CN112608874A - 一种具有促生活性的芽孢杆菌属细菌及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有促生活性的芽孢杆菌属细菌，该菌株为短小芽孢杆菌（Bacillus pabuli）B05，其保藏编号为CGMCC No.21387。同时，本发明还公开了该菌株的制备方法和应用。本发明从植物根部分离出菌株，并将菌株的代谢物作用于牧草，用于改良草原土壤生物化学肥力状况，提高草原土壤生态***功能稳定性，恢复和提高草原生产力，增加产量、提高品质从而促进畜牧业的发展。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种具有促生活性的芽孢杆菌属细菌及其制备方法和应用。
背景技术
植物根际促生细菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR) 可以在一定程度上增强植物对干旱、盐碱和高温等非生物因素胁迫的耐受性，还可以通过固氮、溶磷、解钾及降低乙烯水平等方式对植物生长发育进行调节。近些年来，基于PGPR在农业、环境保护等领域的重要价值, 已成为国内外学者研究的热点。现已发现假单胞菌（Pseudomonas）、芽胞杆菌（Bacillus）、类芽胞杆菌（Paenibacillus）、土壤杆菌（Agrobacterium）、黄杆菌(Flavobacterium)等20多个种属的根际生物具有防病促生的潜能。其中，芽孢杆菌由于产生芽孢，抗逆性强，是目前研究最深入、最广泛的促生细菌之一。
近年来研究表明，由于过量施用化肥而导致草原土壤酸化、营养失衡、生物多样性减少、生产力降低、草地退化等严重威胁到草原生态***功能。在此背景下，通过接种PGPR可用来改良草原土壤生物化学肥力状况，提高草原土壤生态***功能稳定性，恢复和提高草原生产力，增加产量、提高品质从而促进畜牧业的发展。因此，微生物菌剂成为新的研究热点，通过选育具有抗病和促生特性的内生菌及根际微生物，用于提高牧草的生长和抗病能力，从而治理退化的草场。
目前，开发利用安全有效的生物源促生剂越来越受到广泛的关注，而微生物的次级代谢产物成为研究和开发新的促生产品的重要来源之一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有促生活性的芽孢杆菌属细菌。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供该芽孢杆菌属细菌的制备方法。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供该芽孢杆菌属细菌的应用。
为解决上述问题，本发明所述的一种具有促生活性的芽孢杆菌属细菌，其特征在于：该菌株为短小芽孢杆菌（Bacillus pabuli）B05。该菌株B05已于2020年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址是：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编是100101，保藏编号为CGMCC No.21387。
如上所述的一种具有促生活性的芽孢杆菌属细菌的制备方法，其特征在于：选取健康紫花针茅带根植株，将紫花针茅新鲜的根部切成长度为0.2~0.5厘米的小段，经消毒后用灭菌蒸馏水冲洗三次，并置于无菌滤纸上吸干水分；然后放置于TSA平板培养基上，28±2℃避光培养；待平板上长出肉眼可见的细菌菌落后，用无菌牙签挑取少许菌落转移至新的TSA平板培养基上进行纯化，没有污染，则转入TSA斜面培养基划线在4℃下短期保存或转入TSA液体培养基和甘油的混合液中在-70℃下保存长期保存即得。
所述消毒是指对切段的紫花针茅新鲜的根部先经体积浓度为75%的乙醇表面消毒30 s，再经质量浓度为3%的次氯酸钠表面消毒5 min。
所述TSA平板培养基是指在1000mL水中加入胰蛋白胨15g、大豆蛋白胨 5g、氯化钠5g、琼脂18g，混合均匀后调pH值至7.1~7.5，经121℃灭菌20min制得。
所述TSA液体培养基是指在1000mL水中加入胰蛋白胨15g、大豆蛋白胨 5g、氯化钠5g，混合均匀后调pH值至7.1~7.5，经121℃灭菌20min制得。
所述肉眼可见的细菌菌落即colony-forming units，CFU为平均直径在大于等于1mm以上的菌落。
所述肉眼可见的细菌菌落的计数方法是指浓度平板方法，即在直径为90 mm的培养皿中，肉眼可见的单个分散的菌落数在100~150 CFU。
所述TSA液体培养基和甘油的混合液是指TSA液体培养基与甘油按3:1的体积比混合均匀所得的溶液。
如上所述的一种具有促生活性的芽孢杆菌属细菌的应用，其特征在于：将短小芽孢杆菌（Bacillus pabuli）B05稀释200倍所得的菌液作为紫花针茅牧草的植物生长促生剂。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明从紫花针茅（Stipa purpurea）的根部分离出菌株，并将菌株的代谢物作用于植物。菌株B05属于芽孢杆菌属（Bacillus sp.），其菌落为白色，光滑湿润，具有光泽，表面有褶皱。
2、本发明短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）B05作为植物生长调节剂，其代谢物对牧草生长具有明显的促生活性，使其根系发达，地上部分生物量增加，增强牧草的抗逆活性。经不同稀释浓度代谢物的处理和对照H2O处理有显著差异，稀释之后的发酵液的促生效果非常显著。
3、本发明原材料来源于植物根部，对于环境及植物、人、动物等所有生物无不良影响，而且生产成本低，生产过程简单，不污染环境，适合于推广应用。
4、本发明生物生长调节剂为纯生物制剂，可调节西北高寒草地紫花针茅牧草的生长，用于改良草原土壤生物化学肥力状况，提高草原土壤生态***功能稳定性，恢复和提高草原生产力，增加产量、提高品质从而促进畜牧业的发展。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明短小芽孢杆菌B05菌液对牧草生长的初步实验，图中上边的牧草为对照组（蒸馏水），下边的牧草为菌液组。
图2为本发明短小芽孢杆菌B05不同浓度代谢物对紫花针茅（鲜重）的影响。
图3为本发明短小芽孢杆菌B05不同浓度代谢物对紫花针茅（根长）的影响。
图4为本发明短小芽孢杆菌B05不同浓度代谢物对紫花针茅（茎长）的影响。
具体实施方式
一种具有促生活性的芽孢杆菌属细菌，该菌株为短小芽孢杆菌（Bacillus pabuli）B05。该菌株B05已于2020年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址是：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编是100101，保藏编号为CGMCC No.21387。
该芽孢杆菌属细菌的制备方法：选取健康紫花针茅带根植株，将紫花针茅新鲜的根部切成长度为0.2~0.5厘米的小段，先经体积浓度为75%的乙醇表面消毒30 s，再经质量浓度为3%的次氯酸钠表面消毒5 min。消毒后用灭菌蒸馏水冲洗三次，并置于无菌滤纸上吸干水分；然后放置于TSA平板培养基上，28±2℃避光培养；待平板上长出肉眼可见的细菌菌落后，用无菌牙签挑取少许菌落转移至新的TSA平板培养基上进行纯化，没有污染，则转入TSA斜面培养基划线在4℃下短期保存或转入TSA液体培养基和甘油的混合液中在-70℃下保存长期保存即得。
其中：TSA平板培养基是指在1000mL水中加入胰蛋白胨15g、大豆蛋白胨 5g、氯化钠5g、琼脂18g，混合均匀后调pH值至7.1~7.5，经121℃灭菌20min制得。
TSA液体培养基是指在1000mL水中加入胰蛋白胨15g、大豆蛋白胨 5g、氯化钠5g，混合均匀后调pH值至7.1~7.5，经121℃灭菌20min制得。
肉眼可见的细菌菌落即colony-forming units，CFU为平均直径在大于等于1 mm以上的菌落。
肉眼可见的细菌菌落的计数方法是指浓度平板方法，即在直径为90 mm的培养皿中，肉眼可见的单个分散的菌落数在100~150 CFU。
TSA液体培养基和甘油的混合液是指TSA液体培养基与甘油按3:1的体积比混合均匀所得的溶液。
该具有促生活性的芽孢杆菌属细菌的应用：将短小芽孢杆菌（Bacillus pabuli）B05稀释200倍所得的菌液作为紫花针茅牧草的植物生长促生剂。
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法。
实施例1 利用传统的分离方法分离植物根部细菌
从甘肃省张掖市肃南县康乐乡巴音村（38°49′29″N，99°54′44″W；海拔2815m）的紫花针茅根部分离出菌株B05。其方法如下：选取健康紫花针茅带根植株，将紫花针茅新鲜的根部切成小段（0.2-0.5厘米）进行消毒，75%乙醇表面消毒30 s；3%次氯酸钠表面消毒5min，最后，样品要用灭菌蒸馏水冲洗三次，置于无菌滤纸上吸干水分，放置于TSA平板培养基上，28±2℃避光培养，待平板上长出肉眼可见的细菌菌落后，用无菌牙签挑取少许菌落转移至新的TSA平板培养基上进行纯化，没有污染，则转入TSA斜面培养基，4℃短期保存。
本发明所提供的菌株为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）B05。该菌株B05已于2020年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址是：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNo.21387。
实施例2 菌的培养及代谢物的制备
1、一级菌种培养：将保存在斜面培养基上的菌株B05转接活化到TSA平板培养基上，28~30℃避光培养，待长出肉眼可见的菌落后作为一级菌种。
2、二级菌种培养：将经过活化的一级菌种接种到TSA液体培养基上，放置在温度为28~30℃，转速为180 rpm的摇床上避光培养，定期观察记录，待培养液变浑浊（约72 h）后，停止振荡培养，转入4℃冰箱短期保存。
3、不同浓度发酵液的制备：采用水作为稀释剂，将菌株B05的代谢物配成100倍、200倍的稀释液，并将灭菌的菌株B05的代谢物配成100倍、200倍的稀释液。
实施例3 芽孢杆菌B05代谢物的促生活性
1、不同浓度的发酵液对紫花针茅的促生活性：
本实施例中以牧草种子紫花针茅为实验材料，萌发试验采用纸上发芽（TP）法，挑选长势相对一致的牧草幼苗摆置于6孔板中进行活性试验，取6孔板然后将发酵液、灭菌发酵液，按照原液、稀释100倍、稀释200倍3个梯度试验，每孔均置8株幼苗，以水做对照，每个处理均设3个平行（参见图1）。于人工气候箱（光10h/暗14h，温度：25℃）中继续培养7d后取出测量幼苗的鲜重、根长和茎长。实验结果用Sigmaplot 12.0软件进行统计分析。
2、结果：
试验组与ck组的比较，见表1和图2~4。实验结果显示，与对照组紫花针茅种子生长效果比较，芽孢杆菌B05稀释200倍的发酵液促生效果最好，其鲜重、根长、茎长分别是ck对照的159.86％、250.82％、64.63％，三个指数与ck对照具有显著性差异，芽孢杆菌B05稀释200倍原液的促生效果最好。
表1 菌株B05的不同浓度代谢物对紫花针茅的促生活性
Claims (9)
1.一种具有促生活性的芽孢杆菌属细菌，其特征在于：该菌株为短小芽孢杆菌（Bacillus pabuli）B05，其保藏编号为CGMCC No.21387。
2.如权利要求1所述的一种具有促生活性的芽孢杆菌属细菌的制备方法，其特征在于：选取健康紫花针茅带根植株，将紫花针茅新鲜的根部切成长度为0.2~0.5厘米的小段，经消毒后用灭菌蒸馏水冲洗三次，并置于无菌滤纸上吸干水分；然后放置于TSA平板培养基上，28±2℃避光培养；待平板上长出肉眼可见的细菌菌落后，用无菌牙签挑取少许菌落转移至新的TSA平板培养基上进行纯化，没有污染，则转入TSA斜面培养基划线在4℃下短期保存或转入TSA液体培养基和甘油的混合液中在-70℃下保存长期保存即得。
3.如权利要求2所述的一种具有促生活性的芽孢杆菌属细菌的制备方法，其特征在于：所述消毒是指对切段的紫花针茅新鲜的根部先经体积浓度为75%的乙醇表面消毒30 s，再经质量浓度为3%的次氯酸钠表面消毒5 min。
4.如权利要求2所述的一种具有促生活性的芽孢杆菌属细菌的制备方法，其特征在于：所述TSA平板培养基是指在1000mL水中加入胰蛋白胨15g、大豆蛋白胨 5g、氯化钠5g、琼脂18g，混合均匀后调pH值至7.1~7.5，经121℃灭菌20min制得。
5.如权利要求2所述的一种具有促生活性的芽孢杆菌属细菌的制备方法，其特征在于：所述TSA液体培养基是指在1000mL水中加入胰蛋白胨15g、大豆蛋白胨 5g、氯化钠5g，混合均匀后调pH值至7.1~7.5，经121℃灭菌20min制得。
6.如权利要求2所述的一种具有促生活性的芽孢杆菌属细菌的制备方法，其特征在于：所述肉眼可见的细菌菌落即colony-forming units，CFU为平均直径在大于等于1 mm以上的菌落。
7.如权利要求6所述的一种具有促生活性的芽孢杆菌属细菌的制备方法，其特征在于：所述肉眼可见的细菌菌落的计数方法是指浓度平板方法，即在直径为90 mm的培养皿中，肉眼可见的单个分散的菌落数在100~150 CFU。
8.如权利要求2所述的一种具有促生活性的芽孢杆菌属细菌的制备方法，其特征在于：所述TSA液体培养基和甘油的混合液是指TSA液体培养基与甘油按3:1的体积比混合均匀所得的溶液。
9.如权利要求1所述的一种具有促生活性的芽孢杆菌属细菌的应用，其特征在于：将短小芽孢杆菌（Bacillus pabuli）B05稀释200倍所得的菌液作为紫花针茅牧草的植物生长促生剂。
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