CN111484411B

CN111484411B - 艾叶抗炎有效成分的提取方法和应用

Info

Publication number: CN111484411B
Application number: CN202010215397.1A
Authority: CN
Inventors: 张来宾; 吕洁丽; 常嘉靖; 王凤龙
Original assignee: Xinxiang Medical University
Current assignee: Xinxiang Medical University
Priority date: 2020-03-25
Filing date: 2020-03-25
Publication date: 2022-08-26
Anticipated expiration: 2040-03-25
Also published as: CN111484411A

Abstract

本发明公开了一种艾叶抗炎有效成分的提取方法和应用，该方法将艾叶粗粉用乙醇渗漉提取并浓缩，提取物用有机溶剂萃取，然后经大孔吸附树脂、硅胶、葡聚糖糖凝胶等柱层析分离得到艾叶抗炎有效成分化合物1和化合物2。本发明从艾叶中制备得到的两种新的有效成分对一氧化氮生成均有显著的抑制活性，在相同条件下均优于阳性对照槲皮素的活性。

Description

艾叶抗炎有效成分的提取方法和应用

技术领域

本发明属于艾叶有效成分分离及应用技术领域，具体涉及一种艾叶抗炎有效成分的提取方法和应用。

背景技术

炎症是机体的生理性自动防御反应，多因外部因素入侵机体或组织损伤而激活产生。在机体受到外界刺激时，机体释放大量的炎症分子(如一氧化氮，NO)参与机体炎症应答，造成炎症损伤，过度的炎症反应会导致多种疾病的发生。临床常用的抗炎药物有非甾体类抗炎药和甾体类抗炎药，然而这两类药物的副作用及不良反应较多，因此，寻找高效、低毒、低(无)成瘾性的抗炎药一直是医药科学领域期盼解决的问题。NO是机体内重要的信号分子，在机体循环、神经、免疫***及细胞凋亡等过程中都起着十分重要的作用。组织中的iNOS在炎症反应中被诱导产生，生成大量的NO，促进炎症反应发生，若样品能够降低炎性反应中的NO含量，即被认为具有抗炎作用。因此，抑制NO的生成是缓解炎症反应的重要手段。

艾叶(Artemisiae Argyi Folium)是菊科蒿属植物艾(Artemisia argyi Levl.etVant)的干燥叶，生长于全国大部分地区，以湖北蕲州产最为道地，故又称为蕲艾。艾叶作为大宗常用中药始载于梁·陶弘景的《名医别录》，具有散寒止痛之功效，临床可用于治疗支气管炎、肝炎和关节炎等炎性疾病。现代研究表明，艾叶油和水提液对二甲苯致小鼠耳肿胀具有一定的抑制作用，并且能够减少醋酸诱导小鼠醋酸扭体次数，缓解热板法引起的疼痛，说明艾叶油和水提液具有一定的抗炎镇痛作用。此外，艾叶油可以抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞细胞中促炎介质NO的生成。为了寻找天然抗炎活性化合物，我们对中药艾叶的抗炎有效成分进行了研究。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种艾叶抗炎有效成分的提取方法和应用，该方法将艾叶粗粉用乙醇渗漉提取并浓缩，提取物用有机溶剂萃取，然后经大孔吸附树脂、硅胶、葡聚糖糖凝胶等柱层析分离得到艾叶抗炎有效成分。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种艾叶抗炎有效成分的提取方法，其特征在于具体步骤为：

步骤S1：将阴干的艾叶粉碎后用体积分数90％-95％乙醇渗漉提取，合并提取液，减压浓缩得到艾叶乙醇提物，将该艾叶乙醇提物悬浮于蒸馏水中，用石油醚萃取，收集石油醚萃取液，并减压浓缩得到石油醚萃取物；

步骤S2：将步骤S1得到的石油醚萃取物经大孔吸附树脂柱层析，用体积分数80％乙醇洗脱，收集体积分数80％乙醇洗脱液减压浓缩得到80％乙醇洗脱产物，将80％乙醇洗脱产物经常压硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮溶剂***在体积比为120:1-1:1的范围内梯度洗脱，经TLC鉴定合并相同组分得到初始目标组分Fr.1～Fr.5，将初始目标组分Fr.5继续经常压硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯溶剂***在体积比为5:1-1.5:1范围内梯度洗脱，经TLC鉴定合并相同组分得到中间目标组分Fr.5-1-Fr.5-4，将中间目标组分Fr.5-2经ODS柱色谱分离、以甲醇-水溶剂***在体积比在40:60-50:50范围内梯度洗脱和葡聚糖凝胶柱色谱纯化、以甲醇洗脱得到有效成分化合物1，将中间目标组分Fr.5-2经ODS柱色谱分离、以甲醇-水溶剂***在体积比在50:50-60:40范围内梯度洗脱和葡聚糖凝胶柱色谱纯化、以甲醇洗脱得到有效成分化合物2；

该化合物1和化合物2的结构式分别为：

进一步优选，步骤S2中所述大孔吸附树脂为Diaion HP-20型大孔吸附树脂；所述葡聚糖凝胶为Sephadex LH-20型葡聚糖凝胶。

本发明所述的艾叶抗炎有效成分在制备抗炎药物中的应用。

本发明所述的艾叶抗炎有效成分在制备NO生成抑制剂类药物中的应用。

本发明通过一氧化氮生成抑制活性研究发现提取得到的艾叶中两种新的有效成分对一氧化氮生成均有显著的抑制作用，其IC₅₀分别为8.08±0.21μM和7.66±0.53μM，明显远强于阳性对照槲皮素的活性(IC₅₀为74.34±1.39μM)，且对一氧化氮生成的抑制率均呈剂量依赖性。

附图说明

图1为实施例1提取的化合物1对一氧化氮生成抑制率随药物浓度的变化图；

图2为实施例2提取的化合物2对一氧化氮生成抑制率随药物浓度的变化图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

本实施例为化合物1的制备方法。

阴干的艾叶12.5Kg，粉碎后用体积分数95％乙醇渗漉提取，合并提取液，减压浓缩得到艾叶乙醇提物2.64Kg，将该艾叶乙醇提物悬浮于2倍量的蒸馏水中，用6倍量石油醚萃取，收集石油醚萃取液，并减压浓缩得到石油醚萃取物696.1g。将石油醚萃取物经大孔吸附树脂柱层析，用体积分数80％乙醇洗脱，收集体积分数80％乙醇洗脱液减压浓缩得到体积分数80％乙醇洗脱产物；将体积分数80％乙醇洗脱产物经常压硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮(体积比为120:1-1:1)溶剂***梯度洗脱，经TLC鉴定合并相同组分得到5个组分(Fr.1～Fr.5)；将组分Fr.5继续经常压硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯(体积比为5:1-1.5:1)溶剂***梯度洗脱，经TLC鉴定合并相同组分得到4个组分(Fr.5-1-Fr.5-4)；将组分Fr.5-2经ODS柱色谱分离(以甲醇-水溶剂***体积比为40:60-50:50梯度洗脱)和葡聚糖凝胶柱色谱纯化(甲醇洗脱)得到有效成分化合物1(4mg)。

化合物1的波谱数据：HR-ESIMS m/z:403.2090[M+Na⁺]；¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ_H6.34(1H,s,H-13a),5.75(1H,s,H-13b),5.41(1H,td,J＝10.1,4.8Hz,H-8),5.34(1H,m,H-3),4.02(1H,t,J＝10.1Hz,H-6),3.78(3H,s,CH₃O-),3.61(1H,dd,J＝9.6,6.9Hz,H-1),2.52(1H,t,J＝10.1Hz,H-7),2.41(1H,m,H-2),2.31(1H,dd,J＝12.2,4.8Hz,H-9),2.07(2H,d,J＝6.5Hz,H-2'),2.00(1H,overlapped,H-3'),1.97(1H,overlapped,H-5),1.93(1H,overlapped,H-2),0.95(3H,s,H-14),1.19(1H,m,H-9),1.85(3H,br s,H-15),0.89(3H,d,J＝6.5Hz,H-4'),0.89(3H,d,J＝6.5Hz,H-5').¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ_C 172.4(C-1'),167.5(C-12),138.4(C-11),134.5(C-4),129.0(C-13),122.2(C-3),75.6(C-1),71.5(C-6),69.7(C-8),57.1(C-7),52.2(CH₃O-),52.0(C-5),43.7(C-2'),40.2(C-9),39.0(C-10),32.8(C-2),25.8(C-3'),11.4(C-14),22.5(C-5'),22.4(C-4'),24.2(C-15)。

实施例2

本实施例为化合物2的制备方法。

阴干的艾叶12.5Kg，粉碎后，用体积分数95％乙醇渗漉提取，合并提取液，减压浓缩得艾叶乙醇提物2.64Kg，将该艾叶乙醇提物悬浮于2倍量的蒸馏水中，用6倍量石油醚萃取，收集石油醚萃取液，并减压浓缩得到石油醚萃取物696.1g。将石油醚萃取物经大孔吸附树脂柱层析，用体积分数80％乙醇洗脱，收集体积分数80％乙醇洗脱液减压浓缩得到体积分数80％乙醇洗脱产物；将体积分数80％乙醇洗脱产物经常压硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮(体积比为120:1-1:1)溶剂***梯度洗脱，经TLC鉴定合并相同组分得到5个组分(Fr.1-Fr.5)；将组分Fr.5继续经常压硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯(体积比为5:1-1.5:1)溶剂***梯度洗脱，经TLC鉴定合并相同组分得到4个组分(Fr.5-1-Fr.5-4)；将组分Fr.5-2经ODS柱色谱分离(以甲醇-水溶剂***体积比为50:50-60:40梯度洗脱)和葡聚糖凝胶柱色谱纯化(甲醇洗脱)，得到有效成分化合物2(3mg)。

化合物2的波谱数据：HR-ESI-MS m/z:417.2250[M+Na⁺]；¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ_H 6.35(1H,s,H-13a),5.74(1H,s,H-13b),5.43(1H,td,J＝10.1,4.8Hz,H-8),5.34(1H,m,H-3),4.24(2H,m,CH₃CH ₂O-),4.02(1H,t,J＝10.1Hz,H-6),3.61(1H,dd,J＝9.6,6.9Hz,H-1),2.52(1H,t,J＝10.1Hz,H-7),2.41(1H,m,H-2),2.31(1H,dd,J＝12.2,4.8Hz,H-9),2.08(2H,d,J＝6.5Hz,H-2'),2.00(1H,overlapped,H-3'),1.97(1H,overlapped,H-5),1.93(1H,overlapped,H-2),1.31(3H,t,J＝7.1Hz,CH ₃CH₂O-),0.95(3H,s,H-14),1.19(1H,m,H-9),1.86(3H,br s,H-15),0.89(3H,d,J＝6.5Hz,H-4'),0.89(3H,d,J＝6.5Hz,H-5').¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ_C 172.3(C-1'),167.0(C-12),138.6(C-11),134.5(C-4),128.9(C-13),122.1(C-3),75.6(C-1),71.5(C-6),69.7(C-8),61.2(CH₃ CH₂O-),57.0(C-7),52.0(C-5),43.8(C-2'),40.2(C-9),39.0(C-10),32.8(C-2),25.8(C-3'),11.5(C-14),22.5(C-5'),22.4(C-4'),14.3(CH₃CH₂O-),24.2(C-15)。

实施例3

本实施例为实施例1和2提取的有效成分化合物1和化合物2对一氧化氮生成抑制活性测试。

仪器：细胞培养箱，高速低温台式离心机，酶标仪，分析天平，各种型号移液枪。

细胞：巨噬细胞RAW 264.7。

试剂：LPS，DMEM，FBS，PBS，Griess试剂等。

测试方法：调整细胞密度为1.5×10⁶cells/mL。将细胞接种于96孔板中，每孔加入细胞悬液100μL，继续培养24h。分别设置为空白对照组、模型对照组和加药组。空白对照组为正常培养的细胞；模型对照组只加入5μL含有LPS的完全培养基，使其终浓度为1μg/mL；加药组加入5μL含有LPS的完全培养基，使其终浓度为1μg/mL，再加入5μL含有不同浓度药物的培养基。每组均设定3个复孔，加药后，继续培养16h。分别吸取各组细胞上清50μL于96孔板中，再各加入Griess试剂A液和Griess试剂B液50μL，置于摇床上振摇10min，用酶标仪测定540nm波长的吸光度值，根据吸光度值和Griess试剂标准曲线计算细胞上清中NO的含量，并计算不同浓度药物对NO含量的抑制率，进一步计算各样品的IC₅₀值。并采用MTT法测定各化合物对巨噬细胞RAW 264.7的细胞毒性，在有效浓度下未发现细胞毒性。

化合物1和化合物2对一氧化氮生成抑制活性结果如下(表1)：

表1化合物1和化合物2对一氧化氮生成的抑制活性

从表1可以看出，实施例1和2提取的有效成分化合物1和化合物2对一氧化氮生成具有明显的抑制活性，均远优于阳性对照槲皮素的活性。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

Claims

1.艾叶抗炎有效成分的提取方法，其特征在于具体步骤为：

该化合物1和化合物2的结构式分别为：

2.根据权利要求1所述的艾叶抗炎有效成分的提取方法，其特征在于：步骤S2中所述大孔吸附树脂为Diaion HP-20型大孔吸附树脂；所述葡聚糖凝胶为Sephadex LH-20型葡聚糖凝胶。

3.根据权利要求1所述的方法提取得到的艾叶抗炎有效成分在制备抗炎药物中的应用。

4.根据权利要求1所述的方法提取得到的艾叶抗炎有效成分在制备NO生成抑制剂类药物中的应用。