CN114557403A - 一种可用于高脂低蛋白饲料的硫酸基多糖饲料添加剂的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可用于高脂低蛋白饲料的硫酸基多糖饲料添加剂的制备方法及其应用。本发明通过固态发酵预处理原材料，木聚糖酶、褐藻胶裂解酶、甘露聚糖酶和果胶酶复合酶解，可以在较高底物浓度下进行酶解，极大的提高了酶解速率，同时提高了产物得率，使用环保、高效的工艺手段生产分子量低、可溶性好的硫酸基多糖。硫酸基多糖可以提高卵形鲳鲹在高脂低蛋白饲喂条件下的存活率，生长率，降低并一定程度修复由高脂低蛋白饲料饲喂引起的卵形鲳鲹机体损伤。
Description
技术领域
本发明涉及一种复合酶解制备硫酸基多糖的制备方法，具体是涉及一种木聚糖酶、褐藻胶裂解酶、甘露聚糖酶和果胶酶复合酶解麒麟菜，并制备一种可用于高脂低蛋白饲料的硫酸基多糖饲料添加剂的制备方法及应用。
背景技术
鱼类因消化道较短，消化酶活力低，对饲料蛋白质利用率低，***物中氨氮含量过高。***物积累同时也会导致水体氨氮含量过高，制约鱼类生长和引发鱼类疾病。为降低水体环境中的氮磷含量，预防鱼类爆发疾病，实际养殖过程中在保证饲料营养均衡的条件下，普遍采取减少饲料蛋白质水平和适量提高脂肪水平的策略，这种养殖策略可达到促进鱼体生长、保护养殖水域的目的。但当饲料脂肪水平过高时易致使鱼体脂肪蓄积过量，抗应激能力下降，肝胰脏等组织受到损伤，反而导致鱼体生长缓慢，饵料系数上升，严重时导致高脂血症和营养性脂肪肝的发生，高温季节还会出现大量死亡，给生产造成巨大损失。
硫酸多糖也被称为多糖的硫酸化衍生物，是硫酸根取代了多糖结构中单糖分子的部分羟基而形成的一类具有多种功能的物质，可以通过天然制备或硫酸化的结构修饰而得到。硫酸多糖广泛存在于海藻类植物中，具有多种生理活性，尤其在降血脂、降血压、抗氧化等方面效果明显，且无毒副作用。硫酸基多糖作为优秀的功能性多糖，可以作为优秀的饲料添加剂在鱼类养殖中发挥重要作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种复合酶解制备可用于高脂低蛋白饲料的硫酸基多糖饲料添加剂的制备方法及相关应用。
本发明解决其技术问题所采用的的技术方案是：一种复合酶解制备硫酸基多糖的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：麒麟菜粉菌酶协同发酵：将麒麟菜粉投入均质机，加入麒麟菜粉质量10％的稻壳，随后按照料液比1:1.5加水，发酵用水预先溶解褐藻胶裂解酶，其中褐藻胶裂解酶酶活25000-30000U/g，酶添加量为250-300U/g麒麟菜底物，混合搅拌均匀，将发酵菌接种到物料中，30℃发酵48h。
其中，所述发酵菌株为里氏木霉。
步骤2：木聚糖酶酶解：物料按照料液比约1:10加入水，使用木聚糖酶进行酶解，酶活力30000-40000U/g，酶添加量为300-400U/g麒麟菜底物，酶解温度 45-60℃，作用时间3h；
步骤3：复合酶解：用盐酸调节步骤3酶解结束后酶解液pH至3.5，随即使用甘露聚糖酶和果胶酶进行酶解，其中甘露聚糖酶酶活力40000-50000U/g，酶添加量为300-350U/g麒麟菜底物，果胶酶酶活力25000-30000U/g，酶添加量为 200-250U/g麒麟菜底物，酶解温度45-60℃，作用时间2h；
步骤4：灭酶：酶解液升温至95℃保持15min进行灭酶；
步骤5：板框过滤：灭酶结束后，酶解液进行板框过滤，去除不溶性残渣；
步骤6：醇沉：按酶解液体积的10％向步骤3制备的酶解液中加入乙醇，使大分子糖类物质沉降，随后离心去除酶解残渣；
步骤7：步骤6酶解液使用滤膜过滤除杂除菌，其中滤膜孔径规格为 0.45-0.95μm。
步骤8：酶解液浓缩：离心除杂上清液悬蒸浓缩至固形物含量≥25％；
步骤9：喷雾干燥：进口温度170-190℃，出风温度90-110℃，流速 8-12mL/min，得到硫酸基多糖干粉。
所述复合酶解制备的硫酸基多糖应用方法，其特征在于：此种可用于高脂低蛋白饲料的硫酸基多糖的应用方法包括如下：
方法1：按1％-2％的比例将硫酸基多糖添加进饲料内，混合均匀，按照需要的饲料形态进行加工制备，直接饲喂即可。
方法2：按1％-2％的比例将硫酸基多糖溶解进动物日常饮用水中进行使用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过高温均质降粘，随后使用木聚糖酶、褐藻胶裂解酶、甘露聚糖酶和果胶酶四种酶复合酶解，达到降低反应底物粘度，提高反应底物浓度，极大的提高酶解速率，用环保、高效的的工艺手段生产生产分子量低，可溶性好的硫酸基多糖。具有反应条件温和，操作简单，成本低的优点。
附图说明：
图1.硫酸基多糖对高脂低蛋白饮食卵形鲳鲹肥满度的影响
图2.硫酸基多糖对高脂低蛋白饮食卵形鲳鲹的存活率影响
图3.硫酸基多糖对高脂低蛋白饮食卵形鲳鲹的肝体比影响
图4.硫酸基多糖对高脂低蛋白饮食卵形鲳鲹的脏体比影响
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
1)100g麒麟菜粉中加入10g稻壳，加入165mL发酵用水(水中按300U/g麒麟菜粉底物的量加入褐藻胶裂解酶)，30℃固态发酵48h，每隔12h进行翻拌。
其中，发酵菌为里氏木霉。
2)发酵结束后，向物料中加入1L水，按300U/g麒麟菜粉底物的量加入木聚糖酶，50℃酶解3h
3)用盐酸调节酶解液pH至3.5，按300U/g麒麟菜粉底物的量加入甘露聚糖酶，按250U/g麒麟菜粉底物的量加入果胶酶，进行酶解，50℃酶解3h。
4)酶解液升温至95℃保持15min进行灭酶。
5)灭酶结束后，酶解液使用双层滤纸进行抽滤，去除不溶性杂质
6)按酶解液体积的10％向酶解液中加入100mL乙醇，室温25℃静置15min，使大分子糖类物质沉降，然后用离心机8000rpm/min离心20min去除不溶性残渣。
7)离心后的酶解液使用玻璃芯漏斗抽滤去除菌体残留，其中玻璃芯漏斗孔径为0.65μm。
8)将上清旋蒸浓缩至500mL-600mL左右，测定浓缩液中固形物含量，至溶液中固形物含量为25％左右，
9)将8)所得浓缩液进行喷雾干燥，即得硫酸基多糖。其中喷雾干燥进风温度170-180℃，出风温度80-90℃，流速8-10mL/min，硫酸基多糖得率在85％左右。
方法1：按1％-2％的比例将硫酸基多糖添加进饲料内，混合均匀，按照需要的饲料形态进行加工制备，直接饲喂即可。
方法2：按1％-2％的比例将硫酸基多糖溶解进动物日常饮用水中进行使用。
实施例2
1)7.5kg麒麟菜粉中加入0.75kg稻壳，加入12.5L发酵用水(水中按300U/g 麒麟菜粉底物的量加入褐藻胶裂解酶)，30℃固态发酵48h，每隔12h进行翻拌。
其中，发酵菌为里氏木霉。
2)发酵结束后，向物料中加入80L水，按300U/g麒麟菜粉底物的量加入木聚糖酶，50℃酶解3h
3)用盐酸调节酶解液pH至3.5，按250U/g麒麟菜粉底物的量加入甘露聚糖酶，按250U/g麒麟菜粉底物的量加入果胶酶，进行酶解，50℃酶解3h。
4)酶解结束后，发酵罐夹层通入蒸汽，升温至90℃维持15min灭酶。
5)灭酶结束后，酶解液使用300目板框过滤，去除不溶性杂质
6)按酶解液体积的10％向酶解液中加入5L乙醇，室温静置15min，使大分子糖类物质沉降，然后用管式离心机离心去除不溶性残渣。
其中管式离心机转速为10000rpm/min
7)离心后的酶解液使用0.45μm滤膜过滤。
8)将上清旋蒸浓缩至溶液中固形物含量为23％。
9)将8)所得浓缩液进行喷雾干燥，即得硫酸基多糖。其中喷雾干燥进风温度 170-180℃，出风温度80-90℃，流速8-10mL/min，硫酸基多糖得率在85％左右。
实施例3：
本发明技术制备硫酸基多糖与对高脂饮食卵形鲳鲹的影响。
按照实施实例2制备本发明技术硫酸基多糖
30kg麒麟菜粉中加入3kg稻壳，加入50L发酵用水(水中按300U/g麒麟菜粉底物的量加入褐藻胶裂解酶)，将里氏木霉接种至物料中，30℃固态发酵48h，每隔12h进行翻拌。发酵结束后，向物料中加入300L水，按300U/g麒麟菜粉底物的量加入木聚糖酶，开启发酵罐搅拌桨，转速50r/min，50℃酶解3h。用盐酸调节酶解液pH至3.5，按250U/g麒麟菜粉底物的量加入甘露聚糖酶，按250U/g 麒麟菜粉底物的量加入果胶酶，进行酶解，50℃酶解3h。酶解液升温至95℃保持15min进行灭酶。灭酶结束后，酶解液使用300目板框过滤，去除不溶性杂质。按酶解液体积的10％向酶解液中加入20L乙醇，室温25℃静置15min，使大分子糖类物质沉降，然后用管式离心机10000rpm离心去除不溶性残渣。离心后的酶解液使用0.45μm孔径滤膜过滤除菌。将上清旋蒸浓缩至80-100L左右，测定浓缩液中固形物含量，至溶液中固形物含量为25％左右，随后进行喷雾干燥即得硫酸基多糖。其中喷雾干燥进风温度170-180℃，出风温度80-90℃，流速 8-10mL/min，硫酸基多糖得率在85％左右。硫酸基多糖成分分析如表1所示。
根据实验要求，以卵形鲳鲹基础日粮作为主要饲料成分，红鱼粉作为主要蛋白源。其中，阳性对照组使用饲料为：卵形鲳鲹基础日粮+红鱼粉，饲料中鱼粉含量为25％，饲料总蛋白含量为45％，饲料总脂肪含量为12％。阴性对照组使用饲料为：卵形鲳鲹基础日粮+红鱼粉，饲料中鱼粉含量为25％，饲料总蛋白含量为40％，饲料总脂肪含量为15％。试验组使用的饲料在阴性对照组的基础上，使用不同含量的硫酸基多糖替代卵形鲳鲹基础日粮。试验组饲料总蛋白含量均为 40％，饲料总脂肪含量均为15％，试验组1使用硫酸基多糖替代0.5％的卵形鲳鲹基础日粮；试验组2使用硫酸基多糖替代1％的卵形鲳鲹基础日粮；试验组3 使用硫酸基多糖替代2％的卵形鲳鲹基础日粮。实验饲料的原料及营养组成见表 2。
根据实验要求，以卵形鲳鲹基础日粮作为主要饲料成分，红鱼粉作为主要蛋白源。在阳性对照组中，设置饲料中总蛋白含量为45％(添加25％鱼粉)，总脂肪含量12％。阴性对照组中，设置饲料中总蛋白含量为40％(添加25％鱼粉)，总脂肪含量16％。试验组1、2、3在高脂低蛋白饲料的基础上添加不同水平的(0.5％、 1％、2％)的硫酸基多糖。
挑选大小均匀、体格健康、初重为16±0.5g的卵形鲳鲹450尾，随机分成5组，每组设3个重复，每个重复30尾卵形鲳鲹，以重复为单位饲养于网箱中，养殖试验持续8周。饲料按照体重的8％～10％进行投喂，分别于07:00、11:00、17:00、 21:00各投喂1次；投喂1h后观察摄食情况，根据天气、水质等情况适当调整投喂量。养殖试验结束后禁食24h，以重复为单位计数并称重。计算卵形鲳鲹相关生长指标:存活率(SR)、增重率(WG)、和饵料系数(FCR)、肥满度(CF)、肝体比 (LBW)、脏体比(VBW)公式如下:
存活率(survival rate，SR,％)＝100x终末尾数/初始尾数；
增重率(weight gain rate，WG，％)＝100x(终末均重-初始均重)/初始均重；
饵料系数(feed conversion rate，FCR)＝摄食饲料干重/(终末体重-初始体重)。
肥满度(condition factor，CF)＝终末体重/终末体长3
肝体比(liver andbody weight ratio，LBW)＝(肝质量/终末体质量)×100％
脏体比(viscera andbody weight ratio，VBW)＝(脏器质量/终末体质量)×100％
如表3，图1所示，与阳性对照组正常饲料饲喂相比，阴性对照组高脂低蛋白饲料导致试验鱼摄食量、饵料系数显著提高，但同时降低了试验鱼的增重率，且使得试验鱼末重明显下降。而在试验组2的试验鱼，在饲料中添加1％硫酸基多糖的情况下，其增重率、末重均显著高于阴性对照组，甚至略高于阳性对照组。阴性对照组高脂低蛋白饲料同时导致试验鱼肥满度下降，而试验组2、试验组3在添加1％、2％硫酸基多糖的情况下，提高了试验鱼的肥满度，且优于阳性对照组试验鱼，如图1所示。
此外，如图2、图3、图4所示，阴性对照组高脂低蛋白饲料导致试验鱼成活率明显下降，同时导致试验鱼的肝体比和脏体比明显增加。而试验组2在饲料中添加1％硫酸基多糖后，可以一定程度降低试验鱼的肝体比、脏体比，且可以有效提高试验鱼的成活率，试验组2试验鱼成活率与阳性对照组没有差异。
此外，对实验组卵形鲳鲹的肝脏形态进行观测，阳性对照组卵形鲳鲹肝脏为正常鲜艳的红色，而阴性对照组肝脏颜色由阳性对照组的红色转为白色。试验组1 在饲料中添加0.5％硫酸基多糖，该组试验鱼肝脏颜色逐渐恢复血色，呈现粉色，而试验组2、试验组3在添加1％、2％硫酸基多糖的情况下，可以使试验鱼的肝脏重新变为正常的红色。
上述结果表明，高脂低蛋白饲料饲喂对试验鱼造成损伤，造成试验鱼对试验饲料的利用率降低，并呈现肝脏偏大和肝脂肪含量升高现象，这种饲喂方式可能造成了试验鱼的肠道损伤，消化能力降低，进而引起肝脏损伤；而添加1％硫酸基多糖，可以显著提高试验鱼增重率，一定程度上降低饵料系数、肝体比、脏体比，保障试验鱼的成活率，这表明添加硫酸基多糖可以在一定程度上修复这种损伤，在使用高脂低蛋白饲料的情况下，起到保护卵形鲳鲹肠道和肝脏的作用。
表1硫酸基多糖产品成分分析(％)
表2基础饲料组成及营养水平(％)
表3.硫酸基多糖对高脂低蛋白饮食卵形鲳鲹生长的影响
Claims (2)
1.一种可用于高脂低蛋白饲料的硫酸基多糖饲料添加剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：麒麟菜粉菌酶协同发酵：将麒麟菜粉投入均质机，加入麒麟菜粉质量10％的稻壳，随后按照料液比1:1.5加水，发酵用水预先溶解褐藻胶裂解酶，其中褐藻胶裂解酶酶活25000-30000U/g，酶添加量为250-300U/g麒麟菜底物，混合搅拌均匀，将发酵菌接种到物料中，30℃发酵48h；
其中，所述发酵菌株为里氏木霉；
步骤2：木聚糖酶酶解：物料按照料液比约1:10加入水，使用木聚糖酶进行酶解，酶活力30000-40000U/g，酶添加量为300-400U/g麒麟菜底物，酶解温度45-60℃，作用时间3h；
步骤3：复合酶解：用盐酸调节步骤3酶解结束后酶解液pH至3.5，随即使用甘露聚糖酶和果胶酶进行酶解，其中甘露聚糖酶酶活力40000-50000U/g，酶添加量为300-350U/g麒麟菜底物，果胶酶酶活力25000-30000U/g，酶添加量为200-250U/g麒麟菜底物，酶解温度45-60℃，作用时间2h；
步骤4：灭酶：酶解液升温至95℃保持15min进行灭酶；
步骤5：板框过滤：灭酶结束后，酶解液进行板框过滤，去除不溶性残渣；
步骤6：醇沉：按酶解液体积的10％向步骤3制备的酶解液中加入乙醇，使大分子糖类物质沉降，随后离心去除酶解残渣；
步骤7：步骤6酶解液使用滤膜过滤除杂除菌，其中滤膜孔径规格为0.45-0.95μm；
步骤8：酶解液浓缩：离心除杂上清液悬蒸浓缩至固形物含量≥25％；
步骤9：喷雾干燥：进口温度170-190℃，出风温度90-110℃，流速8-12mL/min，得到硫酸基多糖干粉。
2.一种如权利1要求所述高脂低蛋白饲料的硫酸基多糖饲料添加剂的制备方法，其特征在于：此种可用于高脂低蛋白饲料的硫酸基多糖的应用方法包括如下：
方法1：按1％-2％的比例将硫酸基多糖添加进饲料内，混合均匀，按照需要的饲料形态进行加工制备，直接饲喂即可；
方法2：按1％-2％的比例将硫酸基多糖溶解进动物日常饮用水中进行使用。
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