。
在一些具体实施例中，本发明发现乙偶姻可促进根际促生菌在生菜或番茄作物上的定殖。
本发明进一步提出了乙偶姻在制备用于提高根际促生菌在植物根际定殖的制剂上的应用。
另外，本发明提出了一种提高根际促生菌在根际定殖的方法，向植物根际或植物根际促生菌发酵液中添加乙偶姻。
本发明进一步发现，乙偶姻可以提高植物株高、茎粗、叶面积、地上鲜重、地下鲜重、地上干重、地下干重、根长、根表面积和根体积，特别是可以缓解植株的盐胁迫，验证了乙偶姻对于生菜和番茄的促生长和耐盐胁迫的作用。
优选地，向植物根际促生菌发酵液添加乙偶姻的浓度为0.1～10g/L。更优选地，向植物根际促生菌发酵液添加乙偶姻的最优浓度为0.1～2g/L。
优选地，向植物根际添加乙偶姻的浓度为0.1～10g/L。更优选地，向植物根际添加乙偶姻的最优浓度为0.1～2g/L。
有益效果：本发明公开了乙偶姻在提高根际促生菌在植物根际定殖上的应用，本发明筛选获得一种促进根际促生菌在根际定殖的信号分子乙偶姻，研究发现，乙偶姻显著增加植物根际促生菌的泳动作用，以及生物膜的形成，显著诱导根际促生菌在植物根际定殖，显著增加植物根际的促生菌数量，有效促进植物生长，增强对盐胁迫的耐受性。因此，乙偶姻在提高根际促生菌在植物根际定殖方面具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为不同浓度(0.1g/L、0.5g/L、2g/L、5g/L和10g/L)的乙偶姻对根际促生菌NRCB002、NRCB005和NRCB010生物膜形成量的影响；(P<0.05)
图2为乙偶姻对根际促生菌NRCB002、NRCB005、NRCB010泳动直径的影响；(P<0.05)
图3为在不同浸泡时间下，乙偶姻对根际促生菌NRCB002在根际定殖的影响，其中，(A)为番茄在浸泡30min、60min和90min后，乙偶姻处理下番茄根际定殖的NRCB002活菌数(×107)；(B)为生菜在浸泡30min、60min和90min后，乙偶姻处理下生菜根际定殖的NRCB002活菌数(×107)；(P<0.05)
图4为不同浓度(0.1g/L、0.5g/L、2g/L、5g/L和10g/L)乙偶姻对根际促生菌NRCB002在根际定殖的影响，(A)为不同浓度乙偶姻处理下番茄根际定殖的NRCB002活菌数(×107)，(B)为不同浓度乙偶姻处理下生菜根际定殖的NRCB002活菌数(×107)；(P<0.05)
图5为乙偶姻在盐胁迫下和正常条件下对番茄的促生效果图；其中，NaCl为盐渍土+去离子水处理；NaCl+乙偶姻为盐渍土+乙偶姻处理；CK为农田土+去离子水处理；CK+乙偶姻为农田土+乙偶姻处理；
图6为乙偶姻在盐胁迫下和正常条件下对番茄的地上和地下干重影响；其中，NaCl为盐渍土+去离子水处理；NaCl+乙偶姻为盐渍土+乙偶姻处理；CK为农田土+去离子水处理；CK+乙偶姻为农田土+乙偶姻处理；
图7为乙偶姻在盐胁迫下和正常条件下对生菜的促生效果图，其中，NaCl为盐渍土+去离子水处理；NaCl+乙偶姻为盐渍土+乙偶姻处理；CK为农田土+去离子水处理；CK+乙偶姻为农田土+乙偶姻处理；
图8为乙偶姻在盐胁迫下和正常条件下对生菜的地上和地下干重影响，其中，NaCl为盐渍土+去离子水处理；NaCl+乙偶姻为盐渍土+乙偶姻处理；CK为农田土+去离子水处理；CK+乙偶姻为农田土+乙偶姻处理。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1不同浓度的乙偶姻对根际促生菌NRCB002、NRCB005、Lv5A和NRCB010生物膜形成量的影响。
(1)实验方法
从平板上接各个菌至50ml离心管中，30℃，200rpm培养12小时，吸取1％接种量至装有50ml LB培养液的250锥形瓶中，过夜培养。吸取20ml至灭菌的50ml离心管中，在5000rpm离心5min，离心后倒掉上清液，加入等量无菌生理盐水轻轻混匀，同样操作方法重复2次。用K氏培养基稀释至OD值为1.0左右。向96孔塑料培养板依次加入菌液37.5μL，含不同浓度乙偶姻(0.1、0.5、2、5、10g/L)的K氏培养基112.5μL，每个处理设置8个平行，以不含乙偶姻(0g/L)的K氏培养基为空白对照，于28℃静置培养48h。培养48h后，用移液枪轻轻吸取96孔板中的液体，加入160μL蒸馏水清洗浮游细菌。向孔板中加入160μL 2％结晶紫，在室温下染色10min，吸取染色液，用蒸馏水清除未结合的结晶紫，晾干后，向培养孔中加入160μL 30％的乙酸，将孔板中的生物膜充分溶解。用酶标仪测定溶液在OD560 nm处的吸光值。生物膜形成量用OD560 nm处的吸光值表示。
(2)实验结果
表1.不同浓度的乙偶姻对根际促生菌生物膜形成量
Figure BDA0003585177850000041
Figure BDA0003585177850000051
备注：数据表示平均值±标准误差(n＝8)；数字后不同字母表示相同指标中的处理间具有显著性差异(P<0.05)。
从表1和图1可以看到，乙偶姻能够显著促进根际促生菌NRCB002、NRCB005和NRCB010生物膜的形成，对Lv5A无明显效果；在浓度0.1g/L、0.5g/L、2g/L和5g/L时，NRCB002较对照组，显著增加了148.9％、108.1％、137.7％和108.0％；NRCB005较对照组增加了80.6％、91.1％、124.3％和80.2％；NRCB010增幅依次为156.4％、185.0％、125.1％和111.7％。以上结果表明，乙偶姻在一定浓度范围内可以有效促进根际促生菌生物膜的形成；当浓度过高时乙偶姻对菌株生物膜的形成能力降低。
实施例2乙偶姻对根际促生菌NRCB002、NRCB005和NRCB010泳动直径的影响。
根据实验1所得结果，进一步探究乙偶姻对根际促生菌NRCB002、NRCB005和NRCB010泳动直径的影响。
(1)实验方法
Swimming培养基：每1L中含胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母粉5g和琼脂粉5g。
使用NBNS液体培养基接种过夜活化的菌株NRCB002、NRCB005、NRCB010种子液。30℃，200rpm条件下培养至对数中期(OD600＝1.0)。向Swimming平板中加入100μl 0.1g/L乙偶姻溶液并均匀涂布，在平板中央放置一直径为0.5cm的圆形无菌纸片，用枪头吸取5μl菌液缓慢滴至纸片中央，在无菌环境下静置十分钟，将平板轻柔移至30℃生化培养箱倒置培养，分别在12h、8h和24h时间点测定NRCB002、NRCB005、NRCB010所形成的菌环的直径。。以不加乙偶姻溶液涂布的Swimming平板为空白对照。每组平行3份。
(2)实验结果
表2.乙偶姻对根际促生菌泳动直径的影响
Figure BDA0003585177850000052
备注：数据表示平均值±标准误差(n＝3)；数字后不同字母表示相同指标中的处理间具有显著性差异(P<0.05)。
结果如表2和图2，乙偶姻可有效提高菌株的泳动直径。NRCB002在泳动性平板表面培养12h后，相比于对照组，扩散直径提高了41.1％；NRCB005在泳动性平板表面培养8h后，相比于对照组，扩散直径提高了68.4％；NRCB010在泳动性平板表面培养24h后，相比于对照组，扩散直径显著提高了61.1％。
实施例3乙偶姻对根际促生菌NRCB002在植物根际定殖的作用。
因生物膜形成能力和泳动能力是提高促生菌在根际定殖是的重要指标，针对实施例1和实施例2选择根际促生菌NRCB002，研究乙偶姻对根际促生菌NRCB002在根际定殖的作用，具体的实验方法和实验结果如下：
(1)实验方法
番茄和生菜种子处理：用2.5％的84消毒液处理10min(剧烈晃动)，用无菌水冲洗7-10次，再用无菌水浸泡5min，2次，去除水分后，将种子均匀撒在配置好的琼脂平板上，并放置在光照培养箱中催芽。
菌种处理：NRCB002接于10ml LB培养基的50ml离心管中，200rpm，30℃过夜培养，测OD600，调节OD600至1.0，记录稀释倍数。5000rpm离心10min，去上清，并在无菌条件下用无菌水等量重悬2次后，再用无菌水稀释100倍。
植物培养：①幼苗的浸泡时间对促生菌在根际定殖的影响：无菌环境下，将催芽2-3后的番茄和生菜幼苗在菌液中浸泡30min、60min和90min。在无菌的环境下取出处理好的幼苗，放置在无菌纸上，吹干，移种到添加0.1g/L乙偶姻的1/10MS固体培养基的方形平板上。在方形平板约1/3处平行摆放幼苗，每个培养基七个，保证幼苗方向、幼苗间间隔一致。以不添加乙偶姻的1/10MS固体培养基的方形平板为空白对照，每个处理3个重复。光照培养箱培养7-10天后观察结果。
②不同浓度乙偶姻对促生菌在根际定殖的影响：无菌环境下，将催芽2-3天后的番茄和生菜幼苗在菌液中浸泡30min。在无菌的环境下取出处理好的幼苗，放置在无菌纸上，吹干，移种到添加0.1g/L、0.5g/L、2g/L、5g/L和10g/L乙偶姻的1/10MS固体培养基的方形平板上。在平板约1/3处平行摆放幼苗，每个培养基七个，保证幼苗方向、幼苗间间隔一致。以不添加乙偶姻的1/10MS固体培养基的方形平板为空白对照，每个处理3个重复。光照培养箱培养7-10天后观察结果。
计数：将番茄种子光照培养培养7～10天后，在无菌的环境下将番茄根部剪下并用无菌水反复清洗表面未定殖的菌体和残留的培养基。然后，将根称重并加入无菌水研磨，最后将获得的根浊液用生理盐水依次稀释至10-3、10-4、10-5，并涂布于LB培养基上，每个处理包含3次重复，再置于30℃的培养箱中培养12h。采用平板计数法测定定殖到番茄根部的活细菌数量。以生理盐水和最后一次冲洗番茄根部的无菌水作为阴性对照。通过根重对计数结果进行标准化。定殖到番茄根部的质量有效活菌数用以下公式进行计算：
N(个/g)＝x×k×V1/m×V2
其中，x为活菌落个数(个)；k为稀释倍数；V1为根浊液总体积(ml)；V2为根浊液加入量(ml)；m为根质量(g)。为了更加直观地体现有效活菌数的数量多少，可以用log10CFU g-1来表述最终的测定结果。
(2)实验结果
①如图3A所示，番茄幼苗在菌液中浸泡30min、60min、90min后放置于浓度为0.1g/L乙偶姻的1/10MS固体培养基的方形平板中，浸泡不同时间根际定殖的有效活菌数分别为5.45×106cfu/g、6.04×106cfu/g和5.51×106cfu/g，而未添加乙偶姻处理的空白对照组根际定殖的活菌数为2.22×106cfu/g、2.61×106cfu/g和2.39×106cfu/g，定殖数量分别增加了145.6％、131.7％、130.4％。
如图3B所示，生菜幼苗在菌液中浸泡30min、60min、90min后放置于浓度为0.1g/L乙偶姻的1/10MS固体培养基的方形平板中，浸泡不同时间根际定殖的有效活菌数分别为4.97×106cfu/g、5.43×106cfu/g和5.37×106cfu/g，而未添加乙偶姻处理的空白对照组根际定殖的活菌数为2.08×106cfu/g、2.33×106cfu/g和2.06×106cfu/g，定殖数量分别增加了138.7％、133.2％、160.3％。
结果表明：①浸泡30min、60min、90min的番茄和生菜幼苗在添加乙偶姻和未添加乙偶姻的培养基中有效活菌数均无显著性差异，即浸泡时间在30-90min内菌株根际定殖能力变化不大；②而菌株NRCB002在添加后，可以看到根际定殖能力均存在显著提升。
②如图4A所示，番茄幼苗在菌液中浸泡30min并均匀放置于乙偶姻浓度分别为0g/L、0.1g/L、0.5g/L、2g/L、5g/L和10g/L的1/10MS固体培养基的方形平板中。发现乙偶姻浓度在0.1g/L、0.5g/L、2g/L的定殖效果最显著，且相互之间无显著差异，其有效活菌数达到5.98×106cfu/g、5.83×106cfu/g和6.05×106cfu/g；5g/L的乙偶姻也能增强菌的定殖效果，其定殖的有效活菌数分别为5.07×106cfu/g；而10g/L的乙偶姻无明显促进效果；未添加乙偶姻处理的空白对照组根际定殖的活菌数为2.73×106cfu/g。结果表明：乙偶姻能增强菌在番茄的根际定殖效果，在0.1g/L-2g/L时其效果最好。
如图4B所示，生菜幼苗在菌液中浸泡30min并均匀放置于乙偶姻浓度分别为0g/L、0.1g/L、0.5g/L、2g/L、5g/L和10g/L的1/10MS固体培养基的方形平板中。发现乙偶姻浓度在0.1g/L、0.5g/L、2g/L的定殖效果最显著，且相互之间无显著差异，其有效活菌数达到5.55×106cfu/g、5.80×106cfu/g和5.36×106cfu/g；5g/L的乙偶姻也能增强菌的定殖效果，其定殖的有效活菌数分别为4.70×106cfu/g；而10g/L的乙偶姻无明显促进效果；未添加乙偶姻处理的空白对照组根际定殖的活菌数为2.53×106cfu/g。结果表明：乙偶姻液能增强菌在生菜中的根际定殖效果，在0.1g/L-2g/L时其效果最好。
乙偶姻对与促生菌的生物膜、泳动性和根际定殖能力有着良好的促进作用。选择土壤盆栽实验，验证乙偶姻是否对植物的生长有良好的促生效果。
实施例4和实施例5是乙偶姻体外对植物促生的作用。
实施例4乙偶姻在盐胁迫下和正常条件下对番茄生长的影响。
(1)实验内容
实验在南京工业大学材料与化学工程国家重点实验室人工温室进行，种子在浸泡3小时后，播种在含土壤(54cm×28cm)的塑料托盘中。约两周后挑选并移植到含有320g风干土壤的纸杯(360ml)中，每盆两株幼苗。移苗后的第2天和第7天进行处理，实验设计为两种土壤环境：盐渍土(3g NaCl/kg农田土)和农田土，两种叶面处理方式：0.1g/L乙偶姻溶液和去离子水，每盆10mL；每个处理6个重复。60％～70％相对湿度的环境中进行，光照14h/暗光10h为周期。每天更换纸杯的位置，以确保随机化，早晚各浇水一次。移苗两周后测量SPAD，收获的样品测量生菜各指标，包括SPAD、叶面积、株高、总根长、总根表面积、总根体积等参数，洗净后称量其鲜重，在70℃下烘干至恒重，称量其干重。
2、实验结果
表3.乙偶姻在盐胁迫下和正常条件下对番茄地上部分的影响
Figure BDA0003585177850000091
注；数据表示平均值±标准误差(n＝6)；数据后不同字母表示不同的显著性差异(P<0.05)。
表4.乙偶姻在盐胁迫下和正常条件下对番茄地下部分的影响
Figure BDA0003585177850000092
注；数据表示平均值±标准误差(n＝6)；数据后不同字母表示不同的显著性差异(P<0.05)。
从表3可以看出，乙偶姻能显著促进番茄地上部的生长发育，增强了植物的抗胁迫能力。在盐胁迫条件下，番茄的株高和茎粗较对照存在显著差异，分别增加了41.1％和15.7％；无盐胁迫下，株高、茎粗和叶面积分别增加了22.1％、24.7％和28.4％。可以看到乙偶姻可以显著提高盐胁迫和无盐胁迫下番茄的株高和茎粗。从表4可知，乙偶姻显著促进根系的生长发育，在盐胁迫条件下，番茄的根长、根表面积显著增加了43.8％和47.9％；无盐胁迫下，施加乙偶姻后，番茄的根表面积、根体积显著增加了29.6％和81.0％。对生菜的重量进行测量，这是生菜是否有明显增加的直观体现。盐胁迫下，地上鲜重和地下鲜重的增幅依次为42.8％和54.2％(表3和表4)；无盐胁迫下，地上鲜重和地下鲜重的增幅为49.3％和45.9％(表3和表4)。以干重为核心指标来看(图6)，我们看到，盐胁迫下的生菜地上干重和地下干重依次增加54.8％和49.2％，无盐胁迫下的生菜地上干重和地下干重依次增加63.3％和46.5％。分析以上数据，乙偶姻不仅可以促进番茄的生长发育，还可以提高番茄的抗逆性。
实施例5乙偶姻在盐胁迫下和正常条件下对生菜生长的影响。
(1)实验内容
生菜幼苗的培养方法和设计同实施例4。
(2)实验结果
表5.乙偶姻在盐胁迫下和正常条件下对盆栽生菜生长的影响
Figure BDA0003585177850000101
注；数据表示平均值±标准误差(n＝6)；数据后不同字母表示不同的显著性差异(P<0.05)。
从表5可知，乙偶姻能显著促进生菜的生长发育。在盐胁迫条件下，生菜的株高和叶面积较对照显著增加了23.8％和46.0％，乙偶姻可以显著提高盐胁迫下生菜的株高和叶面积。对生菜的重量进行测量，盐胁迫下，地上鲜重和地下鲜重依次增加了59.5％和79.5％；无盐胁迫下，地上鲜重和地下鲜重依次增加了32.6％和28.5％。以干重为核心指标来看(图8)，我们看到，盐胁迫下的生菜地上干重和地下干重分别增加了56.6％和41.2％，无盐胁迫下的生菜地上干重和地下干重分别增加了34.3和23.1％。分析以上数据，乙偶姻可促进生菜的生长发育，提高生菜的抗逆性。
本发明提供了一种提高根际促生菌在植物根际定殖上的应用思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (10)

1.乙偶姻在提高根际促生菌在植物根际定殖上的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，乙偶姻提高植物根际促生菌的生物膜形成量和泳动直径。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述根际促生菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NRCB002、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）NRCB005、白色芽孢杆菌（Bacillus albus）Lv5A和施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）NRCB010中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为生菜或番茄。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，乙偶姻被用于制备提高根际促生菌在植物根际定殖的制剂。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，应用时，向植物根际促生菌发酵液中或植物根际处添加乙偶姻。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，向植物根际促生菌发酵液添加乙偶姻的浓度为0.1~10g/L。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，向植物根际促生菌发酵液添加乙偶姻的浓度为0.1~2g/L。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，应用时，向植物根际添加乙偶姻的浓度为0.1~10g/L。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，向植物根际添加乙偶姻的浓度为0.1~2g/L。
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