CN114478717B - 一种重组新型冠状病毒蛋白疫苗、其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组新型冠状病毒蛋白，本发明重组新型冠状病毒蛋白包含了至少两种人工构建的非天然RBD片段，以此作为靶抗原的重组疫苗具备跨流行株的广谱保护能力，另外，与传统的制备多个单价疫苗，通过多价组合来实现广谱保护的策略相比，在一种抗原分子上实现了多价广谱保护效果，在疫苗制备的时间成本、经济成本以及疫苗产能方面具有明显的优势。

Description

一种重组新型冠状病毒蛋白疫苗、其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种重组新型冠状病毒蛋白疫苗、其制备方法和应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)，属巢病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、正冠状病毒亚科、Betacoronavirus属、Sarbecovirus亚属、类 SARS病毒种、单股正链RNA病毒，有包膜，基因组全长约为29.9kb，绝大部分编码非结构蛋白，参与病毒复制和翻译等功能，少部分序列编码结构蛋白，如：S蛋白(spike protein，)、M蛋白(membrane protein)、E蛋白(envelope protein) 和N蛋白(nucleo protein)。此外，还有若干附属蛋白：3a,3b,p6,7a,7b,8b,9b和 orf14，这些蛋白均参与病毒组装。S、M和E蛋白构成病毒囊膜，是病毒引起免疫反应的主要表面抗原。其中S蛋白是一种跨膜糖蛋白，分子量约为150kDa，在病毒表面形成突出的同源三聚体。S由两个功能亚基组成，在S1和S2亚基之间的边界处(S1/S2裂解点)被切割，这两个亚基在融合前构象中保持非共价结合。S2亚基也由多个结构域构成，它的功能主要是介导病毒与宿主细胞的融合。远端S1亚基在结构上分为四个不同的结构域：N端结构域(NTD)、受体结合结构域(RBD)、C端结构域1(CTD1)和C端结构域2(CTD2)，其中 RBD主要负责与宿主细胞表面的受体血管紧张素转换酶2(angiotensinconverting enzyme 2,ACE2)结合，从而介导病毒侵染宿主细胞，因此S蛋白及 RBD均为目前基因工程疫苗研发的主要靶标。
截至目前，全球获批上市的疫苗共有8款，分别是美国批准紧急使用授权 (EUA)的BNT162b2和mRNA-1273、英国批准紧急使用授权(EUA)的 AZD1222、中国国药中生(北京公司和武汉公司)和北京科兴的3款新冠灭活疫苗、康希诺生物腺病毒载体疫苗、智飞生物重组蛋白疫苗，以及俄罗斯批准上市的“卫星V”。此外还有多种路线的几百个疫苗处于临床研究不同阶段。无论是采用哪种技术路线，上述已上市疫苗都对疫情防控做出了不同程度的贡献。新冠病毒属于RNA病毒，较易发生突变，全球已经发现了超七百万个新冠病毒突变株，主要突变株包括：Alpha(B.1.1.7)突变株、Beta(B.1.351)突变株、Gamma (P1)突变株、Epsilon(B.1.429)突变株、Delta(B.1.617.2)突变株、Kappa (B.1.617.1)突变株和Omicron(B.1.1.529)突变株，变异毒株的出现使现有疫苗的保护效果受到不同程度的影响。
根据SARS-CoV-2变异株的传播性、致病性或免疫逃逸能力的不同，世界卫生组织将上述5种变异株归类为需要关注的变异株(variants of concern, VOCs)。在这5种VOCs中，大量的研究已经证实，Beta变异株具有强的免疫逃逸能力，Delta变异株具有强的传播能力。初步的证据显示，Omicron变异株既具有强的传播能力，同时也具有强的免疫逃逸能力，其免疫逃逸能力甚至远高于Beta毒株。
Omicron突变株2021年11 月26日，世界卫生组织将其定义为第五种“关切变异株”，取名希腊字母Omicron (奥密克戎)变异株。该突变株共含有36个氨基酸突变位点，其中包括在优势流行毒株Alpha(B.1.1.7)突变株、Beta(B.1.351)突变株、Gamma(P1)突变株、Delta(B.1.617.2)突变株和Kappa(B.1.617.1)突变株中高频出现的K417N/T、 E484K/Q/A、N501Y、D614G、P681H/R突变位点。Omicron毒株已逐渐成为全球大部分地区的优势流行毒株。大量数据显示，奥密克戎突变株会提高病毒与ACE2受体的亲和力、减弱中和抗体效应，从而增强病毒毒力和传染力，加速病毒逃逸，降低疫苗保护效果。
这些具有较强免疫逃逸能力毒株的出现，引起了人们对于现有新冠疫苗有效性的巨大担忧。开发具有交叉保护能力的新一代疫苗是应对这些变异株的有效手段。将多种变异株整合到同一个免疫原中，构建马赛克型的抗原分子，是实现单组分交叉保护疫苗的可行策略。类似策略在广谱流感疫苗设计中得到了应用。但由于不同突变株又同时存在着数量繁多的突变位点，因而，寻找一种针对多种新冠病毒流行株的具有优异免疫原性的广谱性疫苗已成为当务之急。
发明内容
本发明的一个方面，是针对现有技术中缺少广谱的新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)疫苗，尤其是缺少同时针对5种VOCs变异株特别是Omicron 毒株具有良好中和活性的疫苗，提供了一种能够对多种新型冠状病毒流行株尤其是包括Omicron、Beta、Delta、Alpha、Gamma等多种变异毒株，同时产生良好交叉中和活性的单组分广谱重组蛋白疫苗。
本发明提供的技术方案为：
一种重组新型冠状病毒蛋白，所述重组新型冠状病毒蛋白为三聚体，包括三个由新型冠状病毒S蛋白RBD区域第319～537位氨基酸片段构成的亚基，
所述重组新型冠状病毒蛋白包括：
含有K417N、L452R、T478K、E484Q、F490S和N501Y突变位点的一个亚基；和/或
含有K417T、L452Q、S477N和E484K突变位点的另一个亚基。
本发明中所构建的重组新型冠状病毒蛋白的亚基包含了至少两种人工构建的非天然RBD片段，以此作为靶抗原的重组疫苗具备跨流行株的广谱保护能力。
新冠病毒spike(S)蛋白的受体结合结构域(receptor-binding domain,RBD) 直接参与宿主细胞受体的结合，在病毒入侵宿主细胞过程中发挥着关键作用。同时，大量的研究表明RBD含有主要的中和表位，因此，RBD是新冠疫苗研发的主要靶抗原之一。但是，RBD单体由于分子尺寸较小，其免疫原性不高。天然S蛋白为三聚体结构，RBD也以三聚化形式存在。构建三聚化的RBD，最大程度模拟其天然结构形式，同时，通过三聚化增大抗原的分子尺寸，实现抗原的重复性规则排列，增强B细胞受体交联，可以显著提高RBD的免疫原性。实现抗原的三聚化，常用的做法是引入外源的连接臂或三聚化基序，但是，外源序列的引入可能会带来非预期的免疫反应，具有一定的安全风险。我们通过对 RBD结构的计算分析，在不引入三聚化基序的情况下实现了RBD的三聚化。 RBD具有如下结构特征：(1)RBD的N-端和C-端具有较长的柔性loop结构，在三聚化过程中，其自身的loop结构可以作为不同RBD之间的连接臂，避免了外源连接臂的引入，同时降低了三聚化的空间位障；(2)在S蛋白天然结构中，RBD相对独立，与其它结构域之间不存在强的相互作用，RBD的折叠不需要其他结构域的协助；(3)RBD具有较为紧密的空间结构，其核心结构由多个beta 片层构成，结构域中含有4个二硫键，进一步增强了结构域的稳定性，同时， RBD的N-端和C-端距离较近，三聚化过程不存在大的空间位障，不会破坏RBD 的核心结构。基于RBD的上述结构特征，我们设计了RBD的截取方案，即截取319～537位氨基酸片段，该截取方案尽可能的保留了RBD两端的loop结构，同时，确保N-端和C-端接口距离较近。进而，将三个截取的RBD区片段首尾串联，形成一个新的RBD三聚化融合蛋白。
为了实现对新冠病毒不同变异株的交叉保护，构建了马赛克型的RBD三聚化抗原，本发明人通过对突变位点分析，对关键突变位点进行筛选整合，在出现频率最高的20种突变位点中，选取了具有较强免疫逃逸能力的残基突变，同时，考虑了这些突变在空间结构上的分布，避免在空间结构上的相互影响，人工设计了2个非天然RBD，其中一个人工RBD含有K417N、L452R、T478K、 E484Q、F490S和N501Y共6个残基突变(即第一亚基，可以记作RBD-1)，另一个人工构建的RBD含有K417T、L452Q、S477N和E484K共4个残基突变 (即第二亚基，可以记作RBD-2)，另外可以选择目前VOC中免疫逃逸能力最强的Omicron株RBD作为第三个亚基(即第三亚基，可以记作Omicron亚基)， Omicron变异株含有G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、 S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y和Y505H共15个突变的RBD区域。这些突变在众多不同的病毒谱系中均频繁出现，表明这些突变在病毒进化中具有明显的选择优势，也预示着这些突变可能会在将来的突变株中再次独立或组合出现。
本发明基于新冠病毒S蛋白RBD区结构学特征，利用计算生物学方法设计了一种全新的融合蛋白，该蛋白包含有三个RBD结构域，在可以不引入任何外源连接臂或其它无关成分情况下，形成抗原构象稳定的三聚体形式，实现RBD 蛋白三聚化。利用基因工程技术重组表达并纯化RBD三聚体蛋白后，与佐剂混合制备成疫苗。按一定剂量和剂次免疫后，可产生针对多种新型冠状病毒流行株的保护性中和抗体，用于治疗和/或预防SARS-CoV-2感染和/或新型冠状病毒疾病(COVID-19)。由于RBD区功能明确，结构清楚，负责识别宿主细胞的ACE2受体，同时针对RBD产生的抗体功能明确，靶点特异，最大程度避免诱导机体产生抗体依赖的增强作用(Antibody Dependent Enhancement，ADE)。
在本发明中，所述重组新型冠状病毒蛋白的三个亚基中，除上述两个人工构建的非天然RBD片段以外还可以包含其他新型冠状病毒变异株的RBD片段。作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述重组新型冠状病毒蛋白还包括由新型冠状病毒Omicron突变株S蛋白RBD区域第319～537位氨基酸片段构成的亚基。
更优选地，在本发明的某些实施方式中，上述亚基中含有选自G339D、 S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、 Q493R、G496S、Q498R、N501Y或Y505H突变位点中的五个或五个以上的突变位点。上述突变位点的部分组合例如表1所示。
表1
Figure RE-GDA0003576949280000051
作为优选，在本发明的某些实施方式中，上述重组新型冠状病毒蛋白的三个亚基的一级结构为三个所述亚基按照N末端至C末端的顺序首位串联。
在本发明中，上述第一个亚基(第一亚基/RBD-1)、第二个亚基(第二亚基 /RBD-2)、第三个亚基(第三亚基)可以以任意合适的顺序排列。例如，如表2 所示。
表2
序号 排列顺序 序列
1 第一亚基+第二亚基+第三亚基 SEQ ID No.1
2 第一亚基+第三亚基+第二亚基 SEQ ID No.2
3 第二亚基+第一亚基+第三亚基 SEQ ID No.3
4 第二亚基+第三亚基+第一亚基 SEQ ID No.4
5 第三亚基+第一亚基+第二亚基 SEQ ID No.5
6 第三亚基+第二亚基+第一亚基 SEQ ID No.6
7 第一亚基+第一亚基+第三亚基 SEQ ID No.7
8 第二亚基+第二亚基+第三亚基 SEQ ID No.8
9 第一亚基+第一亚基+第一亚基 SEQ ID No.9
10 第二亚基+第二亚基+第二亚基 SEQ ID No.10
11 第三亚基+第三亚基+第三亚基 SEQ ID No.11
作为优选，在本发明的某些实施方式中，上述重组新型冠状病毒蛋白的三个亚基按照第一亚基、第二亚基、第三亚基的顺序串联。
作为优选，在本发明的实施方式中，上述重组新型冠状病毒蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1-11所示或与其除所述突变位点外的氨基酸序列具有95％以上同源性的序列。更优选地，上述重组新型冠状病毒蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或与其除所述突变位点外的氨基酸序列具有95％以上同源性的序列。
在上述实施方式中，SEQ ID No.1-11中除所述突变位点外的氨基酸序列可以经替换、缺失、***1个或多个氨基酸以获得新的氨基酸序列，由该氨基酸序列组成的新的蛋白质具有与SEQ ID No.1-11中的氨基酸序列组成的蛋白质相同或基本相同的免疫学活性，该新的氨基酸序列也视为包含在本发明的保护范围之内。
进而，上述与其具有95％以上同源性的序列是指与所述重组新型冠状病毒蛋白或所述融合蛋白的氨基酸序列除所述突变位点外具有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。本领域技术人员可以对本说明书中所述融合蛋白的氨基酸序列以合适的方式进行随机或者工程化的点突变，其目的可以为，例如，获得更好的亲和力和/或解离性质，表达性能的提高，等，这些序列可以与所述重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白或所述融合蛋白具有相同或基本相同的免疫学活性，而这些突变后的氨基酸序列均包含在本发明的保护范围之内。
上述重组新型冠状病毒蛋白的三聚体形式中也可以引入某些外源三聚化基序，例如，T4 bacteriophage fibritin，也视为包含在本发明的保护范围之内。但其安全性要弱于本发明中的重组新型冠状病毒蛋白，同时也可能导致非预期免疫反应的发生。
本发明的另一个方面，是提供了一种融合蛋白，上述融合蛋白包含上述重组新型冠状病毒蛋白。
作为优选，在本发明的某些实施方式中，所述融合蛋白还包含选自信号肽、标签或免疫增强肽中的一种或几种。上述信号肽的作用可以是更有利于蛋白质的表达；上述标签可以为，例如，Flag标签、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)，等等，其作用可以是用于检测、纯化、分离等等。上述功能性序列可任意组合使用。
本发明的另一个方面，是提供了一种核酸分子，上述核酸分子包含编码上述重组新型冠状病毒蛋白，或编码上述融合蛋白的核苷酸序列。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，发明人对所述三聚体蛋白的密码子进行了优化，得到的所述核苷酸序列如SEQ ID No.12-22所示或与其具有95％以上同源性的序列。
上述与其具有95％以上同源性的序列是指与所述核苷酸序列具有95％、 96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。
对于上述核酸分子的制备方法，可基于上述核苷酸序列，通过化学合成或 PCR扩增等已知技术制备。通常，可以对编码上述结构域的氨基酸的密码子进行优化，以优化其在宿主细胞中的表达。上述碱基序列的信息可通过检索已知文献或NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等数据库来获得。
本发明的另一个方面，是提供了一种载体，上述载体包含上述核酸分子。
在本发明中，上述载体可以为直链载体，也可以为环状载体。可以为质粒等非病毒载体，也可以为病毒载体(例如腺病毒载体、麻疹病毒载体、腮腺炎病毒载体、风疹病毒载体、varicella病毒载体、脊髓灰质炎病毒载体、黄热病病毒载体)，还可以为利用转座子的载体。所述载体中可含有启动子、终止子等调控序列，以及耐药基因、报告基因等标记序列。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述载体为本发明中所述核酸分子的表达载体，用以表达本发明重组新型冠状病毒蛋白。
本发明的另一个方面，是提供了一种宿主细胞，上述宿主细胞包含上述核酸分子或上述载体。
作为优选，在本发明的实施方式中，上述宿主细胞为大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；
更优选地，在本发明的一个实施方式中，上述宿主细胞为CHO细胞。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述重组新型冠状病毒蛋白或上述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
步骤A)制备所述核酸分子，构建所述表达载体，将表达载体转化或转染至所述宿主细胞内；
步骤B)利用步骤A)的产物进行蛋白质表达；
步骤C)纯化步骤B)中获得的表达产物，得到上述重组新型冠状病毒蛋白或融合蛋白。
其中，步骤A)所述核酸分子包含编码上述重组新型冠状病毒蛋白，或编码上述融合蛋白的核苷酸序列。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述核苷酸序列如SEQ ID No.14-26 所示或与其具有95％以上同源性的序列。
可使用任意合适的分子生物学方法根据本说明书中所述核苷酸序列制备所述核酸分子。
其中，步骤A)所述构建表达载体可以使用任意合适的方法将上述核苷酸序列构建在宿主细胞相应的表达载体中。
然后将表达载体转化或转染至所述宿主细胞内。作为优选，在本发明的一个实施方式中，发明人在构建CHO细胞表达载体后将其转染至HEK293FT细胞或CHO细胞内构建重组细胞株。
其中，步骤B)所述蛋白质表达可以根据所使用的不同表达***对重组蛋白进行表达。进一步地，在本发明的一个实施方式中，发明人通过有限稀释法筛选得到能够稳定分泌表达重组新型冠状病毒蛋白或融合蛋白的细胞株。
其中，步骤C)所述纯化可以为任意合适的方法。例如，盐析法、沉淀法、透析或超滤、分子筛层析法、离子交换层析法、疏水层析法、亲和层析法，等等。作为优选，在本发明的一个实施方式中，采用离子交换和疏水层析的方法纯化上述重组新型冠状病毒蛋白或融合蛋白。
当然，根据现有技术，在进行纯化步骤之前，还应包含对目标蛋白质的收集过程，例如。对富含目标蛋白质的细胞培养液上清的收集；对已表达目标蛋白质后的所述宿主细胞进行破碎的过程，可以使用例如，超声波破碎、反复冻融破碎、化学处理法等任意合适的破碎方法。上述对宿主细胞的收集过程也应理解为包含在所述纯化的范围之内。
本发明的另一个方面，是提供了上述重组新型冠状病毒蛋白、上述融合蛋白、上述核酸分子、上述载体或所述宿主细胞在制备用于治疗和/或预防新型冠状病毒感染和/或新型冠状病毒引起的疾病的药物中的用途。
所述新型冠状病毒引起的疾病优选为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。
本发明的另一个方面，是提供了一种疫苗，上述疫苗包含上述重组新型冠状病毒蛋白或上述融合蛋白，以及佐剂。
在本发明的实施方式中，上述疫苗为重组蛋白疫苗(或称基因工程亚单位疫苗)。进一步地，在本发明的另外一些实施方式中，上述疫苗还可以为基因工程载体疫苗，或者可以为核酸疫苗，上述疫苗包含本说明书中所述核苷酸序列或编码本说明书中所述的氨基酸序列。
在本发明所述疫苗中，可以包含任意合适的佐剂。但作为优选，在本发明的实施方式中，上述佐剂为氢氧化铝、磷酸铝、MF59或CpG。更优选地，上述佐剂为氢氧化铝。
本发明的另一个方面，是提供了上述疫苗的制备方法，将纯化所得的上述重组新型冠状病毒蛋白或上述融合蛋白与所述佐剂混合。
本发明的另一个方面，是提供了上述疫苗在治疗和/或预防新型冠状病毒感染和/或新型冠状病毒引起的疾病中的用途。
本发明的另一个方面，是提供了上述重组新型冠状病毒蛋白、上述融合蛋白、上述核酸分子、上述载体或所述宿主细胞在制备对已接种过新型冠状病毒疫苗的人群进行加强免疫的药物中的用途；所述新型冠状病毒疫苗优选为新型冠状病毒疫苗灭活疫苗。
所述新型冠状病毒引起的疾病优选为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。
本发明的另一个方面，是提供了一种药物组合物，上述药物组合物包含所述疫苗，以及药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可以为任意药学上允许的添加剂，例如，生理盐水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、氨基酸以及它们的组合物、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、等渗剂等。
本发明所述药物组合物也可以和其他治疗和/或预防新型冠状病毒感染和/ 或新型冠状病毒引起的疾病的药物在有效安全的剂量下联合使用。
本发明的另一个方面，是提供了一种引发受试者针对新型冠状病毒的免疫应答或治疗受试者的新型冠状病毒感染的方法，向所述受试者施用有效剂量的所述疫苗或所述药物组合物。
上述受试者可以为人类或者其他动物。
上述施用可以为肌肉注射、腹腔注射或皮下注射。
本发明的有益效果为：
本发明重组新型冠状病毒蛋白包含了至少两种人工构建的非天然RBD片段，以此作为靶抗原的重组疫苗具备跨流行株的广谱保护能力，另外，与传统的制备多个单价疫苗，通过多价组合来实现广谱保护的策略相比，在一种抗原分子上实现了多价广谱保护效果，在疫苗制备的时间成本、经济成本以及疫苗产能方面具有明显的优势。
附图说明
图1为本发明实施例1中C05G13蛋白的结构模拟图；
图2为本发明实施例2中SDS-PAGE检测结果图，其中，1道为C05G13 蛋白，M为蛋白质marker(分子量标准为：kDa：250、130、100、70、55、35、 25、15、10)；
图3为本发明实施例2中纯化所得蛋白的Western-blot鉴定结果图，其中， 2道为C05G13蛋白，M为蛋白质marker(分子量标准为：kDa：250、130、 100、70、55、35、25、15、10)；
图4为本发明实施例3中重组表达蛋白与MM43中和性单克隆抗体结合曲线图；
图5为本发明实施例3中重组表达蛋白与MM57中和性单克隆抗体结合曲线图；
图6为本发明实施例3中重组表达蛋白与MM117中和性单克隆抗体结合曲线图；
图7为本发明实施例3中重组表达蛋白与R001中和性单克隆抗体结合曲线图；
图8为本发明实施例3中重组表达蛋白与R117中和性单克隆抗体结合曲线图；
图9为本发明实施例3中重组表达蛋白与R118中和性单克隆抗体结合曲线图；
图10为本发明实施例5中利用野病毒微量中和试验检测小鼠免疫血清的中和抗体滴度结果图；
图11为本发明实施例6中利用野病毒微量中和试验检测大鼠免疫血清的中和抗体滴度结果图。
序列说明
SEQ ID No.1-11分别为本发明实施例中重组新型冠状病毒蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID No.12为编码SEQ ID No.1所示氨基酸序列的核苷酸序列，即编码 C05G13蛋白的核苷酸序列；
SEQ ID No.13-22分别为编码SEQ ID No.2-11所示氨基酸序列的核苷酸序列；
SEQ ID No.23为本发明实施例3中C05蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID No.24为本发明实施例3中C05C蛋白的氨基酸序列。
具体实施方式
本发明公开了一种重组新型冠状病毒蛋白疫苗、其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“RBD”即代表新型冠状病毒的刺突蛋白的RBD结构域，其与“RBD”或“新型冠状病毒RBD 区域”可以理解为能够相互替换使用。
下面就本发明中出现的部分术语作以解释。
术语“新型冠状病毒”，即SARS-CoV-2，属巢病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、正冠状病毒亚科、Betacoronavirus属、Sarbecovirus亚属、类SARS病毒种、单股正链RNA病毒，有包膜，基因组全长约为29.9kb，绝大部分编码非结构蛋白，参与病毒复制和翻译等功能，少部分序列编码结构蛋白，如：S蛋白(spike protein)、M蛋白(membrane protein)、E蛋白(envelope protein) 和N蛋白(nucleo protein)，此外还有若干附属蛋白：3a,3b,p6,7a,7b,8b,9b和orf14，这些蛋白均参与病毒组装。S、M和E蛋白构成病毒囊膜，是病毒引起免疫反应的主要表面抗原。其中S蛋白是一种跨膜糖蛋白，分子量约为150kDa，在病毒表面形成突出的同源三聚体。S由两个功能亚基组成，在S1和S2亚基之间的边界处(S1/S2裂解点)被切割，这两个亚基在融合前构象中保持非共价结合。 S2亚基也由多个结构域构成，它的功能主要是介导病毒与宿主细胞的融合。远端S1亚基在结构上分为四个不同的结构域：N端结构域(NTD)、受体结合结构域(RBD)、C端结构域1(CTD1)和C端结构域2(CTD2)，其中RBD主要负责与宿主细胞表面的受体血管紧张素转换酶2(angiotensinconverting enzyme 2,ACE2)结合，从而介导病毒侵染宿主细胞，因此S蛋白及RBD均为目前基因工程疫苗研发的主要靶标。
术语“三聚体形式”，是蛋白质高级结构中的一种类型。其中含有三个蛋白质亚基即为三聚体形式。
术语“至少有一个”可以理解为在三个氨基酸序列中的两个相同或者三个氨基酸序列各不相同。
术语“一级结构”，是肽或蛋白质中氨基酸的线性序列。按照惯例，蛋白质的一级结构是指从氨基末端(N)端到羧基末端(C)端。
术语“融合蛋白”，fusion protein，是指通过DNA重组技术得到的一个、两个或多个基因重组后的表达产物。融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法，利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。
术语“载体”，是可将多核苷酸***其中的一种核酸运载工具。当载体能使***的多核苷酸编码的蛋白质获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1 来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
术语“宿主细胞”，是已经通过分子生物学技术将核酸分子引入的细胞。这些技术包括转染病毒载体，用质粒载体转化，以及通过电穿孔、脂转染、和粒子枪加速引入裸DNA。
术语“治疗”，是指减少疾病病理的可能性，减少疾病症状的发生，例如在一定程度上受试者具有更长的存活期或减少的不适。治疗可以是指当向受试者给予疗法时该疗法减少疾病症状、体征或病因的能力。治疗还指缓和或减少至少一种临床症状和/或抑制或延迟病症的进展和/或预防或延迟疾病或疾患的发作。
术语“受试者”是指接受预防、治疗、诊断的任何人或其他动物，特别是其他哺乳动物。其他哺乳动物可以包括，例如，狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔子、大鼠、豚鼠、小鼠等。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：基于蛋白质结构和计算生物学设计的新型冠状病毒RBD三聚体蛋白
新冠病毒在持续变异，大量的研究已经证实，很多变异株具有较强的免疫逃逸能力。尤其是Omicron变异株，初步的研究证据显示，该变异株既具有非常强的传播能力，同时也具有很强的免疫逃逸能力。具有较强免疫逃逸能力毒株的出现，尤其是 Omicron变异株，引起了人们对于现有新冠疫苗有效性的巨大担忧。开发具有交叉保护能力的新一代疫苗是应对这些变异株的有效手段。将多种变异株整合到同一个免疫原中，构建马赛克型的抗原分子，是实现单组分交叉保护疫苗的可行策略。
新冠病毒spike(S)蛋白的受体结合结构域(receptor-binding domain,RBD) 直接参与宿主细胞受体的结合，在病毒入侵宿主细胞过程中发挥着关键作用。同时，大量的研究表明RBD含有主要的中和表位，因此，RBD是新冠疫苗研发的主要靶抗原之一。但是，RBD单体由于分子尺寸较小，其免疫原性不高。天然S蛋白为三聚体结构，RBD也以三聚化形式存在。构建三聚化的RBD，最大程度模拟其天然结构形式，同时，通过三聚化增大抗原的分子尺寸，实现抗原的重复性规则排列，增强B细胞受体交联，可以显著提高RBD的免疫原性。实现抗原的三聚化，常用的做法是引入外源的连接臂或三聚化基序，但是，外源序列的引入可能会带来非预期的免疫反应，具有一定的安全风险。我们通过对RBD结构的计算分析，在不引入三聚化基序的情况下实现了RBD的三聚化。 RBD具有如下结构特征：(1)RBD的N-端和C-端具有较长的柔性loop结构，在三聚化过程中，其自身的loop结构可以作为不同RBD之间的连接臂，避免了外源连接臂的引入，同时降低了三聚化的空间位障；(2)在S蛋白天然结构中，RBD相对独立，与其它结构域之间不存在强的相互作用，RBD的折叠不需要其他结构域的协助；(3)RBD具有较为紧密的空间结构，其核心结构由多个beta 片层构成，结构域中含有4个二硫键，进一步增强了结构域的稳定性，同时， RBD的N-端和C-端距离较近，三聚化过程不存在大的空间位障，不会破坏RBD 的核心结构。基于RBD的上述结构特征，我们设计了RBD的截取方案，即截取319～537位氨基酸片段，该截取方案尽可能的保留了RBD两端的loop结构，同时，确保N-端和C-端接口距离较近。进而，将三个截取的RBD区片段首尾串联，形成一个新的RBD三聚化融合蛋白。
为了实现对新冠病毒不同变异株的交叉保护，构建了马赛克型的RBD三聚化抗原，该抗原中三个RBD整合了各种不同变异株的关键突变位点。其中一个 RBD来自于Omicron变异株，含有G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、 N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y 和Y505H共15个突变。另外两个RBD为人工构建的非天然RBD，整合了不同变异株中频繁出现的具有较强免疫逃逸能力的关键突变位点。为了实现对关键突变位点的筛选整合，我们对新冠病毒各种变异株的突变位点进行了分析，在出现频率最高的20种突变位点中，选取了具有较强免疫逃逸能力的残基突变，同时，考虑了这些突变在空间结构上的分布，避免在空间结构上的相互影响。基于上述分析，两个人工构建的RBD共整合了10个关键位点突变，其中一个 RBD含有K417N、L452R、T478K、E484Q、F490S和N501Y共6个残基突变，另一个人工构建的RBD含有K417T、L452Q、S477N和E484K共4个残基突变。已经有大量的研究证实这些残基突变能够引起较强的免疫逃逸，并且在众多不同的病毒谱系中均频繁出现，表明这些突变在病毒进化中具有明显的选择优势，也预示着这些突变可能会在将来的突变株中再次独立或组合出现。将上述三个RBD顺序串联，构建了马赛克型三聚化RBD融合蛋白，具体串联方式为：含有“K417N、L452R、T478K、E484Q、F490S和N501Y”突变的RBD 的C-末端连接含有“K417T、L452Q、S477N和E484K”突变的RBD的N-末端，含有“K417T、L452Q、S477N和E484K”突变的RBD的C-末端连接Omicron 变异株RBD的N-末端。通过上述串联方式，融合后的序列如SEQID 1所示。
利用同源模建方法，搭建了马赛克型三聚化RBD融合蛋白可能的空间结构，结果如图1所示。图中显示了该融合蛋白包含有三个独立的RBD结构域，可以形成抗原构象稳定的三聚体形式，该蛋白共含有25个突变位点，这些突变位点以球棍模型显示在图1中。理论上推测以此作为靶抗原的重组疫苗涵盖了大量变异株中频繁出现的关键突变位点，具备跨流行株的广谱保护能力。另外，与传统的制备多个单价疫苗，通过多价组合来实现广谱保护的策略相比，在一种抗原分子上实现了跨流行株的广谱保护效果，在疫苗制备的时间成本、经济成本以及疫苗产能方面具有明显的优势。
实施例2：重组蛋白表达、纯化及鉴定
按照CHO细胞表达***的密码子偏爱性，对编码重组蛋白C05G13(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)的核苷酸序列进行密码子优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。构建CHO细胞表达载体后转染至293FT细胞或CHO 细胞内构建重组细胞株，通过有限稀释法筛选得到能够稳定分泌表达重组蛋白 C05G13的细胞株，经细胞培养后收获上清液，系列层析纯化后获得纯度≥95％的重组蛋白C05G13。SDS-PAGE检测结果如图2所示，蛋白分子量大小在 70～100kD，同时可见有部分产品相关物质，如二聚体蛋白和单体蛋白等。
将纯化后C05G13蛋白经SDS-PAGE电泳后电转至PVDF膜上，利用RBD 特异性抗体(厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号：40591-T62；稀释度： 2000倍)进行Western-blot鉴定(结果如图3所示)，可见C05G13蛋白可与RBD 特异性抗体发生结合，具有良好的生物学活性。采用TSKgel G2500PW凝胶色谱柱对纯化后的C05G13蛋白进行分子排阻色谱分析，蛋白纯度大于95％。
实施例3：C05G13蛋白理化性质及生物学活性检测
将纯化后的C05G13蛋白、C05蛋白(氨基酸序列如SEQ ID No.23所示，经293FT细胞或CHO细胞重组表达、层析纯化所得)以及C05C蛋白(氨基酸序列如SEQ ID No.24所示，经293FT细胞或CHO细胞重组表达、层析纯化所得)、原型株RBD蛋白(厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号：40592-V08B)、与Beta株病毒突变位点一致的RBD蛋白(K417N、E484K、N501Y；厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号：40592-V08H85)，与Delta株病毒突变位点一致的RBD蛋白(L452R,T478K；厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号： 40592-V02H3)、与Omicron株病毒突变位点一致的RBD蛋白(G339D,S371L, S373P,S375F,K417N,N440K,G446S,S477N,T478K,E484A,Q493R,G496S, Q498R,N501Y,Y505H；厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号： 40592-V08H121)，利用包被液分别稀释至1.0000μg/ml、0.3333μg/ml、0.1111μg/ml、0.0370μg/ml、0.0123μg/ml、0.0041μg/ml、0.0013μg/ml、0.0004μg/ml， 100μl/孔，包被至96孔酶标板上，4℃，8～12h，以空白孔为阴性对照；PBST溶液洗板后加入封闭液，37℃封闭2h；PBST溶液洗板后分别加入稀释至1μg/ml 抗体，具体包括MM43单克隆抗体(厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号： 40591-MM43)、MM57单克隆抗体(厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号： 40592-MM57)、MM117单克隆抗体(厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号： 40592-MM117)、R001单克隆抗体(厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号：40592-R001)、R117单克隆抗体(厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号： 40592-R117)、R118单克隆抗体(厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号： 40592-R118)，100μl/孔，37℃孵育1h；PBST溶液洗板后加入稀释后的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG抗体，100μl/孔，37℃孵育1h；PBST溶液洗板后先后加入显色液A和B，室温下显色5～10min，加入终止液C；酶标仪上进行双波长(OD450nm和630nm)读值，确定cut-off值，并绘制蛋白浓度-吸光度值曲线。
与MM43单克隆抗体结合活性结果如图4所示，与MM57单克隆抗体结合活性结果如图5所示，与MM117单克隆抗体结合活性结果如图6所示，与R001 单克隆抗体结合活性结果如图7所示，与R117单克隆抗体结合活性结果如图8 所示，与R118单克隆抗体结合活性结果如图9所示，结果可见C05G13蛋白兼具有原型株、Beta株、Delta株和Omicron株等多种变异株的蛋白生物学活性。
实施例4：重组新型冠状病毒疫苗制备
将纯化后的重组蛋白C05G13稀释至2倍目标抗原浓度，与1.2mg/ml氢氧化铝佐剂按1:1比例(w/w)混合吸附，并于磁力搅拌器上搅拌40～120min，转速为200～300rpm，获得疫苗半成品，上清残留蛋白含量应低于总蛋白含量的 10％，半成品每瓶按0.5ml装量无菌分装后即为疫苗成品。
实施例5：小鼠体内重组新型冠状病毒疫苗免疫学效果评价
将制备的重组新型冠状病毒疫苗(其中，C05G13蛋白疫苗为本发明实施例4中制备的疫苗；C05蛋白疫苗中的C05蛋白是由三个新型冠状病毒原始株S 蛋白RBD区域的第319～537位氨基酸片段构成的同源三聚体形式的重组蛋白，利用与本发明实施例4中相同的方法制备C05蛋白疫苗)，分别经腹腔注射免疫已经接种过1针次灭活疫苗(0.5μg/剂/只)的BALB/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司，SPF级，雌性，6-8周龄)，0.5μg/剂/只，具体为于第 0w免疫灭活疫苗1针次后，再于第3w免疫1针次重组新型冠状病毒疫苗或灭活疫苗，第4w采血分离血清。同时以铝佐剂作为安慰剂对照。采用该种试验方案目的是为了考察和模拟目前已接种过灭活疫苗人群再进行加强免疫后针对多种变异株的中和能力，以此评估疫苗的中和保护效果。
利用野病毒微量中和试验检测免后小鼠血清针对原型株、Beta株、Delta株和Omicron株病毒的中和活性，结果如图10所示，血清中和抗体GMT值如表 1所示，可见C05G13蛋白可产生针对多种病毒的广泛中和活性，针对原型株、 Beta株、Delta株病毒的中和能力与C05蛋白相当，针对Omicron病毒的中和能力显著优于C05蛋白，针对原型株、Beta株、Delta株和Omicron株病毒的中和活性均显著高于灭活疫苗，预期可产生广谱保护能力，是一种理想型的加强免疫候选疫苗。
表1小鼠免疫血清中和抗体GMT值(野病毒微量中和试验)
Figure RE-GDA0003576949280000171
实施例6：大鼠体内重组新型冠状病毒疫苗免疫学效果评价
将制备的重组新型冠状病毒疫苗(其中，C05G13蛋白疫苗为本发明实施例 4中制备的疫苗；C05蛋白疫苗中的C05蛋白是由三个新型冠状病毒原始株S 蛋白RBD区域的第319～537位氨基酸片段构成的同源三聚体形式的重组蛋白，利用与本发明实施例4中相同的方法制备C05蛋白疫苗；C05C蛋白疫苗中的 C05C蛋白是由三个新型冠状病毒S蛋白RBD区域的第319～537位氨基酸片段构成的异源三聚体形式的重组蛋白，其中的两个亚基分别来自Beta株和Kappa 株，利用与本发明实施例4中相同的方法制备C05C蛋白疫苗)，分别经肌肉注射免疫已经接种过1针次灭活疫苗(人用剂量)的Wistar大鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司，SPF级，雌性和雄性，6-8周龄)，10μg/剂/只，具体为于第0w免疫灭活疫苗1针次后，再于第3w免疫1针次重组新型冠状病毒疫苗或灭活疫苗，第4w采血分离血清。同时以铝佐剂作为安慰剂对照。采用该种试验方案目的是为了考察和模拟目前已接种过灭活疫苗人群再进行加强免疫后针对多种变异株的中和能力。
利用野病毒微量中和试验检测免后大鼠血清针对原型株、Beta株、Delta株和Omicron株病毒的中和活性，结果如图11所示，血清中和抗体GMT值如表 2所示，可见C05G13蛋白可产生针对多种病毒的广泛中和活性，针对原型株、 Beta株、Delta株病毒的中和能力与C05蛋白和C05C蛋白相当，针对Omicron 病毒的中和能力显著优于C05蛋白和C05C蛋白，针对原型株、Beta株、Delta 株和Omicron株病毒的中和活性均显著高于灭活疫苗，预期可产生广谱保护能力，是一种理想型的加强免疫候选疫苗。
表2大鼠免疫血清中和抗体GMT值
Figure RE-GDA0003576949280000181
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 国药中生生物技术研究院有限公司
<120> 一种重组新型冠状病毒蛋白疫苗、其制备方法和应用
<130> None
<160> 24
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<211> 1971
<212> DNA
<213> Artificial
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tgctatggcg tgtcccccac caagctgaac gatctgtgct ttaccaacgt gtacgccgac 240
tccttcgtga ttaggggcga cgaggtgcgg cagattgccc ccggtcagac cggcaacatc 300
gccgattata actacaaact gcccgacgac ttcaccggct gcgtgatcgc ctggaactcc 360
aacaatctgg actccaaggt ggggggcaac tacaactaca ggtacagact gttcaggaag 420
tccaacctga agcccttcga aagggacatc tccacagaga tctaccaggc cggctccaaa 480
ccctgcaacg gcgtgcaggg attcaactgc tactcccccc tgcagtccta cggattccag 540
cccacctacg gcgtgggata ccagccctac agagtggtgg tgctgtcctt tgagctgctg 600
cacgcacccg ccaccgtgtg tggccctaag aagtccacca acctggtgaa gaacaagagg 660
gtgcagccca ccgagagcat cgtgaggttc cccaacatca ccaacctgtg ccccttcggc 720
gaggtgttca acgccaccag gttcgccagc gtgtacgcct ggaacaggaa gaggatctca 780
aactgcgtgg cagactacag tgtgctgtac aactccgcct ccttctccac attcaagtgc 840
tatggcgtgt cccccaccaa gctgaacgat ctgtgcttta ccaacgtgta cgccgactcc 900
ttcgtgatta ggggcgacga ggtgcggcag attgcccccg gtcagaccgg caacatcgcc 960
gattataact acaaactgcc cgacgacttc accggctgcg tgatcgcctg gaactccaac 1020
aatctggact ccaaggtggg gggcaactac aactacaggt acagactgtt caggaagtcc 1080
aacctgaagc ccttcgaaag ggacatctcc acagagatct accaggccgg ctccaaaccc 1140
tgcaacggcg tgcagggatt caactgctac tcccccctgc agtcctacgg attccagccc 1200
acctacggcg tgggatacca gccctacaga gtggtggtgc tgtcctttga gctgctgcac 1260
gcacccgcca ccgtgtgtgg ccctaagaag tccaccaacc tggtgaagaa caagagggtg 1320
cagcccaccg agagcatcgt gaggttcccc aacatcacca acctgtgccc cttcggcgag 1380
gtgttcaacg ccaccaggtt cgccagcgtg tacgcctgga acaggaagag gatctcaaac 1440
tgcgtggcag actacagtgt gctgtacaac tccgcctcct tctccacatt caagtgctat 1500
ggcgtgtccc ccaccaagct gaacgatctg tgctttacca acgtgtacgc cgactccttc 1560
gtgattaggg gcgacgaggt gcggcagatt gcccccggtc agaccggcaa catcgccgat 1620
tataactaca aactgcccga cgacttcacc ggctgcgtga tcgcctggaa ctccaacaat 1680
ctggactcca aggtgggggg caactacaac tacaggtaca gactgttcag gaagtccaac 1740
ctgaagccct tcgaaaggga catctccaca gagatctacc aggccggctc caaaccctgc 1800
aacggcgtgc agggattcaa ctgctactcc cccctgcagt cctacggatt ccagcccacc 1860
tacggcgtgg gataccagcc ctacagagtg gtggtgctgt cctttgagct gctgcacgca 1920
cccgccaccg tgtgtggccc taagaagtcc accaacctgg tgaagaacaa g 1971
<210> 21
<211> 1971
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 21
agggtgcagc ctaccgagtc cattgtgcgg ttccctaaca tcaccaatct gtgccccttt 60
ggcgaagtgt ttaacgccac ccgattcgcc tccgtgtacg cctggaatag gaagaggatt 120
tccaactgcg tggccgacta ctccgtgctg tacaattccg cctccttttc caccttcaag 180
tgttatggtg tgtcccccac aaagctgaac gacctgtgct tcaccaacgt gtatgccgac 240
tcctttgtga ttcggggcga cgaggtgagg cagatcgccc ctggccagac cggcaccatt 300
gccgactata actacaagct gcccgacgat ttcaccggct gtgtgattgc ctggaactct 360
aacaatctgg atagcaaggt gggaggaaac tacaattacc agtacagact gtttaggaag 420
agtaacctga agccattcga aagggatatc tctaccgaga tctaccaggc tggcaacacc 480
ccctgcaacg gagtgaaggg ctttaactgc tacttccccc tgcagtctta cggcttccag 540
cccacaaacg gcgtgggcta ccagccctat agagtggtgg tgctgtcttt tgaactgctg 600
cacgcccccg ccaccgtgtg cggacctaag aagtctacca acctggtgaa aaacaaaagg 660
gtgcagccta ccgagtccat tgtgcggttc cctaacatca ccaatctgtg cccctttggc 720
gaagtgttta acgccacccg attcgcctcc gtgtacgcct ggaataggaa gaggatttcc 780
aactgcgtgg ccgactactc cgtgctgtac aattccgcct ccttttccac cttcaagtgt 840
tatggtgtgt cccccacaaa gctgaacgac ctgtgcttca ccaacgtgta tgccgactcc 900
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aatctggata gcaaggtggg aggaaactac aattaccagt acagactgtt taggaagagt 1080
aacctgaagc cattcgaaag ggatatctct accgagatct accaggctgg caacaccccc 1140
tgcaacggag tgaagggctt taactgctac ttccccctgc agtcttacgg cttccagccc 1200
acaaacggcg tgggctacca gccctataga gtggtggtgc tgtcttttga actgctgcac 1260
gcccccgcca ccgtgtgcgg acctaagaag tctaccaacc tggtgaaaaa caaaagggtg 1320
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ggtgtgtccc ccacaaagct gaacgacctg tgcttcacca acgtgtatgc cgactccttt 1560
gtgattcggg gcgacgaggt gaggcagatc gcccctggcc agaccggcac cattgccgac 1620
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cccgccaccg tgtgcggacc taagaagtct accaacctgg tgaaaaacaa a 1971
<210> 22
<211> 1971
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 22
agggtgcagc caaccgagtc catcgtgagg tttcccaata tcaccaacct gtgtcccttc 60
gacgaagtgt tcaacgctac ccgcttcgcc tccgtgtatg cctggaacag aaaaaggatc 120
agtaactgcg tggctgacta cagtgtgctg tataacctgg cccctttctt taccttcaag 180
tgctacggcg tgtcccctac taagctgaac gacctgtgtt ttaccaacgt gtacgctgac 240
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tccaacctga aacccttcga acgggacatc tcaacagaga tctatcaggc cggcaacaaa 480
ccctgcaatg gcgtggccgg atttaactgc tatttccccc tgagatccta cagcttccgc 540
cccacctacg gagtgggaca ccagccctac cgcgtggtgg tgctgagttt cgagctgctg 600
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cctgctaccg tgtgcggccc caagaagtcc actaacctgg tgaagaataa g 1971
<210> 23
<211> 658
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 23
Met Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
1 5 10 15
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser
20 25 30
Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
35 40 45
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
50 55 60
Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
85 90 95
Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
100 105 110
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val
115 120 125
Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu
130 135 140
Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
145 150 155 160
Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
165 170 175
Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
180 185 190
Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys
195 200 205
Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Arg Val Gln Pro
210 215 220
Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe
225 230 235 240
Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn
245 250 255
Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn
260 265 270
Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys
275 280 285
Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile
290 295 300
Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile
305 310 315 320
Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile
325 330 335
Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn
340 345 350
Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg
355 360 365
Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly
370 375 380
Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln
385 390 395 400
Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser
405 410 415
Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser
420 425 430
Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val
435 440 445
Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn
450 455 460
Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser
465 470 475 480
Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser
485 490 495
Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys
500 505 510
Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val
515 520 525
Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr
530 535 540
Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn
545 550 555 560
Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu
565 570 575
Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu
580 585 590
Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn
595 600 605
Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val
610 615 620
Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His
625 630 635 640
Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys
645 650 655
Asn Lys
<210> 24
<211> 658
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 24
Met Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
1 5 10 15
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser
20 25 30
Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
35 40 45
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
50 55 60
Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
85 90 95
Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
100 105 110
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val
115 120 125
Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu
130 135 140
Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
145 150 155 160
Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
165 170 175
Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
180 185 190
Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys
195 200 205
Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Arg Val Gln Pro
210 215 220
Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe
225 230 235 240
Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn
245 250 255
Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn
260 265 270
Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys
275 280 285
Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile
290 295 300
Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Asn Ile
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Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile
325 330 335
Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn
340 345 350
Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg
355 360 365
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Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln
385 390 395 400
Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser
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Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser
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Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val
435 440 445
Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn
450 455 460
Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser
465 470 475 480
Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser
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Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val
515 520 525
Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr
530 535 540
Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn
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Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu
580 585 590
Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Gln Gly Phe Asn
595 600 605
Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val
610 615 620
Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His
625 630 635 640
Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys
645 650 655
Asn Lys

Claims (19)

1. 一种重组新型冠状病毒蛋白，其特征在于，所述重组新型冠状病毒蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2. 一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列包含如权利要求1所述的重组新型冠状病毒蛋白的氨基酸序列；所述融合蛋白中除所述SEQ ID No.1所示的氨基酸序列以外的氨基酸序列为信号肽或标签。
3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1所述的重组新型冠状病毒蛋白，或编码如权利要求2所述的融合蛋白的核苷酸序列。
4. 根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列为如SEQID No.12所示的核苷酸序列。
5.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求3所述的核酸分子。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求3所述的核酸分子或如权利要求5所述的载体。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为CHO细胞。
9.如权利要求1所述的重组新型冠状病毒蛋白或如权利要求2所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A）制备如权利要求3所述的核酸分子，构建该核酸分子的表达载体，将表达载体转化或转染至宿主细胞内；
步骤B）利用步骤A）的产物进行蛋白质表达；
步骤C）纯化步骤B）中获得的表达产物，得到所述重组新型冠状病毒蛋白或融合蛋白。
10.如权利要求1中所述的重组新型冠状病毒蛋白、如权利要求2所述的融合蛋白、如权利要求3所述的核酸分子、如权利要求5所述的载体或如权利要求6所述的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防新型冠状病毒感染和/或新型冠状病毒引起的疾病的药物中的用途。
11.如权利要求1所述的重组新型冠状病毒蛋白、如权利要求2所述的融合蛋白、如权利要求3所述的核酸分子、如权利要求5所述的载体或如权利要求6所述的宿主细胞在制备对已接种过新型冠状病毒疫苗的人群进行加强免疫的药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述新型冠状病毒疫苗为新型冠状病毒疫苗灭活疫苗。
13.一种重组蛋白疫苗，其特征在于，所述疫苗包含如权利要求1所述的重组新型冠状病毒蛋白或如权利要求2所述的融合蛋白，以及佐剂。
14.根据权利要求13所述的重组蛋白疫苗，其特征在于，所述佐剂为氢氧化铝、磷酸铝、MF59或CpG。
15.据权利要求14所述的重组蛋白疫苗，其特征在于，所述佐剂为氢氧化铝。
16.如权利要求13、14或15所述的重组蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，将纯化所得的所述重组新型冠状病毒蛋白或所述融合蛋白与所述佐剂混合。
17.一种基因工程载体疫苗，其特征在于，所述基因工程载体疫苗包含如权利要求3所述的核酸分子。
18.一种核酸疫苗，其特征在于，所述核酸疫苗包含如权利要求3所述的核酸分子。
19.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求13、17或18所述的疫苗，以及药学上可接受的载体。
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