CN108503696A

CN108503696A - 一种酵母细胞表达的寨卡病毒亚单位疫苗

Info

Publication number: CN108503696A
Application number: CN201710108477.5A
Authority: CN
Inventors: 黄忠; 张伟; 屈攀科; 刘庆伟
Original assignee: Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Immunology and Infection, Chinese Academy of Sciences
Priority date: 2017-02-27
Filing date: 2017-02-27
Publication date: 2018-09-07
Anticipated expiration: 2037-02-27
Also published as: CN108503696B

Abstract

本发明提供了一种酵母细胞表达的寨卡病毒亚单位疫苗，具体地本发明公开了利用酵母细胞研发的亚单位寨卡病毒疫苗具有产量高、纯度高、稳定性好、易于纯化的优点，同时因为不含病毒核酸成分，所以不存在恢复突变的可能性，安全较高。

Description

一种酵母细胞表达的寨卡病毒亚单位疫苗

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及酵母细胞表达的寨卡病毒亚单位疫苗。

背景技术

寨卡病毒在生物学分类上属黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，该属病毒为单正链RNA病毒。寨卡病毒自从1947年首次在乌干达寨卡森林猕猴中分离，一直到2013年才被注意到，人们发现格林巴列综合症的爆发与法属玻利尼西亚寨卡病毒的流行相关。寨卡病毒主要通过伊蚊叮咬传播，尽管大多感染是没有症状的，但发现越来越多的小头症病例与母亲怀孕期间感染寨卡病毒相关，在小头症胎儿羊水和脑组织中分离出的寨卡病毒进一步确认了两者的关系。寨卡病毒的爆发对全球公共健康构成了严重威胁。

因此，为了有效地、有针对性地预防和/或治疗寨卡病毒感染，本领域迫切需要开发寨卡病毒疫苗及其合适的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种寨卡病毒亚单位疫苗,其制备方法及其应用。

本发明的第一方面，提供了一种抗原肽，所述抗原肽衍生自寨卡病毒包膜蛋白，并且选自下组：

(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个(≤20个，如2-10个，优选为2-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽，且所述衍生多肽具有抑制寨卡病毒感染细胞的功能和/或诱发针对寨卡病毒的免疫反应的功能。

在另一优选例中，所述抗原肽为酵母细胞表达的重组蛋白。

本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第一方面的抗原肽。

在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.1所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.3所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.3所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸；

(d)如SEQ ID NO.3所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。

本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的表达载体，或者在基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括酵母、果蝇S2细胞、大肠杆菌、CHO细胞、DC细胞等。

本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，所述的组合物含有本发明第一方面所述的抗原肽、本发明第二方面所述的多核苷酸或者本发明第三方面所述的表达载体或者本发明第四方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或辅料。

在另一优选例中，所述的组合物为疫苗。

本发明的第六方面，提供了一种疫苗组合物，所述的组合物含有本发明第一方面所述的抗原肽、本发明第二方面所述的多核苷酸或者本发明三方面所述的表达载体或者本发明第四方面所述的宿主细胞，以及免疫学上可接受的载体和/或辅料。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。

在另一优选例中，所述的佐剂包括氧化铝、皂苷、quil A、胞壁酰二肽、矿物油或植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、细胞因子(包括IL-1、IL-2、IFN-r、GM-CSF、IL-6、IL-12、和CpG)。

本发明的第七方面，提供了如本发明第一方面所述的抗原肽的用途，(a)用于制备针对寨卡病毒的抗体；和/或(b)用于制备治疗和/或预防与寨卡病毒相关的疾病的药物。

在另一优选例中，所述的与寨卡病毒相关的疾病包括：寨卡病毒感染、格林巴列综合症、小头症等。

本发明的第八方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的抗原肽的方法，包括步骤：

(i)在适宜条件下培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达本发明第一方面所述的抗原肽；

(ii)纯化所述抗原肽。

在另一优选例中，所述方法步骤(i)中将转化的酵母单菌落分别接种到BMGY培养基中，培养后离心去除上清，用BMMY(含有1％甲醇)培养基重悬菌体，25-35℃(优选为30℃)，诱导培养24-72小时(优选为48小时)。

本发明的第九方面，提供了一种治疗方法，给需要的对象施用本发明第一方面所述的抗原肽、第二方面所述的多核苷酸或者本发明第三方面所述的表达载体或者本发明第四方面所述的宿主细胞或本发明第五方面所述的药物组合物或本发明第六方面所述的的疫苗组合物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了pPinkα-HC-ZIKV-EDⅢ和pPinkα-HC-ZIKV-E80质粒图谱。

图2显示了小量筛选毕赤酵母高表达株。(A)不同克隆的培养基部分取5ul 样品SDS-PAGE跑胶，Western-blot检测目的蛋白，目的蛋白(ZIKA-EDⅢ与His-tag融合)大小12.74KDa。(B)不同克隆的培养基部分取10ul样品SDS-PAGE跑胶，Western-blot检测目的蛋白，目的蛋白(ZIKA-E80与His-tag融合)大小45.39KDa。对照(ctr)为电转线性化的pPinkα-HC得到的克隆。

图3显示了ZIKA-EDⅢ在毕赤酵母中的表达和纯化。(A)纯化的ZIKA-EDⅢ的SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析。(B)使用抗ZIKV-E80(左)和抗His标签(右)的抗体进行Western-blot检测。

图4显示了ZIKA-EDⅢ抑制ZIKA病毒对Vero细胞的感染。纯化的ZIKA-EDⅢ进行一系列稀释后分别与100PFU的ZIKA病毒混合均匀,立即添加到预先铺好的Vero细胞上，在37度CO2培养箱中培养一个小时，之后将ZIKA-EDⅢ和ZIKA病毒的混合物置换为含0.2％琼脂糖的2％DMEM培养基，放置在37度CO2培养箱中培养，噬斑形成后使用4％多聚甲醛固定和结晶紫染色。BSA作为阴性对照。(A)在用ZIKA-EDⅢ处理的细胞相比用BSA处理的细胞噬斑数目的减少。(B)标准化空斑减少数的定量分析。平均值±标准误已经标出。

图5显示了在balb/c小鼠中ZIKA-EDⅢ诱发中和性抗体。(A)ZIKA-EDⅢ免疫balb/c小鼠。小鼠血清分别在二免后两周和三免后两周进行收集，在1:10000稀释度下，ELISA检测ZIKA-EDⅢ特异性的抗体反应。(B)三免后两周血清的噬斑减少中和实验，24孔板结晶紫染色部分显示出来。(C)PRNT50s的数据分析。PRNT50s的几何平均值和p值如图所示。

图6显示了EDIII抗血清具有预防ZIKV感染的体内保护作用。设置两组五周龄AG6小鼠，每组五只。抗血清50ul/只与等体积的含5PFU病毒稀释液混匀，37度孵育一个小时。然后腹腔注射血清病毒混合物，连续两周记录体重变化和生存率情况。小鼠体重减少超过原始体重20％进行安乐死，定义为死亡，不再记录当天体重。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，意外地发现利用酵母细胞研发的亚单位寨卡病毒疫苗具有产量高、纯度高、稳定性好、易于纯化的优点，同时因为不含病毒核酸成分，所以不存在恢复突变的可能性，安全较高。而且，实验发现结合铝佐剂，用很低剂量的免疫原(ZIKV EDIII)诱导产生的中和抗体就足以保护AG6小鼠免于致死剂量寨卡病毒的攻击。体内体外实验结果均表明本发明提供的寨卡病毒亚单位疫苗ZIKV EDIII是一个预防寨卡病毒感染的比较好的疫苗，具有显著较佳的保护效果。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

寨卡病毒包膜蛋白

寨卡病毒的包膜蛋白(E蛋白)是中和抗体的主要靶标，而E蛋白分为三个区域，EDI、EDII、EDIII，大多数特异性抗体或部分交叉反应的中和抗体，主要识别EDIII上的表位。本发明中E80蛋白是寨卡病毒包膜蛋白N端80％区域,是E蛋白胞外区段，负责与细胞受体的结合，是zika病毒的主要抗原表位，且本发明人发现截去E蛋白C端20％区域有利于E蛋白的分泌。本发明主要目标是研发出一种能诱导机体产生靶向E蛋白(E80和EDIII)中和抗体的疫苗，用于预防寨卡病毒的感染。

本发明提供了一种衍生自寨卡病毒包膜蛋白的抗原肽，优选地，用于本发明的寨卡病毒包膜蛋白源自寨卡病毒亚洲型2015年南美流行的Z1106033株(病毒的氨基酸Genbank：ALX35659，毒株核苷酸GenBank:KU312312)。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述包膜蛋白(E蛋白)的氨基酸序列如下所示：

IRCIGVSNRDFVEGMSGGTWVDVVLEHGGCVTVMAQDKPTVDIELVTTTVSNMAEVRSYCYEASISDMASDSRCPTQGEAYLDKQSDTQYVCKRTLVDRGWGNGCGLFGKGSLVTCAKFACSKKMTGKSIQPENLEYRIMLSVHGSQHSGMIVNDTGHETDENRAKVEITPNSPRAEATLGGFGSLGLDCEPRTGLDFSDLYYLTMNNKHWLVHKEWFHDIPLPWHAGADTGTPHWNNKEALVEFKDAHAKRQTVVVLGSQEGAVHTALAGALEAEMDGAKGRLSSGHLKCRLKMDKLRLKGVSYSLCTAAFTFTKIPAETLHGTVTVEVQYAGTDGPCKVPAQMAVDMQTLTPVGRLITANPVITESTENSKMMLELDPPFGDSYIVIGVGEKKITHHWHRSGSTIGKAFEATVRGAKRMAVLGDTAWDFGSVGGALNSLGKGIHQIFGAAFKSLFGGMSWFSQILIGTLLMWLGLNAKNGSISLMCLALGGVLIFLSTAVSA，SEQID NO.1。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述抗原肽包括ZIKV E80蛋白，其氨基酸序列如下：

IRCIGVSNRDFVEGMSGGTWVDVVLEHGGCVTVMAQDKPTVDIELVTTTVSNMAEVRSYCYEASISDMASDSRCPTQGEAYLDKQSDTQYVCKRTLVDRGWGNGCGLFGKGSLVTCAKFACSKKMTGKSIQPENLEYRIMLSVHGSQHSGMIVNDTGHETDENRAKVEITPNSPRAEATLGGFGSLGLDCEPRTGLDFSDLYYLTMNNKHWLVHKEWFHDIPLPWHAGADTGTPHWNNKEALVEFKDAHAKRQTVVVLGSQEGAVHTALAGALEAEMDGAKGRLSSGHLKCRLKMDKLRLKGVSYSLCTAAFTFTKIPAETLHGTVTVEVQYAGTDGPCKVPAQMAVDMQTLTPVGRLITANPVITESTENSKMMLELDPPFGDSYIVIGVGEKKITHHWHRSGSTIGK，SEQ ID NO.2。

在本发明的另一个优选地实施方式中，所述抗原肽包括ZIKV EDIII蛋白，其氨基酸序列如下：

KLRLKGVSYSLCTAAFTFTKIPAETLHGTVTVEVQYAGTDGPCKVPAQMAVDMQTLTPVGRLITANPVITESTENSKMMLELDPPFGDSYIVIGVGEKKITHHWHRSGST，SEQ ID NO.3。

编码抗原肽基因序列的优化

在本发明中，提供了优化的、适合在酵母细胞中表达的本发明抗原肽的核酸编码序列。

本发明人根据偏好密码子，在不改变其氨基酸序列的前提下对编码E蛋白的DNA序列进行了优化。然而，本发明人发现，仅依据密码子频率获得的优化序列并不完全适合在宿主细胞中表达。因此本发明人进行了二次优化，其中包括针对序列的GC含量进行了调整和优化，消除了原始序列中GC含量较高的区域；针对原始序列中的重复序列和顺式作用因子等复杂结构(GGGGGG、GGTAAG)进行优化；根据偏好性针对原核苷酸中存在的稀有密码子(AGG、CGG、GGG、ACG)进行了优化。

经过大量测试和筛选，本发明人在众多优化序列中获得了一个特别优化的E蛋白编码序列，其多核苷酸序列如下所示：

atccgctgcatcggcgtgtcgaatcgcgatttcgtggagggaatgagcggaggaacctgggtggacgtggtgctggagcacggaggatgcgtgaccgtgatggcccaggataagccgaccgtggacatcgagctggtgaccaccaccgtgtcgaacatggccgaggtgcgcagctactgctacgaggcctcgatcagcgatatggcctccgactcgcgctgcccaacccagggcgaggcctacctggataagcagagcgacacccagtacgtgtgcaagcgcaccctggtggatcgcggatggggaaatggatgcggactgttcggcaagggatccctggtgacctgcgccaagttcgcctgctccaagaagatgaccggcaagtcgatccagccagagaacctggagtaccgcatcatgctgtcggtgcacggaagccagcactccggcatgatcgtgaacgataccggccacgagaccgacgagaatcgcgccaaggtggagatcaccccgaactccccacgcgccgaggccaccctgggaggattcggatcgctgggcctggattgcgagccacgcaccggcctggatttctccgacctgtactacctgaccatgaacaataagcactggctggtgcacaaggagtggttccacgatatcccactgccctggcacgccggagccgacaccggaaccccacactggaacaataaggaggccctggtggagttcaaggacgcccacgccaagcgccagaccgtggtggtgctgggaagccaggagggagccgtgcacaccgccctggccggagccctggaggccgagatggatggagccaagggacgcctgagctccggacacctgaagtgccgcctgaagatggacaagctgcgcctgaagggcgtgagctactccctgtgcaccgccgccttcaccttcaccaagatcccagccgagaccctgcacggaaccgtgaccgtggaggtgcagtacgccggaaccgatggaccatgcaaggtgccagcccagatggccgtggacatgcagaccctgaccccagtgggacgcctgatcaccgccaatcccgtgatcaccgagtccaccgagaactcgaagatgatgctggagctggatcccccgttcggcgacagctacatcgtgatcggcgtgggcgagaagaagatcacccaccactggcaccgctcgggaagcaccatcggcaaggccttcgaggccaccgtgcgcggagccaagcgcatggccgtgctgggcgataccgcctgggacttcggaagcgtgggaggagccctgaacagcctgggcaagggcatccaccagatcttcggagccgccttcaagtccctgttcggaggcatgtcgtggttcagccagatcctgatcggcaccctgctgatgtggctgggcctgaacgccaagaatggctccatctcgctgatgtgcctggccctgggaggagtgctgatcttcctgagcaccgccgtgtccgcctaa，SEQ ID NO.4；该序列编码SEQ ID NO.1所示的E蛋白。

根据上述经优化的DNA序列，编码E80的DNA序列如下：

atccgctgcatcggcgtgtcgaatcgcgatttcgtggagggaatgagcggaggaacctgggtggacgtggtgctggagcacggaggatgcgtgaccgtgatggcccaggataagccgaccgtggacatcgagctggtgaccaccaccgtgtcgaacatggccgaggtgcgcagctactgctacgaggcctcgatcagcgatatggcctccgactcgcgctgcccaacccagggcgaggcctacctggataagcagagcgacacccagtacgtgtgcaagcgcaccctggtggatcgcggatggggaaatggatgcggactgttcggcaagggatccctggtgacctgcgccaagttcgcctgctccaagaagatgaccggcaagtcgatccagccagagaacctggagtaccgcatcatgctgtcggtgcacggaagccagcactccggcatgatcgtgaacgataccggccacgagaccgacgagaatcgcgccaaggtggagatcaccccgaactccccacgcgccgaggccaccctgggaggattcggatcgctgggcctggattgcgagccacgcaccggcctggatttctccgacctgtactacctgaccatgaacaataagcactggctggtgcacaaggagtggttccacgatatcccactgccctggcacgccggagccgacaccggaaccccacactggaacaataaggaggccctggtggagttcaaggacgcccacgccaagcgccagaccgtggtggtgctgggaagccaggagggagccgtgcacaccgccctggccggagccctggaggccgagatggatggagccaagggacgcctgagctccggacacctgaagtgccgcctgaagatggacaagctgcgcctgaagggcgtgagctactccctgtgcaccgccgccttcaccttcaccaagatcccagccgagaccctgcacggaaccgtgaccgtggaggtgcagtacgccggaaccgatggaccatgcaaggtgccagcccagatggccgtggacatgcagaccctgaccccagtgggacgcctgatcaccgccaatcccgtgatcaccgagtccaccgagaactcgaagatgatgctggagctggatcccccgttcggcgacagctacatcgtgatcggcgtgggcgagaagaagatcacccaccactggcaccgctcgggaagcaccatcggcaag，SEQ ID NO.5；

编码EDIII蛋白的DNA序列如下：

aagctgcgcctgaagggcgtgagctactccctgtgcaccgccgccttcaccttcaccaagatcccagccgagaccctgcacggaaccgtgaccgtggaggtgcagtacgccggaaccgatggaccatgcaaggtgccagcccagatggccgtggacatgcagaccctgaccccagtgggacgcctgatcaccgccaatcccgtgatcaccgagtccaccgagaactcgaagatgatgctggagctggatcccccgttcggcgacagctacatcgtgatcggcgtgggcgagaagaagatcacccaccactggcaccgctcgggaagcacc，SEQ ID NO.6。

载体和宿主细胞

本发明还提供了一种包含本发明的优化的抗原肽编码序列的载体，以及含所述载体的宿主细胞。

在本发明的一个优选例中，所述载体具有表达所述抗原肽基因的表达盒，所述表达盒从5’-3’依次具有下述元件：启动子，抗原肽基因，和终止子。

本领域的普通技术人员可以使用的常规方法获得所述抗原肽的上述优化基因序列，例如全人工合成或PCR法合成。一种优选的合成法为不对称PCR法。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明的多核苷酸序列可以通过常规的重组DNA技术，表达或生产目的蛋白(抗原肽)，包括步骤：

(1)用编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞，较佳地为酵母或果蝇S2细胞；

(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体，优选市售的载体如pPinkαHC或pMT/BiP/V5-HisA。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

包含上述DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，表达目的蛋白。能够表达本发明抗原肽的宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌；或是低等真核细胞，如酵母细胞(毕赤酵母、酿酒酵母)；或是高等真核细胞，如昆虫细胞；优选为酵母细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。工程细胞可以是快速利用甲醇型(Mut⁺)或慢速利用甲醇型(Mut^s)。

工程细胞的培养和目的蛋白发酵生产

在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞，表达本发明的基因序列所编码的蛋白。根据宿主细胞的不同，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在本发明中，可采用常规的发酵条件。代表性的条件包括(但并不限于)：

(a)就温度而言，本发明的抗原肽的发酵及诱导温度保持在28-30℃；

(b)就诱导期的pH值而言，诱导期pH控制在3-9；

(c)就溶氧(DO)而言，DO控制在20-90％，溶氧的维持可以用氧气/空气混合气体的通入来解决；

(d)就补料而言，补料种类宜包括甘油、甲醇、葡萄糖等碳源，可单独补料或混合补料。

工程细胞表达目的蛋白可以采用层析技术进行纯化。层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析等技术。常用的层析方法包括：

1.阴离子交换层析

阴离子交换层析介质包括(但不限于)：Q-Sepharose、DEAE-Sepharose。如果发酵样品的盐浓度较高，影响与离子交换介质的结合，则在进行离子交换层析前需降低盐浓度。样品可以用稀释、超滤、透析、凝胶过滤层析等手段进行平衡缓冲液的更换，直至与对应的离子交换柱平衡液***相似，然后上样，进行盐浓度或pH的梯度洗脱。

2.疏水层析

疏水层析介质包括(但不限于)：Phenyl-Sepharose、Butyl-Sepharose、Octyle-Sepharose。样品通过添加NaCl、(NH₄)₂SO₄等方式提高盐浓度，然后上样，通过降低盐浓度方法洗脱。通过疏水层析除去疏水性有较大差异的杂蛋白。

3.凝胶过滤层析

疏水层析介质包括(但不限于)：Sephacryl、Superdex、Sephadex类。通过凝胶过滤层析更换缓冲体系，或进一步精纯。

4.亲和层析

亲和层析介质包括(但不限于)：HiTrap^TM Heparin HP Columns。

制备疫苗组合物

本发明还提供了一种制备疫苗组合物的方法，具体地，包括步骤：

将本发明制备的抗原肽与药学上可接受的疫苗佐剂混合，从而形成疫苗组合物。

在另一优选例中，所述的佐剂为铝佐剂、GLA佐剂，较佳的GLA佐剂。

组合物和施用方法

本发明还提供了一种组合物，所述组合物含有：(i)用本发明方法制备的重组抗原肽，以及(ii)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。本发明的组合物可以是单价的，也可以是多价的。

本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型，其中包括(但并不限于)：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。

(i)药物组合物

本发明的药物组合物包括有效量的用本发明方法制备的抗原肽，所述抗原肽可以是单价的，也可以是多价的。

本文所用的术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.2微克/千克至2微克/千克。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如抗原肽或其它治疗剂)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。

组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。

(ii)疫苗组合物

本发明的疫苗组合物可以是预防性的(即预防感染)，也可以是治疗性的。所述的疫苗组合物包含免疫性抗原(包括本发明蛋白或自组装的病毒样颗粒)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，抗原也可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。

增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方，例如，(a)MF59(参见WO 90/14837)，(b)SAF，和(c)Ribi^TM佐剂***(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，(3)皂素佐剂；(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如霍乱毒素CT，百日咳毒素PT或大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体，参见例如WO93/13302和WO92/19265；以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。

包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如，可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。

更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫***合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。

通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。

(iii)给药途径和剂量

所述组合物可以直接给予对象。对象可以是人或非人哺乳动物，较佳地为人。当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的病毒样颗粒直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。

给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于)：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、***内、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要，可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。

应以“有效量”给予病毒样颗粒疫苗，即病毒样颗粒的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗寨卡病毒感染。

在各疫苗剂份中所选用的病毒样颗粒的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂的疫苗足以含有约1μg-1000μg，较佳地为1μg-100μg，更佳地10μg-50μg蛋白质或VLP。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。优选方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明的抗原肽能够在酵母细胞中大量表达，因此制备成本低，适合工业化应用；

(2)本发明对寨卡病毒E蛋白的基因进行重新设计和序列优化，经优化的基因序列在宿主细胞内表达量高、稳定性好、适合高密度发酵；

(3)使用本发明的抗原肽EDIII免疫小鼠后，免疫的小鼠产生较强的免疫反应，结合铝佐剂，用低剂量的免疫原ZIKV EDIII诱导的抗体就足以保护AG6小鼠免于致死剂量寨卡病毒的攻击；

(4)本发明与传统的减毒活疫苗、DNA疫苗以及灭活疫苗相比，该候选疫苗因不具有病毒核酸，所以非常安全。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

材料和方法

1.细胞

Vero细胞用含10％牛血清的DMEM培养基进行培养。PichiaPink^TM酵母菌株购于美国Invitrogen公司，并按照厂家说明书进行培养。

2.病毒

本研究中用到的寨卡毒株为亚洲型ZIKV/SZ-WIV01株(GenBank:KU963796)，来自中国科学院武汉病毒研究所微生物菌毒种保藏中心(病毒保藏号：IVCAS 6.6110)。

3.抗体

抗His tag的抗体为Proteintech的HRP标记的单克隆抗体，抗ZIKV-E80的抗体本实验室利用昆虫细胞表达的E80蛋白免疫实验兔获得的多克隆抗体。

4.质粒构建

根据寨卡病毒亚洲型2015年南美洲流行的Z1106033株(病毒核苷酸GenBank:KU312312，氨基酸Genbank：ALX35659)的E蛋白编码序列(SEQ ID NO.1)，进行密码子优化及基因合成(SEQ ID NO.4)，并进一步克隆到载体pUC57((购自GenScript USA Inc.)上，获得质粒pZIKV-E。

利用引物(ZIKV-ED3-F:AAGCTGCGCCTGAAGGGC(SEQ ID NO.7)及ZIKV-ED3-KpnI-R:CAACGGTACCTTAATGGTGATGGTGATGATGGGTGCTTCCCGAGCGGTG(SEQ ID NO.8))从基因优化的质粒pZIKV-E上PCR扩增EDⅢ基因，所获得PCR产物用KpnⅠ单酶切后产生一端为平末端而另一端为粘性末端的片段，克隆到Stu Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切的pPinkα-HC(Invitrogen)载体上，得到质粒pPinkα-HC-ZIKV-EDⅢ。

类似地，利用引物(ZIKV-E80-F:ATCCGCTGCATCGGCGTGTCGAAT(SEQ ID NO.9)及ZIKV-E80-KpnI-R:CAACGGTACCTTAATGGTGATGGTGATGATGCTTGCCGATGGTGCTTCC(SEQ IDNO.10))从质粒pZIKV-E中PCR扩增E80片段，并克隆到pPinkα-HC(Invitrogen)载体上，得到质粒pPinkα-HC-ZIKV-E80。

5毕赤酵母转化和菌株表达量检测

为了转化毕赤酵母，质粒pPinkα-HC-ZIKV-EDⅢ和pPinkα-HC-ZIKV-E80用EcoNⅠ线性化，然后电转入PichiaPink^TM Strain 1(Invitrogen)。毕赤酵母的转化和随后的转化子的筛选根据厂家说明书进行操作。根据说明书进行了小量培养表达筛选实验。简单来说，转化的酵母单菌落分别接种到5ml BMGY培养基中，30℃250rpm培养24hr，然后离心去除上清，用1ml BMMY(含有1％甲醇)培养基重悬菌体，30℃250rpm诱导培养48hr。诱导结束后，离心收集培养基上清，取上清适量进行Western blotting检测，具体方法如之前文章所述。

6.ZIKV-EDⅢ蛋白的制备

为了制备ZIKV-EDⅢ抗原，对选定的菌株进行培养和诱导。离心收集培养基上清，首先使用0.45uM的滤膜过滤，然后使用3KDa的超滤管进行超滤浓缩，浓缩后的样品用Binding buffer从超滤管中洗下来，使用镍柱进行纯化。最后对纯化的蛋白进行考马斯亮蓝染色和Western-blot检测。

7.EDⅢ体外抑制病毒感染试验

为了验证表达的ZIKV-EDⅢ构象是否正确，本发明人开展EDⅢ体外抑制病毒感染试验。简单来说，就是将表达ZIKV-EDⅢ以200ug/ml的浓度为起点依次5倍稀释共五个稀释度，100ul稀释后的ZIKV-EDⅢ溶液与100ul的ZIKV病毒(100PFU)混匀，将200ul的混合物加到铺有Vero细胞的24孔板的一个孔中，37度CO₂培养箱孵育1h后吸掉混合液，每孔加入700ul含0.2％琼脂糖的2％FBS的DMEM，四度放置15分钟，最后将24孔板转移至37度CO₂培养箱培养，3-4天后使用4％多聚甲醛固定细胞，0.1％结晶紫染色。

8.小鼠免疫及疫苗特异性抗体检测

将纯化的EDⅢ蛋白与(Invivogen，美国)佐剂相混合，做成试验性疫苗，每个剂量含有10ug抗原(EDⅢ)和500ug的氢氧化铝佐剂。将PBS与佐剂混合作为阴性对照。Balb/c小鼠(每组六只，6-8周龄)购买自上海实验动物中心(SLAC)公司，在第0周、2周和4周腹腔注射试验性疫苗或PBS阴性对照，然后在第4周和第6周采血，用于抗体检测。

ZIKV-EDⅢ特异性抗体的测定方法如下：用酵母表达的ZIKV-EDⅢ包被ELISA板(50ng/孔)，之后的每步操作后都需要用PBST洗板三次以除去非特异性结合，用5％脱脂奶粉封闭后，每孔加50ul的1:10000稀释血清，然后加HRP偶联的羊抗鼠IgG(sigma)作为二抗，TMB显色液显色，1N磷酸溶液终止，测定0D450。

9.病毒微中和试验

病毒微中和实验操作如下：实验前一天24孔培养板铺Vero细胞，每孔铺10⁵细胞；第二天做中和实验，首先在1.5mlEP管中将100μl含有100PFU的ZIKA病毒液与100μl梯度稀释的血清混合，37℃孵育1h；然后将24孔板中培养基吸掉，用无血清DMEM清洗一遍，在24孔板中每孔加入200μl病毒血清混合液，37℃的CO₂培养箱培养1h后吸掉混合液，每孔加入700ul含0.2％琼脂糖的2％FBS的DMEM，四度放置15分钟，最后将24孔板转移至37度CO₂培养箱培养，3-4天后使用4％多聚甲醛固定细胞，0.1％结晶紫染色。血清样本的中和滴度被定义为相比只加病毒孔，能够抑制50％空斑数所对应的最高血清稀释度(PRNT50)。

10.小鼠攻毒保护试验

攻毒保护试验在I型和II型干扰素受体双敲的AG6小鼠上进行。分别将三免后两周采集的EDⅢ组或PBS组抗血清分别与ZIKV/SZ-WIV01病毒等体积混匀，每100ul混合物含50ul抗血清及5PFU寨卡病毒，然后在37度孵育1h。两组5周龄AG6小鼠(每组5只)分别腹腔注射100ul/只的EDⅢ或PBS抗血清-病毒混合液。攻毒前及攻毒后连续15天进行小鼠称重，并观察生存情况。

11.统计

所有的统计分析均使用GraghPad Prism版本5来进行。Kaplan–Meier生存曲线使用log-rank检验进行比较，其他实验数据均是使用two-tailed student’s t-test方法来分析。统计的显著性差异定义如下：ns，P≥0.05；*0.01≤P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

实施例1 ZIKV EDⅢ和E80在毕赤酵母中的表达及鉴定

为了探究寨卡病毒EDⅢ和E80在毕赤酵母中重组表达，本发明人构建了质粒pPinkα-HC-ZIKV-EDⅢ和质粒pPinkα-HC-ZIKV-E80，质粒结构如图1所示。质粒pPinkα-HC-ZIKV-EDⅢ用于分泌表达EDⅢ蛋白，其N-端融合α-淀粉酶分泌信号肽而C-端融合His tag。类似地，质粒pPinkα-HC-ZIKV-E80用于分泌表达E80蛋白，其N-端融合α-淀粉酶分泌信号肽而C-端融合His tag。

本发明人将质粒pPinkα-HC-ZIKV-EDⅢ和质粒pPinkα-HC-ZIKV-E80分别转化酵母细胞，得到的各重组酵母克隆用western-blot方法来检测EDⅢ和E80的表达量，空载体pPinkα-HC转化的酵母细胞作为阴性对照。结果显示，pPinkα-HC-ZIKV-EDⅢ转化酵母克隆均有非常强的抗His tag单抗检测信号(图2A)，提示EDⅢ在酵母中表达量很高；相反，pPinkα-HC-ZIKV-E80转化酵母克隆在预期分子量处只有微弱信号(图2B)，提示E80在酵母中的表达量较低。

分别挑选pPinkα-HC-ZIKV-EDⅢ的4号菌株和pPinkα-HC-ZIKV-E80的2号菌株作为高表达株进行大量表达纯化，所获得纯化产物用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色和Westernblotting进行分析鉴定。从pPinkα-HC-ZIKV-EDⅢ转化4号菌中纯化的蛋白在SDS-PAGE中呈现为约13KDa的条带(图3A)，与根据EDⅢ序列计算所得蛋白分子量一致；用鼠抗His tag抗体和兔抗ZIKV-E80抗体也分别在考马斯亮蓝染色蛋白条带处检测到阳性信号(图3B)，表明所纯化蛋白确实是EDⅢ，纯化后计算产量达到4.5mg/l。从pPinkα-HC-ZIKV-E80转化2号菌株中所纯化的蛋白很少，在SDS-PAGE中无清晰条带(data not shown)，可能是由于E80表达量低并存在降解情况。

以上结果表明E80在酵母中表达情况较差，不适合用于重组疫苗研发。而EDⅢ在酵母中正确、高效表达，具有极大的疫苗开发潜力。因此，后续研究集中于EDⅢ。

使用果蝇S2细胞表达上述ZIKV E80和ZIKV EDIII的实验结果表明，目的蛋白ZIKVE80虽然无法在酵母细胞中高效表达，确可以在果蝇S2细胞中成功表达。而，ZIKV EDIII在酵母中的表达量显著高于在果蝇S2细胞中的表达量，在酵母中的表达量达到了果蝇S2细胞(2.6mg/l)的1.7倍。

实施例2.EDⅢ在体外能够抑制ZIKV感染

将纯化的酵母表达EDⅢ与ZIKV病毒混和后接种Vero细胞，三天后观察噬斑数；对照组设置为BSA与ZIKV病毒混匀与Vero细胞孵育。结果显示，对照组随着BSA浓度降低，噬斑数无显著性差异，表明BSA不能抑制病毒感染；相反，EDⅢ处理组的噬斑数随EDⅢ浓度增加而逐渐减少(图4A)，表明EDⅢ能够剂量依赖性抑制病毒对细胞的感染(图4B)。根据抑制曲线计算得到了EDⅢ的50％抑制浓度(IC50)为7.597ug/ml。该结果提示，酵母表达EDⅢ的具有正确的功能性构象，能够与细胞表面的病毒受体结合，从而竞争性抑制病毒结合并进入细胞。

本实施例的实验结果表明，根据本发明的酵母表达的目的蛋白ZIKV EDIII对寨卡病毒感染的抑制活性IC₅₀为7.597ug/ml；而果蝇S2细胞表达的目的蛋白ZIKV EDIII对寨卡病毒感染的抑制活性IC₅₀为71.85ug/ml，二者相差了约10倍。

当然，本实施例的结果也表明ZIKV EDIII可以和寨卡病毒竞争进入细胞，因此具有诱导动物产生中和抗体的潜力。

实施例3.EDⅢ免疫小鼠产生高效价中和抗体

为了研究EDⅢ的免疫原性，2组(每组6只)Balb/c小鼠在第0周、第2周和第4周分别免疫EDⅢ或PBS，PBS为阴性对照组。血清样品在第4周和第6周收集，用毕赤酵母表达的EDⅢ作为包被抗原，进行ELISA试验来检测特异性抗体反应。如图5A所示，PBS组小鼠血清的抗原抗体反应为背景水平，而EDⅢ组小鼠的免疫血清均有明显的抗体反应，且三免后两周血清比二免后两周血清的抗体滴度要高。ELISA结果表明，EDⅢ免疫小鼠产生特异性抗体。

本发明人通过病毒微中和试验来评估免疫血清在体外抑制ZIKV感染的能力。如图5B和5C所示，PBS组抗血清的中和效价与EDⅢ组抗血清中和效价有显著性差异；EDⅢ组抗血清的几何均值中和效价为3608。以上结果表明，EDⅢ疫苗的免疫原性良好，能够强烈诱发具有保护潜力的中和抗体。

本实施例的实验结果表明，根据本发明的酵母表达的目的蛋白ZIKV EDIII对寨卡病毒感染的中和活性为3608；而果蝇S2细胞表达的目的蛋白ZIKV EDIII对寨卡病毒感染的中和活性为1633.8，二者相差了约3倍。

实施例4.EDⅢ免疫小鼠血清具有体内抗病毒功能。

为了评价免疫血清在小鼠体内保护作用，选取对野生型ZIKV敏感的I型和II型干扰素受体缺陷AG6小鼠进行攻毒保护试验。每只AG6小鼠腹腔注射EDⅢ或PBS抗血清与ZIKV混合物，连续观察14天，记录小鼠体重变化和生存率。如图6所示，PBS组小鼠在攻毒后第五天体重开始下降，在第9-10天陆续全部死亡；相反，EDⅢ抗血清处理组小鼠在攻毒后体重一直平缓上升，生存率达到100％。该数据表明，EDⅢ疫苗组血清在小鼠体内具有保护效果，能够预防致死剂量的寨卡病毒攻击。

对比例1 目的蛋白ZIKV E80和ZIKV EDIII在果蝇S2细胞中的表达

果蝇Schneider 2(S2)细胞购于Invitrogen公司，培养于添加10％胎牛血清(Gibco)，1％双抗(Gibco)的Schneider’s Drosophila Media(Gibco)中或添加1％L-谷氨酰胺(Gibco)，1％双抗(Gibco)的ExpressSFM培养基(Gibco)中，28℃培养箱培养。

果蝇细胞表达载体pMT/BiP/V5-HisA、筛选质粒pCoBlast和磷酸钙转染试剂盒都购自于Invitrogen公司。根据寨卡病毒亚洲型2015年南美流行的Z1106033株(病毒核苷酸GenBank:KU312312，氨基酸Genbank：ALX35659)的E蛋白编码序列(SEQ ID NO.1)，进行密码子优化及基因合成，并进一步克隆到载体pUC57(购自GenScript USA Inc.)上，获得质粒pZIKV-E。以pZIKV-E为模版，经特异性引物PCR扩增后，两端带有Bgl II和Xba I酶切位点，连接到含有Bgl II和Xba I酶切位点的昆虫表达载体pMT/Bip/V5-His A(含有His标签，有利于目的蛋白质的检测和纯化)，得到携带寨卡病毒包膜蛋白N端80％区域(ZIKV E80)和包膜蛋白区域III(ZIKV EDIII)目的基因片段的重组质粒pMT/Bip/V5-ZIKV E80和pMT/Bip/V5-ZIKV EDIII。

将构建好的重组质粒pMT/Bip/V5-ZIKV E80和pMT/Bip/V5-ZIKV EDIII(如图1)，瞬时转染到果蝇细胞，经氯化铬诱导后进行western blot检测培养基上清，检测到目的蛋白。然后把重组质粒和pCoBlast筛选质粒共转，筛选稳定系细胞后，进行诱导表达，获得细胞上清后进行纯化，SDS-PAGE显示ZIKV E80蛋白大小为54KD(如图2A)，用鼠抗His-tag抗体作为一抗，western blot 检测到ZIKV E80(如图2B)大小与SDS-PAGE结果一致。同样地，ZIKV EDIII大小为15KD，与western blot检测到的条带大小一致。以上结果提示目标蛋白E80和EDIII获得表达，纯化后计算ZIKV E80和ZIKV EDIII抗原肽的表达产量分别达到10mg/l和2.6mg/l。

结论

本发明人采用酵母细胞***获得了稳转细胞系，并表达了寨卡病毒截短的包膜蛋白EDIII。本发明获得的目的蛋白ZIKV EDIII在抑制寨卡病毒感染细胞实验中都展示出了比较好的抑制作用。在第三次免疫BALB/c小鼠后，无论是从血清抗体滴度还是特异的T细胞反应来看，免疫的小鼠产生较强的免疫反应。最重要的是，结合铝佐剂，用低剂量的免疫原ZIKV EDIII诱导的抗体就足以保护AG6小鼠免于致死剂量寨卡病毒的攻击。

在目的蛋白的制备方面，本申请人在研究中发现，采用不同的宿主细胞进行表达，在基因序列完全一样的条件下，抗原肽的表达量差异巨大而且在蛋白活性方面也有很大的差异，比如采用酵母细胞表达本发明的ZIKV EDIII抗原肽的表达量可以达到4.5mg/l,而果蝇S2细胞的表达量仅为2.6mg/l。与果蝇S2细胞相比，酵母的表达量提高了70％以上。在活性方面，本发明酵母表达的ZIKV EDIII抗原肽对寨卡病毒感染的抑制活性(IC₅₀＝7.597ug/ml)与果蝇S2细胞表的ZIKV EDIII抗原肽对寨卡病毒感染的抑制活性(IC₅₀＝71.85ug/ml)相比，酵母表达的ZIKV EDIII抗原肽其对寨卡病毒的抑制活性提高了近10倍，更重要的是，酵母细胞表达的ZIKV EDIII抗原肽在中和水平上取得了意料不到的优异技术效果，酵母表达的ZIKV EDIII组血清中和能力更强，PRNT₅₀达到了3608，而果蝇S2细胞表达的ZIKV EDIII组血清中和能力PRNT₅₀为1633.8。与果蝇S2细胞表达的ZIKV EDIII抗原肽相比，酵母表达的ZIKV EDIII抗原肽其诱导中和抗体的能力提高了120％。在表达产量、抗原肽活性和诱导抗体的中和水平综合来看，酵母表达的ZIKV EDIII抗原肽作为寨卡病毒的候选疫苗具有显著优势。

与传统的减毒活疫苗、DNA疫苗以及灭活疫苗相比，该候选疫苗因不具有病毒核酸，所以非常安全。另外纯化方便，不需要复杂的技术，操作简单，具有比较大的开发潜力。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海巴斯德研究所

<120> 一种酵母细胞表达的寨卡病毒亚单位疫苗

<130> P2017-0061

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 504

<212> PRT

<213> 寨卡病毒

<400> 1

Ile Arg Cys Ile Gly Val Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Met Ser

1 5 10 15

Gly Gly Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr

20 25 30

Val Met Ala Gln Asp Lys Pro Thr Val Asp Ile Glu Leu Val Thr Thr

35 40 45

Thr Val Ser Asn Met Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu Ala Ser

50 55 60

Ile Ser Asp Met Ala Ser Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala

65 70 75 80

Tyr Leu Asp Lys Gln Ser Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys Arg Thr Leu

85 90 95

Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser

100 105 110

Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Lys Lys Met Thr Gly Lys

115 120 125

Ser Ile Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Arg Ile Met Leu Ser Val His

130 135 140

Gly Ser Gln His Ser Gly Met Ile Val Asn Asp Thr Gly His Glu Thr

145 150 155 160

Asp Glu Asn Arg Ala Lys Val Glu Ile Thr Pro Asn Ser Pro Arg Ala

165 170 175

Glu Ala Thr Leu Gly Gly Phe Gly Ser Leu Gly Leu Asp Cys Glu Pro

180 185 190

Arg Thr Gly Leu Asp Phe Ser Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Met Asn Asn

195 200 205

Lys His Trp Leu Val His Lys Glu Trp Phe His Asp Ile Pro Leu Pro

210 215 220

Trp His Ala Gly Ala Asp Thr Gly Thr Pro His Trp Asn Asn Lys Glu

225 230 235 240

Ala Leu Val Glu Phe Lys Asp Ala His Ala Lys Arg Gln Thr Val Val

245 250 255

Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Val His Thr Ala Leu Ala Gly Ala

260 265 270

Leu Glu Ala Glu Met Asp Gly Ala Lys Gly Arg Leu Ser Ser Gly His

275 280 285

Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Arg Leu Lys Gly Val Ser

290 295 300

Tyr Ser Leu Cys Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu

305 310 315 320

Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp

325 330 335

Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln Met Ala Val Asp Met Gln Thr Leu

340 345 350

Thr Pro Val Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr Glu Ser

355 360 365

Thr Glu Asn Ser Lys Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe Gly Asp

370 375 380

Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Glu Lys Lys Ile Thr His His Trp

385 390 395 400

His Arg Ser Gly Ser Thr Ile Gly Lys Ala Phe Glu Ala Thr Val Arg

405 410 415

Gly Ala Lys Arg Met Ala Val Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly

420 425 430

Ser Val Gly Gly Ala Leu Asn Ser Leu Gly Lys Gly Ile His Gln Ile

435 440 445

Phe Gly Ala Ala Phe Lys Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Phe Ser

450 455 460

Gln Ile Leu Ile Gly Thr Leu Leu Met Trp Leu Gly Leu Asn Ala Lys

465 470 475 480

Asn Gly Ser Ile Ser Leu Met Cys Leu Ala Leu Gly Gly Val Leu Ile

485 490 495

Phe Leu Ser Thr Ala Val Ser Ala

500

<210> 2

<211> 409

<212> PRT

<213> 寨卡病毒

<400> 2

Ile Arg Cys Ile Gly Val Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Met Ser

1 5 10 15

Gly Gly Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr

20 25 30

Val Met Ala Gln Asp Lys Pro Thr Val Asp Ile Glu Leu Val Thr Thr

35 40 45

Thr Val Ser Asn Met Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu Ala Ser

50 55 60

Ile Ser Asp Met Ala Ser Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala

65 70 75 80

Tyr Leu Asp Lys Gln Ser Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys Arg Thr Leu

85 90 95

Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser

100 105 110

Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Lys Lys Met Thr Gly Lys

115 120 125

Ser Ile Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Arg Ile Met Leu Ser Val His

130 135 140

Gly Ser Gln His Ser Gly Met Ile Val Asn Asp Thr Gly His Glu Thr

145 150 155 160

Asp Glu Asn Arg Ala Lys Val Glu Ile Thr Pro Asn Ser Pro Arg Ala

165 170 175

Glu Ala Thr Leu Gly Gly Phe Gly Ser Leu Gly Leu Asp Cys Glu Pro

180 185 190

Arg Thr Gly Leu Asp Phe Ser Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Met Asn Asn

195 200 205

Lys His Trp Leu Val His Lys Glu Trp Phe His Asp Ile Pro Leu Pro

210 215 220

Trp His Ala Gly Ala Asp Thr Gly Thr Pro His Trp Asn Asn Lys Glu

225 230 235 240

Ala Leu Val Glu Phe Lys Asp Ala His Ala Lys Arg Gln Thr Val Val

245 250 255

Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Val His Thr Ala Leu Ala Gly Ala

260 265 270

Leu Glu Ala Glu Met Asp Gly Ala Lys Gly Arg Leu Ser Ser Gly His

275 280 285

Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Arg Leu Lys Gly Val Ser

290 295 300

Tyr Ser Leu Cys Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu

305 310 315 320

Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp

325 330 335

Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln Met Ala Val Asp Met Gln Thr Leu

340 345 350

Thr Pro Val Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr Glu Ser

355 360 365

Thr Glu Asn Ser Lys Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe Gly Asp

370 375 380

Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Glu Lys Lys Ile Thr His His Trp

385 390 395 400

His Arg Ser Gly Ser Thr Ile Gly Lys

405

<210> 3

<211> 110

<212> PRT

<213> 寨卡病毒

<400> 3

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1 5 10 15

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20 25 30

Glu Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln

35 40 45

Met Ala Val Asp Met Gln Thr Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Ile Thr

50 55 60

Ala Asn Pro Val Ile Thr Glu Ser Thr Glu Asn Ser Lys Met Met Leu

65 70 75 80

Glu Leu Asp Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly

85 90 95

Glu Lys Lys Ile Thr His His Trp His Arg Ser Gly Ser Thr

100 105 110

<210> 4

<211> 1515

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atccgctgca tcggcgtgtc gaatcgcgat ttcgtggagg gaatgagcgg aggaacctgg 60

gtggacgtgg tgctggagca cggaggatgc gtgaccgtga tggcccagga taagccgacc 120

gtggacatcg agctggtgac caccaccgtg tcgaacatgg ccgaggtgcg cagctactgc 180

tacgaggcct cgatcagcga tatggcctcc gactcgcgct gcccaaccca gggcgaggcc 240

tacctggata agcagagcga cacccagtac gtgtgcaagc gcaccctggt ggatcgcgga 300

tggggaaatg gatgcggact gttcggcaag ggatccctgg tgacctgcgc caagttcgcc 360

tgctccaaga agatgaccgg caagtcgatc cagccagaga acctggagta ccgcatcatg 420

ctgtcggtgc acggaagcca gcactccggc atgatcgtga acgataccgg ccacgagacc 480

gacgagaatc gcgccaaggt ggagatcacc ccgaactccc cacgcgccga ggccaccctg 540

ggaggattcg gatcgctggg cctggattgc gagccacgca ccggcctgga tttctccgac 600

ctgtactacc tgaccatgaa caataagcac tggctggtgc acaaggagtg gttccacgat 660

atcccactgc cctggcacgc cggagccgac accggaaccc cacactggaa caataaggag 720

gccctggtgg agttcaagga cgcccacgcc aagcgccaga ccgtggtggt gctgggaagc 780

caggagggag ccgtgcacac cgccctggcc ggagccctgg aggccgagat ggatggagcc 840

aagggacgcc tgagctccgg acacctgaag tgccgcctga agatggacaa gctgcgcctg 900

aagggcgtga gctactccct gtgcaccgcc gccttcacct tcaccaagat cccagccgag 960

accctgcacg gaaccgtgac cgtggaggtg cagtacgccg gaaccgatgg accatgcaag 1020

gtgccagccc agatggccgt ggacatgcag accctgaccc cagtgggacg cctgatcacc 1080

gccaatcccg tgatcaccga gtccaccgag aactcgaaga tgatgctgga gctggatccc 1140

ccgttcggcg acagctacat cgtgatcggc gtgggcgaga agaagatcac ccaccactgg 1200

caccgctcgg gaagcaccat cggcaaggcc ttcgaggcca ccgtgcgcgg agccaagcgc 1260

atggccgtgc tgggcgatac cgcctgggac ttcggaagcg tgggaggagc cctgaacagc 1320

ctgggcaagg gcatccacca gatcttcgga gccgccttca agtccctgtt cggaggcatg 1380

tcgtggttca gccagatcct gatcggcacc ctgctgatgt ggctgggcct gaacgccaag 1440

aatggctcca tctcgctgat gtgcctggcc ctgggaggag tgctgatctt cctgagcacc 1500

gccgtgtccg cctaa 1515

<210> 5

<211> 1227

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atccgctgca tcggcgtgtc gaatcgcgat ttcgtggagg gaatgagcgg aggaacctgg 60

gtggacgtgg tgctggagca cggaggatgc gtgaccgtga tggcccagga taagccgacc 120

gtggacatcg agctggtgac caccaccgtg tcgaacatgg ccgaggtgcg cagctactgc 180

tacgaggcct cgatcagcga tatggcctcc gactcgcgct gcccaaccca gggcgaggcc 240

tacctggata agcagagcga cacccagtac gtgtgcaagc gcaccctggt ggatcgcgga 300

tggggaaatg gatgcggact gttcggcaag ggatccctgg tgacctgcgc caagttcgcc 360

tgctccaaga agatgaccgg caagtcgatc cagccagaga acctggagta ccgcatcatg 420

ctgtcggtgc acggaagcca gcactccggc atgatcgtga acgataccgg ccacgagacc 480

gacgagaatc gcgccaaggt ggagatcacc ccgaactccc cacgcgccga ggccaccctg 540

ggaggattcg gatcgctggg cctggattgc gagccacgca ccggcctgga tttctccgac 600

ctgtactacc tgaccatgaa caataagcac tggctggtgc acaaggagtg gttccacgat 660

atcccactgc cctggcacgc cggagccgac accggaaccc cacactggaa caataaggag 720

gccctggtgg agttcaagga cgcccacgcc aagcgccaga ccgtggtggt gctgggaagc 780

caggagggag ccgtgcacac cgccctggcc ggagccctgg aggccgagat ggatggagcc 840

aagggacgcc tgagctccgg acacctgaag tgccgcctga agatggacaa gctgcgcctg 900

aagggcgtga gctactccct gtgcaccgcc gccttcacct tcaccaagat cccagccgag 960

accctgcacg gaaccgtgac cgtggaggtg cagtacgccg gaaccgatgg accatgcaag 1020

gtgccagccc agatggccgt ggacatgcag accctgaccc cagtgggacg cctgatcacc 1080

gccaatcccg tgatcaccga gtccaccgag aactcgaaga tgatgctgga gctggatccc 1140

ccgttcggcg acagctacat cgtgatcggc gtgggcgaga agaagatcac ccaccactgg 1200

caccgctcgg gaagcaccat cggcaag 1227

<210> 6

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aagctgcgcc tgaagggcgt gagctactcc ctgtgcaccg ccgccttcac cttcaccaag 60

atcccagccg agaccctgca cggaaccgtg accgtggagg tgcagtacgc cggaaccgat 120

ggaccatgca aggtgccagc ccagatggcc gtggacatgc agaccctgac cccagtggga 180

cgcctgatca ccgccaatcc cgtgatcacc gagtccaccg agaactcgaa gatgatgctg 240

gagctggatc ccccgttcgg cgacagctac atcgtgatcg gcgtgggcga gaagaagatc 300

acccaccact ggcaccgctc gggaagcacc 330

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aagctgcgcc tgaagggc 18

<210> 8

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caacggtacc ttaatggtga tggtgatgat gggtgcttcc cgagcggtg 49

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atccgctgca tcggcgtgtc gaat 24

<210> 10

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caacggtacc ttaatggtga tggtgatgat gcttgccgat ggtgcttcc 49

Claims

1.一种抗原肽，其特征在于，所述抗原肽衍生自寨卡病毒包膜蛋白，并且选自下组：

(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

2.如权利要求1所述的抗原肽，其特征在于，所述抗原肽为酵母细胞表达的重组蛋白。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的抗原肽。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求4所述的表达载体，或者在基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。

6.一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物含有权利要求1所述的抗原肽、权利要求3所述的多核苷酸或者权利要求4所述的表达载体或者权利要求5所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或辅料。

7.一种疫苗组合物，其特征在于，所述的组合物含有权利要求1所述的抗原肽、权利要求3所述的多核苷酸或者权利要求4所述的表达载体或者权利要求5所述的宿主细胞，以及免疫学上可接受的载体和/或辅料。

8.如权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物还含有佐剂。

9.如权利要求1所述的抗原肽的用途，(a)用于制备针对寨卡病毒的抗体；和/或(b)用于制备治疗和/或预防与寨卡病毒相关的疾病的药物。

10.一种制备权利要求1所述的抗原肽的方法，包括步骤：

(i)在适宜条件下培养权利要求5所述的宿主细胞，从而表达权利要求1所述的抗原肽；

(ii)纯化所述抗原肽。