CN114507264A

CN114507264A - 金丝的提取单体素a及其提取方法和应用

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Publication number: CN114507264A
Application number: CN202210009896.4A
Authority: CN
Inventors: 王炜; 蒋赛; 王梦云; 彭彩云; 李斌; 盛文兵; 袁汉文; 田星; 欧阳瑶力; 刘石峰
Original assignee: Hunan University of Chinese Medicine
Current assignee: Hunan University of Chinese Medicine
Priority date: 2022-01-06
Filing date: 2022-01-06
Publication date: 2022-05-17

Abstract

本发明涉及中药技术，公开了一种金丝***的提取单体***素A及其提取方法和应用。本发明提供的金丝***的提取单体***素A如式(I)所示，具体的提取方法包括以下步骤：将金丝黄菊花经干燥、粉碎后，与提取溶剂I混合进行提取得到提取液，将所述提取液浓缩后得到提取浸膏；将所述提取浸膏依次经石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取后进行浓缩得到石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏；将所述乙酸乙酯浸膏进行梯度洗脱分离I得到组分Fr.1‑Fr.M，将所述组分Fr.7进行梯度洗脱分离II得到组分Fr.7.1‑Fr.7.N，然后将所述组分Fr.7.4进行梯度洗脱分离III得到组分Fr.7.4.1‑Fr.7.4.Q，将所述组分Fr.7.4.8过半制备高效液相分离。***素A具有良好的抗氧化能力和保肝活性。

Description

金丝***的提取单体***素A及其提取方法和应用

技术领域

本发明涉及中药技术，具体涉及一种金丝***的提取单体***素A及其提取方法和应用。

背景技术

菊花为菊科植物菊花的干状头状花序，是我国的传统名花，其集观赏、食用和保健于一身，具有巨大的开发利用价值。《神农本草经》记载菊花“久服利血气，轻身耐老延年”，药典记载其性凉、味甘、苦，微寒，有散风清热、平肝明目、清热解毒的作用。

金丝***属于菊花的一种，发源于位于江西西北部奉新县，不仅具有很好的观赏价值，而且气味芬芳，属药、茶两用佳品，更因其个大形美、口感清香甘甜被誉为菊花中的上品。金丝***中黄酮素的含量极高，且富含多种氨基酸、维生素和微量元素，具有“香、甜、润”三大特点，还有散风热、清肝明目等功效，深受消费者的青睐。

肝脏是人体消化***中最大的消化腺，也是新陈代谢的重要器官，肝脏对来自体内和体外的许多非营养性物质如各种药物、毒物以及体内某些代谢产物，具有生物转化作用；通过新陈代谢将它们彻底分解或以原形排出体外。因此，肝脏在人的代谢、消化、解毒、凝血、免疫调节等方面均起着非常重要的作用。随着生活压力的增加和环境污染的加重，肝炎、肝硬化、肝脓肿、原发性肝癌等肝脏相关的疾病正侵蚀着人类的身体健康。经文献检索，迄今尚未见有金丝***提取物用于肝脏相关疾病或者在保肝、护肝方面的报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种金丝***的提取单体***素A及其提取方法和应用，该***素A具有良好的抗氧化能力和保肝活性。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种金丝***的提取单体***素A，所述***素A的结构式如式(I)所示：

本发明第二方面提供一种金丝***的提取单体***素A的提取方法，包括以下步骤：

(1)将金丝黄菊花经干燥、粉碎后，与提取溶剂I混合进行提取得到提取液，将所述提取液浓缩后得到提取浸膏；

(2)将所述提取浸膏依次经石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取后进行浓缩得到石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏；

(3)将所述乙酸乙酯浸膏进行梯度洗脱分离I得到组分Fr.1-Fr.M，将所述组分Fr.7进行梯度洗脱分离II得到组分Fr.7.1-Fr.7.N，然后将所述组分Fr.7.4进行梯度洗脱分离III得到组分Fr.7.4.1-Fr.7.4.Q，将所述组分Fr.7.4.8过半制备高效液相分离得到如式(I)所示的***素A；

其中，M≥11，N≥8，Q≥9，

优选地，步骤(1)中所述提取溶剂I为乙醇-水溶液。

优选地，所述提取溶剂I中乙醇与水的体积比为10-20：1。

优选地，所述提取的次数为2-3次，每次所述提取的过程中所述提取溶剂I与所述金丝黄菊花的质量比为3-8：1、时间为4-6天。

优选地，步骤(2)中所述石油醚、所述乙酸乙酯和所述正丁醇各自与所述提取浸膏的质量比为3-8：1。

优选地，步骤(3)中所述梯度洗脱分离I的过程包括：将所述乙酸乙酯浸膏装样硅胶柱，然后用洗脱剂I进行梯度洗脱，再经点板合并得到所述组分Fr.1-Fr.M。

优选地，所述洗脱剂I为二氯甲烷-甲醇溶液。

优选地，所述梯度洗脱中二氯甲烷与甲醇的体积比依次为100:1，50:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，0:1。

优选地，步骤(3)中所述梯度洗脱分离II的过程包括：将所述组分Fr.7过反相柱，用洗脱剂II进行梯度洗脱，再经点板合并得到所述组分Fr.7.1-Fr.7.N。

优选地，所述洗脱剂II为甲醇-水溶液。

优选地，所述梯度洗脱中甲醇-水的体积比依次为0:1，1:9，2:8，3:7，4:6，5:5，6:4，7:3，8:2，9:1，1:0。

优选地，步骤(3)中所述梯度洗脱分离III的过程包括：将所述组分Fr.7.4过硅胶柱，用洗脱剂III进行梯度洗脱得到所述组分Fr.7.4.1-Fr.7.4.Q。

优选地，所述洗脱剂III为石油醚-乙酸乙酯溶液。

优选地，所述梯度洗脱中石油醚与乙酸乙酯的体积比依次为5:1，4:1，3:1，2:1，1:1，0:1。

优选地，所述半制备高效液相分离的流速为2-4mL/min。

本发明第三方面提供上述的金丝***的提取单体***素A在制备抗氧化药物中的应用。

本发明第四方面提供上述的金丝***的提取单体***素A在制备保肝药物中的应用。

通过上述技术方案，本发明的有益效果为：

本发明采用多次硅胶柱梯度洗脱和半制备高效液相分离技术，从金丝***花中分离、纯化得到一种新的单体化合物——***素A，并利用现代波谱方法确定***素A的结构，鉴定为1'-O-苯甲基-4'-O-E-咖啡酰基-β-D-葡萄糖苷(1'-O-benzyl-4'-O-E-caffeoyl-β-D-glucopyranoside)；经ABTS⁺自由基清除活性筛选和保肝活性筛选，发现***素A具有良好的抗氧化能力和保肝能力，对人肝癌细胞HepG2的增殖具有促进作用。

有关本发明的其他优点以及优选实施方式的技术效果，将在下文的具体实施方式中进一步说明。

附图说明

图1是实施例1中组分JS-2-119-36的HR-ESI-MS谱图；

图2是实施例1中组分JS-2-119-36的IR谱图；

图3是实施例1中组分JS-2-119-36的¹H-NMR谱图；

图4是实施例1中组分JS-2-119-36的¹³C-NMR谱图；

图5是实施例1中组分JS-2-119-36的Dept谱图；

图6是实施例1中组分JS-2-119-36的HSQC谱图；

图7是实施例1中组分JS-2-119-36的HMBC谱图；

图8是实施例1中组分JS-2-119-36的¹H-¹H COSY谱图；

图9是实施例1中D-葡萄糖衍生物的HPLC谱图；

图10是实施例1中L-葡萄糖衍生物的HPLC谱图；

图11是实施例1中组分JS-2-119-36的酸水解衍生物的HPLC谱图。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明第一方面提供一种金丝***的提取单体***素A，所述***素A的结构式如式(I)所示：

本发明提供的金丝***的提取单体——***素A为浅黄色固体，薄层色谱(TLC)在254nm紫外下有荧光；高分辨电喷雾质谱(HR-ESI-MS)：m/z 455.1314[M+Na]⁺(计算值C₂₂H₂₄O₉Na⁺，455.1318)，确定其分子式为C₂₂H₂₄O₉，不饱和度为11；红外谱图(IR谱图)显示该化合物含有羟基(3361cm^-1)，烯烃(1676cm^-1)和芳香烃(699cm^-1)等基团。

***素A的核磁共振谱图特征为：

¹H-NMR(600MHz，CD₃OD):δ_H7.60(1H,d,J＝15.6Hz,H-7”),7.44(2H,dd,J＝7.8Hz,H-2,6),7.34(2H,t,J＝7.8Hz,H-3,5),7.28(1H,t,J＝7.8Hz,H-4),7.05(1H,d,J＝1.8Hz,H-2”),6.96(1H,dd,J＝8.4,1.8Hz,H-6”),6.78(1H,d,J＝8.4Hz,H-5”),6.30(1H,d,J＝15.6Hz,H-8”),4.96(1H,d,J＝12.0Hz,H-7a),4.86(1H,m,H-4'),4.70(1H,d,J＝12.0Hz,H-7b),4.43(1H,d,J＝7.8Hz,H-1'),3.64(1H,m,H-6'a),3.62(1H,m,H-3'),3.58(1H,m,H-6'b),3.51(1H,m,H-5'),3.37(1H,m,H-2')。

¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD):δ_C 168.6(C-9”),149.7(C-4”),147.6(C-7”),146.9(C-3”),139.0(C-1),129.3(C-3,5),129.2(C-2,6),128.7(C-4),127.7(C-1”),123.1(C-6”),116.5(C-5”),115.2(C-2”),114.7(C-8”),103.3(C-1'),76.2(C-5'),75.8(C-3'),75.3C-2'),72.6(C-4'),62.6(C-6')。

其中，M≥11，N≥8，Q≥9，

根据本发明，金丝黄菊花指的是菊科菊属菊花(Chrysanthemum morifoliumRamat.)——金丝***的花朵部分，其具体的干燥、粉碎可以采用本领域内常规的干燥和粉碎的方式，例如干燥可以采用烘干、晒干或者真空干燥等方式，粉碎可以采用粉碎机、研磨等方式。步骤(1)和步骤(2)中浓缩的方式均可以采用减压蒸馏的方式，也可以采用其他常规的浓缩方式。

根据本发明，提取溶剂I可以采用低级脂肪醇或者低级脂肪醇的水溶液，其中，低级脂肪醇可以是甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇等。为了提高***素A从金丝黄菊花中溶出与提取的效果，优选地，步骤(1)中所述提取溶剂I为乙醇-水溶液。进一步优选地，所述提取溶剂I中乙醇与水的体积比为10-20：1。

根据本发明，对金丝黄菊花进行提取的次数、提取溶剂的用量和时间没有特殊的限定，能够将包括***素A在内的物质进行有效提取即可。优选地，所述提取的次数为2-3次，每次所述提取的过程中所述提取溶剂I与所述金丝黄菊花(干重)的质量比为3-8：1、时间为4-6天。在进行多次提取时，将每次获得的提取液合并后，进行浓缩得到提取浸膏。

根据本发明，在提取溶剂I对金丝黄菊花进行提取后，通过固液分离的方式获得提取液，例如采用过滤、离心的方式。

根据本发明，步骤(2)中提取浸膏在利用石油醚进行萃取前，与适量水混合进行悬浮，以提高石油醚、乙酸乙酯和正丁醇的萃取效率。优选地，步骤(2)中所述石油醚、所述乙酸乙酯和所述正丁醇各自与所述提取浸膏的质量比为3-8：1。

根据本发明，优选地，步骤(3)中所述梯度洗脱分离I的过程包括：将所述乙酸乙酯浸膏装样硅胶柱，然后用洗脱剂I进行梯度洗脱，再经点板合并得到所述组分Fr.1-Fr.M。

根据本发明，优选地，所述洗脱剂I为二氯甲烷-甲醇溶液。

根据本发明，优选地，所述梯度洗脱中二氯甲烷与甲醇的体积比依次为100:1，50:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，0:1。

根据本发明，优选地，步骤(3)中所述梯度洗脱分离II的过程包括：将所述组分Fr.7过反相柱，用洗脱剂II进行梯度洗脱，再经点板合并得到所述组分Fr.7.1-Fr.7.N。

根据本发明，优选地，所述洗脱剂II为甲醇-水溶液。

根据本发明，优选地，所述梯度洗脱中甲醇-水的体积比依次为0:1，1:9，2:8，3:7，4:6，5:5，6:4，7:3，8:2，9:1，1:0。

根据本发明，优选地，步骤(3)中所述梯度洗脱分离III的过程包括：将所述组分Fr.7.4过硅胶柱，用洗脱剂III进行梯度洗脱得到所述组分Fr.7.4.1-Fr.7.4.Q。

根据本发明，优选地，所述洗脱剂III为石油醚-乙酸乙酯溶液。

根据本发明，优选地，所述梯度洗脱中石油醚与乙酸乙酯的体积比依次为5:1，4:1，3:1，2:1，1:1，0:1。

根据本发明，半制备高效液相分离可以采用本领域内常规的方法和仪器设备进行；优选地，所述半制备高效液相分离的流速为2-4mL/min。

根据本发明一种特别优选的实施方式，金丝***的提取单体***素A的提取方法，包括以下步骤：

(1)将金丝黄菊花经干燥、粉碎后，与乙醇-水溶液(乙醇与水的体积比为19：1)混合进行2-3次提取，每次提取的过程中提取溶剂I与金丝黄菊花的质量比为3-8：1、时间为4-6天，经固液分离后得到提取液，将提取液浓缩后得到提取浸膏；

(2)将步骤(1)得到的提取浸膏加入适量水悬浮后，依次经石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取后进行浓缩得到石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏，其中，石油醚、乙酸乙酯和正丁醇各自与提取浸膏的质量比为3-8：1；

(3)将步骤(2)得到的乙酸乙酯浸膏装样硅胶柱，然后以二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂I进行梯度洗脱(二氯甲烷与甲醇的体积比依次为100:1，50:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，0:1)，再经点板合并得到所述组分Fr.1-Fr.M；将组分Fr.7过反相柱，以甲醇-水溶液为洗脱剂II进行梯度洗脱(甲醇-水的体积比依次为0:1，1:9，2:8，3:7，4:6，5:5，6:4，7:3，8:2，9:1，1:0)，再经点板合并得到所述组分Fr.7.1-Fr.7.N；然后将组分Fr.7.4过硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯溶液为洗脱剂III进行梯度洗脱(石油醚与乙酸乙酯的体积比依次为5:1，4:1，3:1，2:1，1:1，0:1)得到组分Fr.7.4.1-Fr.7.4.Q，然后将所述组分Fr.7.4.8用半制备高效液相(流速为2-4mL/min)分离得到***素A。

基于上述提供的金丝***的提取单体***素A，本发明第三方面提供上述的***素A在制备抗氧化药物中的应用。

基于上述提供的金丝***的提取单体***素A，本发明第四方面提供上述的***素A在制备保肝药物中的应用。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，核磁共振分析采用Bruker AV-600核磁共振光谱仪，紫外光谱分析采用Hewlett-Packard 8452AUV-vis紫外光谱仪，红外光谱分析采用Bruker Tensor 27和MIRacleATR FT-IR红外分析仪，高效液相色谱分析采用美国Agilent 1260高效液相色谱仪，半制备高效液相分离采用美国Agilent 1260，Agilent ZORBAX XDB C₁₈色谱柱(9.4×250mm,5μm)；金丝***花采自湖南省永州市宁远县，经湖南中医药大学药学院王炜教授鉴定为菊科菊属菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)，D-葡萄糖和L-葡萄糖采购自默克公司，ABTS试剂盒采购自索莱宝(Solarbio)公司，人肝癌细胞HepG2采购自索莱宝(Solarbio)公司，在无特别说明的情况下，其他试剂和原料均为常规的市售品。

以下实施例中，在无特别说明的情况下，室温为25±5℃。

实施例1

(1)取9.9kg金丝***花，经干燥、粉碎后，用乙醇-水溶液(乙醇与水的体积比为19：1)浸提2次，每次浸提的过程中乙醇-水溶与金丝黄菊花干重的质量比为5：1、浸提时间为5天，两次浸提后分别进行过滤，合并滤液得到提取液，将提取液进行减压浓缩得到提取浸膏；

(2)将步骤(1)得到的提取浸膏加入适量水悬浮，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取后进行浓缩得到石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏，其中，石油醚、乙酸乙酯和正丁醇各自与提取浸膏的质量比为5：1；

(3)将步骤(2)得到的乙酸乙酯浸膏(475.87g)装样硅胶柱，然后以二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂I进行梯度洗脱(二氯甲烷与甲醇的体积比依次为100:1，50:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，0:1)，再经点板(采用青岛海洋化工厂生产的GF254薄层板，20×20cm)合并得到11个组分，分别为组分Fr.1-Fr.11；

将组分Fr.7(30.46g)过反相柱，以甲醇-水溶液为洗脱剂II进行梯度洗脱(甲醇-水的体积比依次为0:1，1:9，2:8，3:7，4:6，5:5，6:4，7:3，8:2，9:1，1:0)，再经点板合并得到8个组分，分别为组分Fr.7.1-Fr.7.8；

将组分Fr.7.4(3.65g)过硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯溶液为洗脱剂III进行梯度洗脱(石油醚与乙酸乙酯的体积比依次为5:1，4:1，3:1，2:1，1:1，0:1)得到组分Fr.7.4.1-Fr.7.4.9，然后将组分Fr.7.4.8用半制备高效液相(流速为3mL/min)分离得到组分JS-2-119-36(8.3mg，t_R＝15.1min；CH₃CN/H₂O，32:68)。

组分JS-2-119-36为浅黄色固体；薄层色谱(TLC)在254nm紫外下有荧光；将高分辨电喷雾质谱(HR-ESI-MS)分析结果见图1，HR-ESI-MS谱图显示m/z 455.1314[M+Na]⁺(计算值C₂₂H₂₄O₉Na⁺，455.1318)，确定其分子式为C₂₂H₂₄O₉，不饱和度为11；红外(IR)分析结果见图2，IR谱图显示该化合物含有羟基(3361cm^-1)，烯烃(1676cm^-1)和芳香烃(699cm^-1)等基团。

组分JS-2-119-36的核磁共振(NMR)分析结果见图3-图8，NMR谱图显示：

¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD):δ_C168.6(C-9”),149.7(C-4”),147.6(C-7”),146.9(C-3”),139.0(C-1),129.3(C-3,5),129.2(C-2,6),128.7(C-4),127.7(C-1”),123.1(C-6”),116.5(C-5”),115.2(C-2”),114.7(C-8”),103.3(C-1'),76.2(C-5'),75.8(C-3'),75.3C-2'),72.6(C-4'),62.6(C-6')。

在¹H-NMR谱图中，推测存在1个苄基基团[δ_H7.44(2H，d，J＝7.8Hz；H-2，6)，7.34(2H，t，J＝7.8Hz)，7.28(1H，t，J＝7.8Hz)，4.96(1H，d，J＝12.0Hz)，4.70(1H，d，J＝12.0Hz)]；1个咖啡酰基基团[δ_H7.05(1H，d，J＝1.8Hz)，6.96(1H，dd，J＝8.4，1.8Hz)，6.78(1H，d，J＝8.4Hz)，δ_H7.60(1H，d，J＝15.6Hz)and 6.30(1H，d，J＝15.6Hz)]；1个葡萄糖苷基团[δ_H4.86(1H，overlapped)，4.43(1H，d，J＝7.8Hz)，3.62(1H，m)，3.51(1H，m)，3.37(1H，m)and 3.64(1H，m)，3.58(1H，m)]。在¹³C NMR谱中显示有22个碳信号，推测存在1个酯基(δc168.6)，14个芳香碳(2个苯基和1个烯烃基团)，5个连氧次甲基碳(δ_C103.3，76.2，75.8，75.3和72.6)和2个连氧亚甲基碳(δ_C71.8和62.6)，具体数据见表1。

表1

将组分JS-2-119-36进行酸水解及高效液相色谱法分析：

a、取1.2mg组分JS-2-119-36，加入10mL浓度为2mol/L的盐酸溶液，在80℃水浴加热回流5h，然后将回流得到的溶液减压浓缩至干得到反应产物；

b、将反应产物加入适量的水溶解，用乙酸乙酯萃取后得到水层溶液，将水层溶液减压浓缩至干后加入无水吡啶1mL溶解，再加入2mg的L-半胱氨酸甲酯，然后置于60℃烘箱内反应1h后，再加入2mg异硫氰酸酯盐，继续置于60℃烘箱内反应1h，得到反应液。

c、将反应液取出放冷，过0.22μm微孔滤膜，进高效液相色谱(HPLC)进行分析，HPLC色谱条件为：C₁₈反相色谱柱，流动相：25％乙腈-0.05％乙酸水，检测波长入＝250nm，流速v＝0.8mL/min，进样量10μL；

取D-葡萄糖和L-葡萄糖作为标准品，分别按上述步骤a-步骤c的衍生化方法进行处理，并进行HPLC分析。

组分JS-2-119-36、D-葡萄糖和L-葡萄糖的衍生物HPLC谱图如图9-图11所示，D-葡萄糖衍生物的出峰时间为17.0min，L-葡萄糖衍生物的出峰时间为15.6min，组分JS-2-119-36的酸水解衍生物的出峰时间为17.2min，与D-葡萄糖衍生物出峰时间相似，故确定该化合物的糖苷为D-葡萄糖苷(t_R＝17.19min)。

根据以上HR-ESI-MS谱图、IR谱图、NMR谱图以及HPLC谱图的数据，推测组分JS-2-119-36的结构为1'-O-苯甲基-4'-O-E-咖啡酰基-β-D-葡萄糖苷(1'-O-benzyl-4'-O-E-caffeoyl-β-D-glucopyranoside)，结构式如式(I)所示，并命名为***素A，

组分JS-2-119-36的¹H-¹HCOSY，HMBC相关性如式(II)所示，

实施例2组分JS-2-119-36的ABTS⁺自由基清除活性筛选

采用ABTS⁺自由基清除法(ABTS试剂盒)评价金丝***花中分离得到的组分JS-2-119-36的抗氧化能力。

将组分JS-2-119-36配制成浓度分别为1.0、0.5、0.2、0.1、0.05mmol/L的溶液，阳性对照药维生素C(Vc)配制成浓度分别为1.0、0.8、0.6、0.4、0.2mmol/L的溶液，各取10μL分别独立地添加到96孔板中，再分别取190μL的ABTS⁺溶液添加到96孔板的各孔中，混匀后在室温下避光静置6min，然后检测96孔板的各孔在405nm处的吸光度(A)，计算自由基清除率和IC₅₀值，结果见表2，

自由基清除率＝[A_空白-(A_测定-A_对照)]/A_空白；

表2的数据显示，组分JS-2-119-36具有ABTS⁺自由基清除活性，其IC₅₀为11.34±1.56μM/L，强于阳性对照药Vc的IC₅₀(22.00±1.29μM/L)。

表2

实施例3

采用对乙酰氨基酚(APAP)诱导人肝癌细胞HepG2损伤模型，利用MTT法测定组分JS-2-119-36的保肝活性。

将人体肝癌细胞HepG2细胞添加到含10％胎牛血清的MEM培养基中，置于含有5体积％CO₂，温度为37℃的恒温培养箱中培养过夜；将培养得到的细胞经浓度为0.25重量％的胰蛋白酶溶液和浓度为0.02重量％的EDTA溶液进行消化，将消化得到的细胞以1×10⁵个/孔的密度接种在96孔板中，在温度为37℃，含有5体积％CO₂的恒温培养箱中培养过夜后，分为三组，每组10个孔，分别为模型组、阳性对照组(双环醇)和处理组(组分JS-2-119-36)，将阳性对照组每孔加入组分双环醇和APAP，使得双环醇的浓度为10μM、APAP的浓度为6mM，将处理组每孔加入组分JS-2-119-36和APAP，使得组分JS-2-119-36的浓度为10μM、APAP的浓度为6mM；再继续培养48h，取下培养基后，每孔加入100μL浓度为0.5mg/mL的MTT溶液，孵育4h，再加入100μL的DMSO溶解，最后用微孔板读卡器分别在490nm和630nm处测定福马赞溶液的光密度(OD)。

结果显示，与模型组(存活率为50.74％)相比，组分JS-2-119-36对APAP诱导的HepG2细胞损伤具有显著的保护作用，在10μM时细胞存活率为61.53％，阳性对照组的细胞存活率仅为58.41％。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种金丝***的提取单体***素A，其特征在于，所述***素A的结构式如式(I)所示：

2.一种金丝***的提取单体***素A的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

其中，M≥11，N≥8，Q≥9，

3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中所述提取溶剂I为乙醇-水溶液；

优选地，所述提取溶剂I中乙醇与水的体积比为10-20：1；

4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述石油醚、所述乙酸乙酯和所述正丁醇各自与所述提取浸膏的质量比为3-8：1。

5.根据权利要求2至4中任意一项所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中所述梯度洗脱分离I的过程包括：将所述乙酸乙酯浸膏装样硅胶柱，然后用洗脱剂I进行梯度洗脱，再经点板合并得到所述组分Fr.1-Fr.M；

优选地，所述洗脱剂I为二氯甲烷-甲醇溶液；

6.根据权利要求2至4中任意一项所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中所述梯度洗脱分离II的过程包括：将所述组分Fr.7过反相柱，用洗脱剂II进行梯度洗脱，再经点板合并得到所述组分Fr.7.1-Fr.7.N；

优选地，所述洗脱剂II为甲醇-水溶液；

7.根据权利要求2至4中任意一项所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中所述梯度洗脱分离III的过程包括：将所述组分Fr.7.4过硅胶柱，用洗脱剂III进行梯度洗脱得到所述组分Fr.7.4.1-Fr.7.4.Q；

优选地，所述洗脱剂III为石油醚-乙酸乙酯溶液；

8.根据权利要求2至4中任意一项所述的提取方法，其特征在于，所述半制备高效液相分离的流速为2-4mL/min。

9.权利要求1所述的金丝***的提取单体***素A在制备抗氧化药物中的应用。

10.权利要求1所述的金丝***的提取单体***素A在制备保肝药物中的应用。