CN113461787A

CN113461787A - 一种重组新型冠状病毒s-rbd三聚体蛋白、其制备方法和应用

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Publication number: CN113461787A
Application number: CN202110464788.1A
Authority: CN
Inventors: 李启明; 梁宇; 苏计国; 杜丽芳; 侯俊伟; 张学峰; 张靖; 靳玉琴; 唐芳; 刘兆明; 韩子泊; 雷泽华; 张�浩; 邵帅; 侯亚楠; 马智静; 陈实; 郑凡; 刘宁
Original assignee: China National Biotec Research Institute Co ltd
Current assignee: China National Biotec Research Institute Co ltd
Priority date: 2021-04-28
Filing date: 2021-04-28
Publication date: 2021-10-01
Also published as: CN115246874A

Abstract

本发明公开了一种重组新型冠状病毒S‑RBD三聚体蛋白，所述三聚体蛋白由三聚体形式的新型冠状病毒S蛋白RBD区第308～603位氨基酸片段构成。本发明制备的疫苗以S‑RBD三聚体蛋白为抗原，辅以佐剂后，免疫机体，可产生针对新型冠状病毒的高滴度保护性中和抗体，可以用于治疗和/或预防新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)感染和/或新型冠状病毒疾病。

Description

一种重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白、其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白、其制备方法和应用。

背景技术

SARS-CoV-2，属巢病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、正冠状病毒亚科、Betacoronavirus属、Sarbecovirus亚属、类SARS病毒种、单股正链RNA病毒，有包膜，基因组全长约为29.9kb，绝大部分编码非结构蛋白，参与病毒复制和翻译等功能，少部分序列编码结构蛋白，如：刺突蛋白(spike protein，S)、M蛋白(membrane protein)、E蛋白(envelope protein)和N蛋白 (nucleo protein)，此外还有若干附属蛋白：3a,3b,p6,7a,7b,8b,9b和orf14，这些蛋白均参与病毒组装。S、M和E蛋白构成病毒囊膜，是病毒引起免疫反应的主要表面抗原。其中S蛋白是一种跨膜糖蛋白，分子量约为150kDa，在病毒表面形成突出的同源三聚体。S由两个功能亚基组成，在S1和S2亚基之间的边界处(S1/S2裂解点)被切割，这两个亚基在融合前构象中保持非共价结合。S2 亚基也由多个结构域构成，它的功能主要是介导病毒与宿主细胞的融合。远端 S1亚基在结构上分为四个不同的结构域：NTD、RBD、CTD1和CTD2，其中 RBD是受体结合结构域，主要负责与宿主细胞表面的受体血管紧张素转换酶2 (angiotensin converting enzyme 2,ACE2)结合，从而介导病毒侵染宿主细胞，因此S蛋白及RBD均为目前基因工程疫苗研发的主要靶标。

截至目前，全球获批上市的疫苗共有7款，分别是美国批准紧急使用授权 (EUA)的BNT162b2和mRNA-1273，英国批准紧急使用授权(EUA)的 AZD1222，中国国药中生(北京公司和武汉公司)和北京科兴各自附条件上市的3款新冠灭活疫苗、康希诺生物腺病毒载体疫苗以及智飞生物重组蛋白疫苗，印度批准紧急使用授权(EUA)国产灭活疫苗，以及俄罗斯批准上市的“卫星V”，另外还有数十种疫苗处于临床研究不同阶段。利用基因工程技术研制重组疫苗由于其高度的安全性和有效性已被广泛证实，加之当前新冠病毒变异株不断出现并且占比持续上升，现有疫苗及中和抗体对特定突变株的保护效果大幅降低，引发各界对新冠疫情走势及疫苗和药物有效性的担忧。

因此，开发一种可产生针对新型冠状病毒高滴度的保护性中和抗体的重组疫苗已成为当务之急。

发明内容

本发明的一个方面，是针对现有技术中缺少可产生针对新型冠状病毒高滴度的保护性中和抗体的重组疫苗的缺陷，提供了一种重组新型冠状病毒S-RBD 三聚体蛋白。

本发明提供的技术方案为：

一种重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白，所述三聚体蛋白由三聚体形式的新型冠状病毒S蛋白RBD区第308～603位氨基酸片段构成。

本发明基于新冠病毒S-RBD区结构学特征，利用计算生物学方法设计了一种全新的融合蛋白，该蛋白包含有三个RBD结构域，在可以不引入任何外源连接臂或其它无关成分情况下，形成抗原构象稳定的三聚体形式，实现S-RBD蛋白三聚化，利用基因工程技术重组表达并纯化出S-RBD三聚体蛋白后，与佐剂混合制备成疫苗，免疫动物可产生针对新型冠状病毒高滴度的保护性中和抗体，用于治疗和/或预防新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染和/或新型冠状病毒疾病 (COVID-19)。另外，由于RBD区功能明确，结构清楚，负责识别受体细胞的 ACE区，同时针对RBD产生的抗体功能明确，最大程度避免诱导机体产生抗体依赖的增强作用(Antibody Dependent Enhancement，ADE)。

本发明中所述的三聚体蛋白可由三个相同序列的多肽亚基通过自组装形成。在本发明的实施方式中，上述三个相同序列之间可以包含合适的连接体 (Linker)或间隔区，其可以为寡肽或多肽，其作用可以为增加柔性。

但作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述三聚体蛋白的一级结构为三个所述氨基酸片段按照N末端至C末端的顺序连接。

更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示或与其具有95％以上同源性的序列。

在上述实施方式中，本发明三聚体蛋白在可以不引入任何外源连接臂或其它无关成分情况下，形成抗原构象稳定的三聚体形式。

上述与其具有95％以上同源性的序列是指与所述融合蛋白的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。本领域技术人员可以对本说明书中所述融合蛋白的氨基酸序列以合适的方式进行随机或者工程化的点突变，其目的可以为，例如，获得更好的亲和力和/或解离性质，而这些突变后的氨基酸序列均包含在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个方面，是提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含上述重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白。

作为优选，在本发明的实施方式中，所述融合蛋白还包含选自信号肽、标签或免疫增强肽中的一种或几种。所述信号肽的作用可以是更有利于蛋白质的表达；所述标签可以为，例如，Flag标签、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)，等等，其作用可以是用于检测、纯化、分离等等。上述功能性序列可任意组合使用。

本发明的另一个方面，是提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码上述重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白，或编码上述融合蛋白的核苷酸序列。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，发明人对所述三聚体蛋白的密码子进行了优化，得到的所述核苷酸序列如SEQ ID No.2所示或与其具有95％以上同源性的序列。

上述与其具有95％以上同源性的序列是指与所述核苷酸序列具有95％、 96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。

对于上述核酸分子的制备方法，可基于上述核苷酸序列，通过化学合成或 PCR扩增等已知技术制备。通常，可以对编码上述结构域的氨基酸的密码子进行优化，以优化其在宿主细胞中的表达。上述碱基序列的信息可通过检索已知文献或NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等数据库来获得。

本发明的另一个方面，是提供了一种载体，所述载体包含上述核酸分子。

在本发明中，上述载体可以为直链载体，也可以为环状载体。可以为质粒等非病毒载体，也可以为病毒载体，还可以为利用转座子的载体。所述载体中可含有启动子、终止子等调控序列，以及耐药基因、报告基因等标记序列。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述载体为本发明中所述核酸分子的表达载体。

本发明的另一个方面，是提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述核酸分子或上述载体。

作为优选，在本发明的实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；

更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述宿主细胞为CHO细胞。

本发明的另一个方面，是提供了一种上述重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白或上述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

步骤A)制备所述核酸分子，构建所述表达载体，将表达载体转化或转染至所述宿主细胞内；

步骤B)利用步骤A)的产物进行蛋白质表达；

步骤C)纯化步骤B)中获得的表达产物，得到所述重组新型冠状病毒S-RBD 三聚体蛋白或融合蛋白。

其中，步骤A)所述核酸分子包含编码上述重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白，或编码上述融合蛋白的核苷酸序列。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述核苷酸序列如SEQ ID No.2 所示或与其具有95％以上同源性的序列。

可使用任意合适的分子生物学方法根据本说明书中所述核苷酸序列制备所述核酸分子。

其中，步骤A)所述构建表达载体可以使用任意合适的方法将上述核苷酸序列构建在宿主细胞相应的表达载体中。

然后将表达载体转化或转染至所述宿主细胞内。作为优选，在本发明的一个实施方式中，发明人在构建CHO细胞表达载体后将其转染至293FT细胞或 CHO细胞内构建重组细胞株。

其中，步骤B)所述蛋白质表达可以根据所使用的不同表达***对重组蛋白进行表达。进一步地，在本发明的一个实施方式中，发明人通过有限稀释法筛选得到能够稳定分泌表达S-RBD三聚体蛋白或融合蛋白的细胞株。

其中，步骤C)所述纯化可以为任意合适的方法。例如，盐析法、沉淀法、透析或超滤、分子筛层析法、离子交换层析、疏水层析法、亲和层析法，等等。作为优选，在本发明的一个实施方式中，采用离子交换和疏水层析的方法纯化上述S-RBD三聚体蛋白或融合蛋白。

当然，根据现有技术，在进行纯化步骤之前，还应包含对目标蛋白质的收集过程，例如，对富含目标蛋白质的细胞培养液上清的收集；对已表达目标蛋白质后的所述宿主细胞进行破碎后收集的过程，所述破碎可以使用例如，超声波破碎、反复冻融破碎、化学处理法等任意合适的破碎方法。上述对宿主细胞的收集过程也应理解为包含在所述纯化的范围之内。

本发明的另一个方面，是提供了所述重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白、所述融合蛋白、所述核酸分子、所述载体或所述宿主细胞在制备用于治疗和/或预防新型冠状病毒感染和/或新型冠状病毒引起的疾病的药物中的用途。

所述新型冠状病毒引起的疾病优选为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。

本发明的另一个方面，是提供了一种疫苗，所述疫苗包含所述重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白或所述融合蛋白，以及佐剂。

在本发明的实施方式中，所述疫苗为重组蛋白疫苗(或称基因工程亚单位疫苗)。进一步地，在本发明的另外一些实施方式中，所述疫苗还可以为基因工程载体疫苗，或者可以为核酸疫苗，上述疫苗包含本说明书中所述核苷酸序列。

在本发明所述疫苗中，可以包含任意合适的佐剂。但作为优选，在本发明的实施方式中，所述佐剂为氢氧化铝、磷酸铝、MF59或CpG。更优选地，所述佐剂为氢氧化铝。

本发明的另一个方面，是提供了上述疫苗的制备方法，将纯化所得的所述重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白或所述融合蛋白与所述佐剂混合。

本发明的另一个方面，是提供了一种基因工程载体疫苗，所述基因工程载体疫苗包含上述核酸分子。

在本发明的实施方式中，所述基因工程载体疫苗中的载体可以为复制型或非复制型载体，例如，腺病毒、痘苗病毒、霍乱弧菌、沙门氏菌、卡介苗，等。

本发明的另一个方面，是提供了一种核酸疫苗，所述mRNA疫苗包含编码上述重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白，或编码上述融合蛋白的核苷酸序列。

所述核酸疫苗可以为DNA疫苗或RNA疫苗，特别是mRNA疫苗。

本发明的另一个方面，是提供了上述疫苗在治疗和/或预防新型冠状病毒感染和/或新型冠状病毒引起的疾病中的用途。

本发明的另一个方面，是提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含所述疫苗，以及药学上可接受的载体。

所述药学上可接受的载体可以为任意药学上允许的添加剂，例如，生理盐水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、氨基酸以及它们的组合物、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、等渗剂等。

本发明所述药物组合物也可以和其他治疗和/或预防新型冠状病毒感染和/ 或新型冠状病毒引起的疾病的药物在有效安全的剂量下联合使用。

本发明的另一个方面，是提供了一种引发受试者针对新型冠状病毒的免疫应答或治疗受试者的新型冠状病毒感染的方法，向所述受试者施用有效剂量的所述疫苗或所述药物组合物。

所述受试者可以为人类或者其他动物。

所述施用可以为肌肉注射、腹腔注射或皮下注射。

本发明的有益效果：

本发明制备的疫苗以S-RBD三聚体蛋白为抗原，辅以佐剂后，免疫机体，可产生针对新型冠状病毒的高滴度保护性中和抗体，可以用于治疗和/或预防新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染和/或新型冠状病毒疾病。

附图说明

图1为本发明实施例1中新型冠状病毒S蛋白结构分析图，其中，A为S 蛋白单体结构(基于PDB代码为6zgg的坐标文件，采用UCSF Chimera软件绘制)，S1结构单元包括NTD、RBD、SD1和SD2结构域；B为RBD与ACE2 受体复合物结构(基于PDB代码为6m0j的坐标文件，采用UCSF Chimera软件绘制)；

图2为本发明实施例1中S-RBD三聚体蛋白设计图，其中，A为S-RBD单体蛋白结构；B为S-RBD三聚体蛋白结构；

图3为本发明实施例2中纯化所得S-RBD三聚体蛋白的SDS-PAGE图，其中，泳道1为纯化获得的S-RBD三聚体蛋白；泳道2-7为纯化过程中的S-RBD 三聚体蛋白；泳道M为蛋白质marker(分子量标准为：kDa：250、150、100、 70、50、40、30、20、15、10、5)；

图4为本发明实施例2中纯化所得S-RBD三聚体蛋白的Western-blot鉴定图，其中，泳道1为阴性对照；泳道2为纯化获得的S-RBD三聚体蛋白；泳道M为蛋白质marker(分子量标准为：kDa：250、130、100、70、55、35、25、 15、105)；

图5为本发明实施例3中纯化所得S-RBD三聚体蛋白与MM43和MM57 中和性单克隆抗体结合曲线图；

图6为本发明实施例5中血清特异性IgG滴度检测结果图；

图7为本发明实施例5中针对野病毒的血清中和抗体滴度检测结果图；

图8为本发明对比例1中血清特异性IgG滴度检测结果图；

图9为本发明对比例1中针对野病毒的血清中和抗体滴度检测结果图。

序列说明

SEQ ID No.1为本发明实施例中重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白的氨基酸序列；

SEQ ID No.2为本发明实施例中重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白的核苷酸序列；

SEQ ID No.3为本发明对比例中新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的氨基酸序列；

SEQ ID No.4为本发明对比例中新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的核苷酸序列。

具体实施方式

本发明公开了一种重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白、其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。下面就本发明中出现的部分术语作以解释。

术语“新型冠状病毒”，即SARS-CoV-2，属巢病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、正冠状病毒亚科、Betacoronavirus属、Sarbecovirus亚属、类SARS病毒种、单股正链RNA病毒，有包膜，基因组全长约为29.9kb，绝大部分编码非结构蛋白，参与病毒复制和翻译等功能，少部分序列编码结构蛋白，如：刺突蛋白(spike protein，S)、M蛋白(membrane protein)、E蛋白(envelope protein)和N蛋白(nucleo protein)，此外还有若干附属蛋白：3a,3b,p6,7a,7b,8b,9b 和orf14，这些蛋白均参与病毒组装。S、M和E蛋白构成病毒囊膜，是病毒引起免疫反应的主要表面抗原。其中S蛋白是一种跨膜糖蛋白，分子量约为 150kDa，在病毒表面形成突出的同源三聚体。S由两个功能亚基组成，在S1和 S2亚基之间的边界处(S1/S2裂解点)被切割，这两个亚基在融合前构象中保持非共价结合。S2亚基也由多个结构域构成，它的功能主要是介导病毒与宿主细胞的融合。远端S1亚基在结构上分为四个不同的结构域：NTD、RBD、CTD1 和CTD2，其中RBD是受体结合结构域，主要负责与宿主细胞表面的受体血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)结合，从而介导病毒侵染宿主细胞，因此S蛋白及RBD均为目前基因工程疫苗研发的主要靶标。

术语“三聚体形式”，是蛋白质四级结构中的一种类型。蛋白质四级结构是指蛋白质亚基相对于彼此的数目和排列(Chou,Kuo-Chen；Cai,Yu-Dong. Predicting proteinquaternary structure by pseudo amino acid composition.Proteins: Structure,Function,and Bioinformatics.1November 2003,53(2):282–289.)。其中含有三个蛋白质亚基即为三聚体形式。

术语“一级结构”，是肽或蛋白质中氨基酸的线性序列。按照惯例，蛋白质的一级结构被报道从氨基末端(N)端到羧基末端(C)端。

术语“融合蛋白”，fusion protein，是指通过DNA重组技术得到的一个、两个或多个基因重组后的表达产物。融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法，利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。

术语“载体”，是可将多核苷酸***其中的一种核酸运载工具。当载体能使 ***的多核苷酸编码的蛋白质获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1 来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

术语“宿主细胞”，是已经通过分子生物学技术将核酸分子引入的细胞。，这些技术包括转染病毒载体，用质粒载体转化，以及通过电穿孔、脂转染、和粒子枪加速引入裸DNA。

术语“治疗”，是指减少疾病病理的可能性，减少疾病症状的发生，例如在一定程度上受试者具有更长的存活期或减少的不适。治疗可以是指当向受试者给予疗法时该疗法减少疾病症状、体征或病因的能力。治疗还指缓和或减少至少一种临床症状和/或抑制或延迟病症的进展和/或预防或延迟疾病或疾患的发作。

术语“受试者”是指接受预防、治疗、诊断的任何人或其他动物，特别是其他哺乳动物。其他哺乳动物可以包括，例如，狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔子、大鼠、豚鼠、小鼠等。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：基于结构生物学设计重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白

通过对天然S蛋白三聚体空间结构分析(如图1所示)、并对RBD结构域的N端和C端的空间距离进行计算，发现在不引入外源载体或序列的情况下，可以利用RBD自身的结构特征实现三聚化，同时不会存在较大的空间位障，受体结合位点和主要中和抗体表位也不会被遮蔽。基于此，截取新型冠状病毒 (Genebank编号：MN908947.3)S蛋白RBD区序列片段(308～603位氨基酸)， N端和C端的间距为

将三个相同RBD区片段首尾串联，形成一个新的融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，利用多聚体结构预测软件(initiodomain assembly，AIDA)和分子动力学模拟(GROMACS)，显示该融合蛋白包含有三个独立RBD结构域，形成抗原构象稳定的三聚体形式(如图2所示)，即为重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白。

实施例2：重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白的表达、纯化及鉴定

按照CHO细胞表达***的密码子偏爱性，对SEQ ID NO.1氨基酸序列进行密码子优化，优化后的基因序列如SEQ ID NO.2所示，构建CHO细胞表达载体后转染至293FT细胞或CHO细胞内构建重组细胞株，通过有限稀释法筛选得到能够稳定分泌表达S-RBD三聚体蛋白的细胞株。

经系列层析纯化后获得纯度≥90％的S-RBD三聚体蛋白。SDS-PAGE检测结果如图3所示，蛋白分子量大小在100～150kD之间，同时可见有部分产品相关物质，如二聚体蛋白和单体蛋白。将纯化后蛋白SDS-PAGE电泳后电转至PVDF 膜上，利用RBD特异性抗体(厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号： 40591-T62；稀释度：2000倍)进行Western-blot鉴定(结果如图4所示)，纯化后的蛋白可与RBD特异性抗体发生结合，具有良好的免疫原性。

实施例3：重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白与中和性单克隆抗体结合生物学分析

将纯化后的S-RBD三聚体蛋白稀释至1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、 0.125μg/ml、0.0625μg/ml、0.03125μg/ml、0.015625μg/ml、0.007813μg/ml，100μl/ 孔，包被至96孔酶标板上，4℃，8～12h，以空白孔为阴性对照；PBST溶液洗板后加入封闭液，37℃封闭3h；PBST溶液洗板后分别加入稀释后的MM43单克隆抗体(厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号：40591-MM43，稀释度： 2000倍)或MM57单克隆抗体(厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号： 40592-MM57；稀释度：2000倍)，100μl/孔，37℃孵育1h；PBST溶液洗板后加入稀释后的HEP标记的羊抗鼠IgG(厂家：北京中杉金桥生物技术有限公司；货号：ZB-2305；稀释度：10000倍)，100μl/孔，37℃孵育1h；PBST溶液洗板后先后加入显色液(厂家：万泰生物)A和B，室温下显色5～10min，加入终止液C；酶标仪上进行双波长(OD450nm和630nm)读值，确定cutoff值，并绘制蛋白浓度-吸光度值曲线，结果如图5所示，可见S-RBD三聚体蛋白与MM43和MM57两种中和性单克隆抗体均具有良好的结合活性。

实施例4：重组新型冠状病毒疫苗制备

将纯化后的S-RBD三聚体蛋白稀释至2倍目标抗原浓度，与1.2mg/ml氢氧化铝佐剂按1:1比例(w/w)混合吸附，并于磁力搅拌器上搅拌40～120min，转速为200～300rpm，获得疫苗半成品，上清残留蛋白含量应低于总蛋白含量的 10％，半成品每瓶按0.5ml装量无菌分装后即为疫苗成品。

实施例5：重组新型冠状病毒疫苗免疫学效果评价

将实施例4中制备的重组新型冠状病毒疫苗按照表1所示动物试验方案经腹腔注射免疫BALB小鼠，0.5ml/只。利用ELISA方法检测免后血清中针对S-RBD蛋白的特异性IgG抗体滴度，利用野病毒微量中和试验检测中和抗体滴度，可见免疫3针后可刺激小鼠产生较高滴度的抗体水平，血清特异性IgG结果如图6所示，针对RBD蛋白的IgG抗体GMT值达到120万，野病毒微量中和如图7所示，针对野病毒的中和抗体滴度GMT值为707。

血清特异性IgG抗体检测：采用ELISA方法检测免后血清中针对S-RBD蛋白的特异性IgG抗体水平，将RBD蛋白(购自北京义翘神州科技股份有限公司，货号为40592-V08B)稀释至1μg/ml，并以100μl/孔包被于酶标板中，封闭后，加入经系列稀释的血清，利用酶标记抗体(鼠源)检测信号，确定cut-off值，阳性血清最高稀释倍数即为该血清样品的特异性IgG抗体滴度。

野病毒微量中和试验：该试验于BSL3级实验室完成，病毒株为2020XN4276 株，将系列稀释后的血清与病毒(100TCID50)等体积混合孵育，37℃温箱中和 2小时，加入到含有Vero-E6细胞(2×10⁵/ml)的细胞培养板中，同时设置细胞对照和病毒对照，37℃温箱中培养3～5天，观察细胞病变情况，采用 Reed-Muench法计算50％感染抑制率时血清稀释倍数，即为该血清样品的中和抗体滴度。

表1.S-RBD三聚体蛋白免疫原性评价动物试验方案

对比例1：S-RBD三聚体蛋白和二聚体蛋白比较

截取新型冠状病毒(Genebank编号：MN908947.3)S蛋白RBD区序列片段(319～537位氨基酸)，将两个相同RBD区片段首尾串联，形成一个二聚体融合蛋白，氨基酸序列如SEQID NO.3所示，按照CHO细胞表达***的密码子偏爱性，对SEQ ID NO.3氨基酸序列进行密码子优化，优化后的基因序列如SEQ ID NO.4所示，构建CHO细胞表达载体后转染至293FT细胞后，获得能够表达二聚体蛋白的细胞株，经系列层析纯化后获得纯度≥95％的S-RBD二聚体蛋白，与 1.2mg/ml氢氧化铝佐剂按1:1比例(w/w)混合吸附后制备二聚体蛋白免疫物，与相同工艺制备的三聚体蛋白免疫物，经腹腔注射免疫BALB/c小鼠，抗原含量为6.0μg/剂，铝佐剂含量为0.30mg/剂，按照0w，1w和2w免疫3针次，全程免后2w采集并分离血清，利用ELISA方法检测免后血清中针对S-RBD蛋白的特异性IgG抗体滴度，检测结果如图8所示，利用野病毒微量中和试验检测中和抗体滴度，检测结果如图9所示，可见三聚体蛋白产生的抗体水平与二聚体蛋白水平相当，特异性IgG抗体和中和抗体滴度差异均无统计学差异。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 国药中生生物技术研究院有限公司

<120> 一种重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白、其制备方法和应用

<130> /

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 887

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 1

Met Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln

1 5 10 15

Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro

20 25 30

Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp

35 40 45

Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr

50 55 60

Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr

65 70 75 80

Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val

85 90 95

Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys

100 105 110

Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val

115 120 125

Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr

130 135 140

Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu

145 150 155 160

Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn

165 170 175

Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe

180 185 190

Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu

195 200 205

Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys

210 215 220

Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly

225 230 235 240

Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro

245 250 255

Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg

260 265 270

Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly

275 280 285

Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln

290 295 300

Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro

305 310 315 320

Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg

325 330 335

Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val

340 345 350

Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys

355 360 365

Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn

370 375 380

Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile

385 390 395 400

Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro

405 410 415

Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp

420 425 430

Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys

435 440 445

Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln

450 455 460

Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe

465 470 475 480

Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln

485 490 495

Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala

500 505 510

Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys

515 520 525

Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu

530 535 540

Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala

545 550 555 560

Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp

565 570 575

Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr

580 585 590

Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr

595 600 605

Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly

610 615 620

Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg

625 630 635 640

Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser

645 650 655

Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu

660 665 670

Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg

675 680 685

Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala

690 695 700

Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala

705 710 715 720

Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr

725 730 735

Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp

740 745 750

Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val

755 760 765

Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro

770 775 780

Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe

785 790 795 800

Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr

805 810 815

Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr

820 825 830

Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln

835 840 845

Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro

850 855 860

Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val

865 870 875 880

Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr

885

<210> 2

<211> 2664

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 2

atgacagtgg agaagggcat ctatcagaca agcaatttta gggtacaacc tacagagtct 60

attgtgagat tcccaaatat caccaacctt tgtccttttg gagaggtctt taatgccaca 120

agatttgcct ctgtgtatgc ctggaacaga aagagaattt caaattgtgt tgctgactat 180

agtgtgctct ataactctgc tagctttagc accttcaagt gctatggagt gagcccaacc 240

aagctgaatg acctgtgttt taccaatgtg tatgctgatt cctttgtgat cagaggagat 300

gaggttagac agattgcccc tggccaaact ggtaaaattg ctgactacaa ctacaagctg 360

cctgatgact tcactggctg tgtgattgcc tggaacagca ataatctgga ctctaaggta 420

gggggtaact ataattacct gtacagattg ttcagaaaaa gcaaccttaa gccttttgag 480

agagacattt ccacagagat atatcaagct ggctctaccc cttgtaatgg agtggaaggt 540

ttcaactgct attttcctct gcagagctat ggctttcagc ccaccaatgg agtgggctat 600

cagccttaca gagtggtggt tctgtctttt gagctcctgc atgcccctgc cacagtgtgt 660

ggccctaaaa agagcaccaa cctggtaaag aacaaatgtg tcaattttaa tttcaatggc 720

cttactggca ctggagtgct aacagagtcc aataagaagt tcctaccttt tcaacagttt 780

ggcagagata ttgctgacac cactgatgct gtgagagatc ctcaaaccct ggagatctta 840

gacatcaccc cctgcagctt tggaggagtg tctgtgataa ctcctggcac tgtggaaaag 900

ggcatttacc aaacctccaa cttcagagtg caacccacag agagcattgt gagatttccc 960

aatattacca acctttgccc ttttggtgaa gtgtttaatg ccacaagatt tgcctctgtg 1020

tatgcctgga atagaaagag aatcagcaac tgtgtagctg actactctgt tttgtataat 1080

tcagcttcat tctcaacctt caagtgttat ggagtgtccc ctaccaagct aaatgattta 1140

tgctttacca atgtctatgc tgatagcttt gtgatcagag gtgatgaggt tagacaaatt 1200

gcccctggac agactggcaa gattgctgac tacaattata aactgcctga tgacttcact 1260

ggctgtgtta tagcctggaa cagcaacaac ctggacagta aggttggagg caactacaac 1320

tatctgtata ggctgtttag aaagagcaat ctaaagccat ttgagagaga catatcaaca 1380

gagatctatc aagctggcag caccccttgc aatggagtgg agggatttaa ctgctatttc 1440

ccacttcaga gttatggctt tcagcctaca aatggagtgg gatatcagcc ttatagagtg 1500

gttgtattat catttgagct actgcatgcc cctgcaacag tttgtgggcc taaaaaaagc 1560

actaatctgg tgaaaaacaa gtgtgtgaat ttcaacttta atggcctgac tggcactgga 1620

gtcctgacag agagcaataa gaagtttcta ccttttcagc aatttggcag agatattgct 1680

gacaccactg atgctgtgag agaccctcag acactggaaa tcctggacat aaccccttgt 1740

tcttttggag gagtgtctgt gatcactcct ggcacagtgg agaagggcat atatcagaca 1800

agcaacttca gagtgcagcc tacagagagc attgtgagat tccctaacat caccaacctg 1860

tgcccttttg gagaggtgtt caatgccaca agatttgcct ctgtgtatgc ctggaataga 1920

aagagaatca gcaactgtgt ggctgactac tctgtgctgt acaactctgc tagcttcagc 1980

accttcaagt gctatggagt gagccctacc aagctgaatg acctgtgctt caccaatgtg 2040

tatgctgaca gctttgtgat cagaggagat gaggtgagac agattgcccc tggacagact 2100

ggcaagattg ctgactacaa ctacaagctg cctgatgact tcactggctg tgtgattgcc 2160

tggaacagca acaacctgga cagcaaggtg ggaggcaact acaactacct gtacagactg 2220

ttcagaaaga gcaacctgaa gccttttgag agagacatca gcacagagat ctaccaagct 2280

ggcagcaccc cttgcaatgg agtggagggc ttcaactgct acttccctct gcagagctat 2340

ggctttcagc ctaccaatgg agtgggctat cagccttaca gagtggtggt gctgagcttt 2400

gagctgctgc atgcccctgc cacagtgtgt ggccctaaaa agagcaccaa cctggtgaag 2460

aacaagtgtg tgaacttcaa cttcaatggc ctgactggca ctggagtgct gacagagagc 2520

aacaagaagt tcctgccttt tcagcagttt ggcagagaca ttgctgacac cacagatgct 2580

gtgagagacc ctcagaccct ggagatcctg gacatcaccc cttgcagctt tggaggagtg 2640

tctgtgatca cccctggcac ctga 2664

<210> 3

<211> 439

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 3

Met Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr

1 5 10 15

Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser

20 25 30

Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr

35 40 45

Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly

50 55 60

Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly

85 90 95

Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe

100 105 110

Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val

115 120 125

Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu

130 135 140

Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser

145 150 155 160

Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln

165 170 175

Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg

180 185 190

Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys

195 200 205

Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Arg Val Gln Pro

210 215 220

Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe

225 230 235 240

Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn

245 250 255

Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn

260 265 270

Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys

275 280 285

Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile

290 295 300

Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile

305 310 315 320

Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile

325 330 335

Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn

340 345 350

Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg

355 360 365

Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly

370 375 380

Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln

385 390 395 400

Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser

405 410 415

Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser

420 425 430

Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys

435

<210> 4

<211> 1320

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 4

atgagagtgc agcccacaga gtcaattgtg agattcccca atatcactaa cctgtgcccc 60

tttggggagg tgttcaatgc cacaagattt gcttctgtgt atgcctggaa tagaaagaga 120

atcagtaact gtgttgctga ctactctgtg ctgtacaatt ctgcctcttt cagcacattc 180

aaatgttatg gggttagccc caccaaacta aatgacctgt gcttcaccaa tgtgtatgct 240

gacagctttg tgatcagagg tgatgaagtg agacaaattg cccctgggca gactggcaag 300

atagctgact acaattacaa gctgcctgat gactttactg gctgtgtgat tgcctggaat 360

agcaataacc tggacagcaa ggtggggggc aactataact acctatacag attgtttaga 420

aagtccaatt tgaaaccctt tgagagagat atcagcactg agatctatca agctggcagc 480

accccctgta atggggtgga ggggttcaac tgctatttcc ccttacagag ctatggcttt 540

cagcccacca atggggtggg ctatcagccc tacagagtgg tggtgctgtc ttttgaacta 600

cttcatgccc ctgccacagt gtgtggcccc aaaaaaagca caaacctggt gaaaaacaag 660

agagtgcagc caacagagag cattgtgaga ttccctaaca taaccaatct gtgtcccttt 720

ggtgaggttt ttaatgctac tagatttgcc tctgtgtatg cctggaacag aaaaagaatc 780

tcaaactgtg tggctgacta ttcagtcctc tacaactcag ctagctttag caccttcaaa 840

tgctatggtg tcagtcccac caaactgaat gacctttgtt tcaccaatgt ctatgctgac 900

agctttgtga tcagagggga tgaagtgaga caaatagccc ctgggcagac tggcaagata 960

gctgattaca actataaact gcctgatgat ttcactggct gtgtcattgc ctggaactca 1020

aataatctag acagcaaggt aggtggcaat tataactacc tctataggct gtttaggaaa 1080

agtaacctga aaccctttga gagagacatt agcacagaga tttatcaagc tggctcaaca 1140

ccctgtaatg gtgtggaggg ctttaactgc tacttccccc tgcagagcta tggctttcag 1200

ccaaccaatg gagtgggcta tcagccctat agagtagttg tgctgagctt tgagctgctg 1260

catgcccctg ccacagtgtg tggccctaag aaaagcacca acttggtcaa aaataagtga 1320

Claims

1.一种重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白，其特征在于，所述三聚体蛋白由三聚体形式的新型冠状病毒S蛋白RBD区第308～603位氨基酸片段构成。

2.根据权利要求1所述的重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白，其特征在于，所述三聚体蛋白的一级结构为三个所述氨基酸片段按照N末端至C末端的顺序连接；

优选地，所述重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示或与其具有95％以上同源性的序列。

3.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含如权利要求1或2中所述的重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包含选自信号肽、标签或免疫增强肽中的一种或几种。

5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码如权利要求1或2所述的重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白，或编码如权利要求3或4所述的融合蛋白的核苷酸序列；

优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID No.2所示或与其具有95％以上同源性的序列。

6.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求5所述的核酸分子。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求5所述的核酸分子或如权利要求6所述的载体；

优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；

更优选地，所述宿主细胞为CHO细胞。

8.如权利要求1或2所述的重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白或如权利要求3或4所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤A)制备如权利要求5所述的核酸分子，构建如权利要求6所述的表达载体，将表达载体转化或转染至如权利要求7所述的宿主细胞内；

步骤B)利用步骤A)的产物进行蛋白质表达；

步骤C)纯化步骤B)中获得的表达产物，得到所述重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白或融合蛋白。

9.如权利要求1或2所述的重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白、如权利要求3或4所述的融合蛋白、如权利要求5所述的核酸分子、如权利要求6所述的载体或如权利要求7所述的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防新型冠状病毒感染和/或新型冠状病毒引起的疾病的药物中的用途。

10.一种重组蛋白疫苗，其特征在于，所述疫苗包含如权利要求1或2所述的重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白或如权利要求3或4所述的融合蛋白，以及佐剂。

11.根据权利要求10所述的重组蛋白疫苗，其特征在于，所述佐剂为氢氧化铝、磷酸铝、MF59或CpG；

优选地，所述佐剂为氢氧化铝。

12.如权利要求10或11所述的重组蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，将纯化所得的所述重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白或所述融合蛋白与所述佐剂混合。

13.一种基因工程载体疫苗，其特征在于，所述基因工程载体疫苗包含如权利要求5所述的核酸分子。

14.一种核酸疫苗，其特征在于，所述核酸疫苗包含编码如权利要求1或2所述的重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白，或编码如权利要求3或4所述的融合蛋白的核苷酸序列。

15.如权利要求10、11、13或14所述的疫苗在治疗和/或预防新型冠状病毒感染和/或新型冠状病毒引起的疾病中的用途。

16.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求10、13或14所述的疫苗，以及药学上可接受的载体。

17.一种引发受试者针对新型冠状病毒的免疫应答或治疗受试者的新型冠状病毒感染的方法，其特征在于，向所述受试者施用有效剂量的如权利要求10、13或14所述的疫苗或如权利要求16所述的药物组合物。