CN113292640B - 一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒rbd三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种针对多种新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)流行株同时产生交叉中和活性的重组RBD三聚体蛋白，所述三聚体蛋白是由三个新型冠状病毒S蛋白RBD区域的亚基组成，所述三个新型冠状病毒RBD区域的氨基酸序列相同或至少一个不同；当所述三个新型冠状病毒RBD区域的氨基酸序列相同时，所述氨基酸序列为如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，或与其具有95％以上同源性的序列。以RBD三聚体蛋白为抗原，辅以佐剂后，免疫机体，可同时产生针对多种新型冠状病毒流行株的高滴度中和性抗体，具有一定广谱性，可以用于治疗和/或预防新型冠状病毒感染和/或新型冠状病毒疾病。

Description

一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒RBD三聚体 蛋白疫苗、其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)，属巢病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、正冠状病毒亚科、Betacoronavirus属、Sarbecovirus亚属、类SARS病毒种、单股正链RNA病毒，有包膜，基因组全长约为29.9kb，绝大部分编码非结构蛋白，参与病毒复制和翻译等功能，少部分序列编码结构蛋白，如：S蛋白(spike protein，)、M蛋白(membrane protein)、E蛋白(envelope protein)和N蛋白(nucleo protein)。此外，还有若干附属蛋白：3a,3b,p6,7a,7b,8b,9b和orf14，这些蛋白均参与病毒组装。S、M和E蛋白构成病毒囊膜，是病毒引起免疫反应的主要表面抗原。其中S蛋白是一种跨膜糖蛋白，分子量约为150kDa，在病毒表面形成突出的同源三聚体。S由两个功能亚基组成，在S1和S2亚基之间的边界处(S1/S2裂解点)被切割，这两个亚基在融合前构象中保持非共价结合。S2亚基也由多个结构域构成，它的功能主要是介导病毒与宿主细胞的融合。远端S1亚基在结构上分为四个不同的结构域：N端结构域(NTD)、受体结合结构域(RBD)、C端结构域1(CTD1)和C端结构域2(CTD2)，其中RBD主要负责与宿主细胞表面的受体血管紧张素转换酶2(angiotensinconverting enzyme 2,ACE2)结合，从而介导病毒侵染宿主细胞，因此S蛋白及RBD均为目前基因工程疫苗研发的主要靶标。
截至目前，全球获批上市的疫苗共有8款，分别是美国批准紧急使用授权(EUA)的BNT162b2和mRNA-1273，英国批准紧急使用授权(EUA)的AZD1222，中国国药中生(北京公司和武汉公司)和北京科兴的3款新冠灭活疫苗、康希诺生物腺病毒载体疫苗以及智飞生物重组蛋白疫苗，以及俄罗斯批准上市的“卫星V”，另外还有数十种疫苗处于临床研究不同阶段。这些已上市的疫苗无论是来自哪种技术路线，都对疫情防控做出了不同程度的贡献，然而由于新冠病毒的进化，不断出现各种突变，使现有疫苗的保护效果受到不同程度的影响。
新冠病毒属于RNA病毒，较易发生突变，全球已经报道了30000多个新冠病毒突变株，主要突变株包括：Alpha(B.1.1.7)突变株、Beta(B.1.351)突变株、Gamma(P1)突变株、Epsilon(B.1.429)突变株、Delta(B.1.617.2)，Kappa(B.1.617.1)突变株。这些突变株的突变位点主要存在于S蛋白的氨基酸序列，尤其是RBD区。因此，突变可能会提高病毒与ACE2受体的亲和力、减弱中和抗体效应，从而增强病毒毒力和传染力，加速病毒逃逸，降低疫苗保护效果。因此，开发一种针对多种新冠病毒流行株的广谱性疫苗已成为当务之急。
发明内容
本发明针对现有技术中缺少广谱新型冠状病毒疫苗(SARS-CoV-2)的技术缺陷，提供了一种能够对多种新型冠状病毒流行株，同时产生良好交叉中和活性的单组分广谱重组RBD三聚体蛋白疫苗。
本发明提供的技术方案为：
一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白，所述三聚体蛋白是由三个新型冠状病毒RBD区域的亚基组成，所述三个新型冠状病毒RBD区域的氨基酸序列相同或至少一个不同；
当所述三个新型冠状病毒RBD区域的氨基酸序列相同时，所述氨基酸序列为如SEQID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，或与其具有95％以上同源性的序列。
本发明基于新冠病毒S蛋白RBD区结构学特征，利用计算生物学方法设计了一种全新的融合蛋白，该蛋白包含有三个RBD结构域，在可以不引入任何外源连接臂或其它无关成分情况下，形成抗原构象稳定的三聚体形式，实现RBD蛋白三聚化。利用基因工程技术重组表达并纯化RBD三聚体蛋白后，与佐剂混合制备成疫苗。按一定剂量和剂次免疫后，可产生针对多种新型冠状病毒流行株的保护性中和抗体，用于治疗和/或预防SARS-CoV-2感染和/或新型冠状病毒疾病(COVID-19)。由于RBD区功能明确，结构清楚，负责识别宿主细胞的ACE2受体，同时针对RBD产生的抗体功能明确，靶点特异，最大程度避免诱导机体产生抗体依赖的增强作用(Antibody Dependent Enhancement，ADE)。
本发明中所述的三聚体蛋白是由三个新型冠状病毒RBD区域的氨基酸片段按照N末端至C末端的顺序连接。
在本发明中，上述三聚体蛋白的三个RBD区域亚基的肽链长度可以为该新型冠状病毒S蛋白RBD区域的全长。作为优选，在本发明的实施方式中，上述新型冠状病毒RBD区域的肽链长度至少为该RBD区域序列全长的50％～99％。
上述该RBD区域全长的50％～99％可以为该RBD区域全长的50％、60％、70％、80％、90％或99％，其中至少包含一个或多个各不相同的氨基酸残基。
更优选地，在本发明的一个实施方式中，上述新型冠状病毒RBD区域的氨基酸序列为S蛋白的第319～537位氨基酸。
在本发明中，上述新型冠状病毒RBD区域的氨基酸序列可以来自不同的新型冠状病毒流行株的S蛋白的RBD结构域，例如，原型株新冠病毒，同时携带有L452R和E484Q突变的Kappa(B.1.617)新冠病毒、携带有D614G突变的新冠病毒、携带有L452R突变的新冠病毒、携带有N501Y、P681H、69-70del等多个突变的Alpha(B.1.1.7)新冠病毒、携带有N501Y、K417N、E484K等突变的Beta(B.1.135)新冠病毒、携带有N501Y、E484K和K417T突变的Gamma(P.1)新冠病毒等。上述序列可以通过NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的数据库获得。
作为优选，在本发明的实施方式中，上述新型冠状病毒RBD区域的氨基酸序列为如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，或与其具有95％以上同源性的序列。
在上述实施方式中，本发明三聚体蛋白在可以不引入任何外源连接臂或其它无关成分情况下，形成抗原构象稳定的三聚体形式。
在上述实施方式中，SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3中的氨基酸序列可以经替换、缺失、***1个或多个氨基酸以获得新的氨基酸序列，由该氨基酸序列组成的新的蛋白质具有与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3中的氨基酸序列组成的蛋白质相同或基本相同的免疫学活性，该新的氨基酸序列也视为包含在本发明的保护范围之内。
进而，上述与其具有95％以上同源性的序列是指与所述重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白或所述融合蛋白的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。本领域技术人员可以对本说明书中所述融合蛋白的氨基酸序列以合适的方式进行随机或者工程化的点突变，其目的可以为，例如，获得更好的亲和力和/或解离性质，表达性能的提高，等，这些序列可以与所述重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白或所述融合蛋白具有相同或基本相同的免疫学活性，而这些突变后的氨基酸序列均包含在本发明的保护范围之内。
在本发明中，上述氨基酸序列中相同或至少一个不同的三个新型冠状病毒RBD区域可以按照任意顺序由N末端至C末端连接，例如，在本发明的实施方式中，由上述SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3顺序连接形成的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；由上述SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.1顺序连接形成的蛋白，氨基酸序列如SEQ IDNo.5所示；由上述SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.2顺序连接形成的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；由上述SEQ ID No.2、SEQ ID No.1、SEQ ID No.2顺序连接形成的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；由上述SEQ ID No.2、SEQ ID No.2、SEQ ID No.2顺序连接形成的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.8所示，或其他任意的组合。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述三聚体蛋白的氨基酸序列为如SEQID No.4所示的氨基酸序列，或与其具有95％以上同源性的序列。
本发明的另一个方面，是提供了一种融合蛋白，上述融合蛋白包含上述重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白。
作为优选，在本发明的实施方式中，所述融合蛋白还包含选自信号肽、标签或免疫增强肽中的一种或几种。上述信号肽的作用可以是更有利于蛋白质的表达；上述标签可以为，例如，Flag标签、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)，等等，其作用可以是用于检测、纯化、分离等等。上述功能性序列可任意组合使用。
本发明的另一个方面，是提供了一种核酸分子，上述核酸分子包含编码上述重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白，或编码上述融合蛋白的核苷酸序列。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，发明人对所述三聚体蛋白的密码子进行了优化，得到的所述核苷酸序列如SEQ ID No.9-17所示或与其具有95％以上同源性的序列。
上述与其具有95％以上同源性的序列是指与所述核苷酸序列具有95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。
对于上述核酸分子的制备方法，可基于上述核苷酸序列，通过化学合成或PCR扩增等已知技术制备。通常，可以对编码上述结构域的氨基酸的密码子进行优化，以优化其在宿主细胞中的表达。上述碱基序列的信息可通过检索已知文献或NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等数据库来获得。
本发明的另一个方面，是提供了一种载体，上述载体包含上述核酸分子。
在本发明中，上述载体可以为直链载体，也可以为环状载体。可以为质粒等非病毒载体，也可以为病毒载体，还可以为利用转座子的载体。所述载体中可含有启动子、终止子等调控序列，以及耐药基因、报告基因等标记序列。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述载体为本发明中所述核酸分子的表达载体。
本发明的另一个方面，是提供了一种宿主细胞，上述宿主细胞包含上述核酸分子或上述载体。
作为优选，在本发明的实施方式中，上述宿主细胞为大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；
更优选地，在本发明的一个实施方式中，上述宿主细胞为CHO细胞。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白或上述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
步骤A)制备所述核酸分子，构建所述表达载体，将表达载体转化或转染至所述宿主细胞内；
步骤B)利用步骤A)的产物进行蛋白质表达；
步骤C)纯化步骤B)中获得的表达产物，得到上述重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白或融合蛋白。
其中，步骤A)所述核酸分子包含编码上述重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白，或编码上述融合蛋白的核苷酸序列。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述核苷酸序列如SEQ ID No.9-17所示或与其具有95％以上同源性的序列。
可使用任意合适的分子生物学方法根据本说明书中所述核苷酸序列制备所述核酸分子。
其中，步骤A)所述构建表达载体可以使用任意合适的方法将上述核苷酸序列构建在宿主细胞相应的表达载体中。
然后将表达载体转化或转染至所述宿主细胞内。作为优选，在本发明的一个实施方式中，发明人在构建CHO细胞表达载体后将其转染至HEK293FT细胞或CHO细胞内构建重组细胞株。
其中，步骤B)所述蛋白质表达可以根据所使用的不同表达***对重组蛋白进行表达。进一步地，在本发明的一个实施方式中，发明人通过有限稀释法筛选得到能够稳定分泌表达RBD三聚体蛋白或融合蛋白的细胞株。
其中，步骤C)所述纯化可以为任意合适的方法。例如，盐析法、沉淀法、透析或超滤、分子筛层析法、离子交换层析法、疏水层析法、亲和层析法，等等。作为优选，在本发明的一个实施方式中，采用离子交换和疏水层析的方法纯化上述RBD三聚体蛋白或融合蛋白。
当然，根据现有技术，在进行纯化步骤之前，还应包含对目标蛋白质的收集过程，例如。对富含目标蛋白质的细胞培养液上清的收集；对已表达目标蛋白质后的所述宿主细胞进行破碎的过程，可以使用例如，超声波破碎、反复冻融破碎、化学处理法等任意合适的破碎方法。上述对宿主细胞的收集过程也应理解为包含在所述纯化的范围之内。
本发明的另一个方面，是提供了上述重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白、上述融合蛋白、上述核酸分子、上述载体或所述宿主细胞在制备用于治疗和/或预防新型冠状病毒感染和/或新型冠状病毒引起的疾病的药物中的用途。
所述新型冠状病毒引起的疾病优选为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。
本发明的另一个方面，是提供了一种疫苗，上述疫苗包含上述重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白或上述融合蛋白，以及佐剂。
在本发明的实施方式中，上述疫苗为重组蛋白疫苗(或称基因工程亚单位疫苗)。进一步地，在本发明的另外一些实施方式中，上述疫苗还可以为基因工程载体疫苗，或者可以为核酸疫苗，上述疫苗包含本说明书中所述核苷酸序列或编码本说明书中所述的氨基酸序列。
在本发明所述疫苗中，可以包含任意合适的佐剂。但作为优选，在本发明的实施方式中，上述佐剂为氢氧化铝、磷酸铝、MF59或CpG。更优选地，上述佐剂为氢氧化铝。
本发明的另一个方面，是提供了上述疫苗的制备方法，将纯化所得的上述重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白或上述融合蛋白与所述佐剂混合。
本发明的另一个方面，是提供了上述疫苗在治疗和/或预防新型冠状病毒感染和/或新型冠状病毒引起的疾病中的用途。
所述新型冠状病毒引起的疾病优选为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。
本发明的另一个方面，是提供了一种药物组合物，上述药物组合物包含所述疫苗，以及药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可以为任意药学上允许的添加剂，例如，生理盐水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、氨基酸以及它们的组合物、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、等渗剂等。
本发明所述药物组合物也可以和其他治疗和/或预防新型冠状病毒感染和/或新型冠状病毒引起的疾病的药物在有效安全的剂量下联合使用。
本发明的另一个方面，是提供了一种引发受试者针对新型冠状病毒的免疫应答或治疗受试者的新型冠状病毒感染的方法，向所述受试者施用有效剂量的所述疫苗或所述药物组合物。
上述受试者可以为人类或者其他动物。
上述施用可以为肌肉注射、腹腔注射或皮下注射。
本发明的有益效果：
本发明制备的疫苗以RBD三聚体蛋白为抗原，辅以佐剂后，免疫机体，可同时产生针对多种流行株的新型冠状病毒的高滴度中和抗体，可以用于治疗和/或预防新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染和/或新型冠状病毒疾病。
附图说明
图1为本发明实施例1中新型冠状病毒S蛋白结构分析图，其中，A为S蛋白单体结构(基于PDB代码为6zgg的坐标文件，采用UCSF Chimera软件绘制)，S1结构单元包括NTD、RBD、CTD1和CTD2结构域；B为RBD与ACE2受体复合物结构(基于PDB代码为6m0j的坐标文件，采用UCSF Chimera软件绘制)；
图2为本发明实施例1中三聚体蛋白A的同源模建结果图；
图3为本发明实施例2中SDS-PAGE检测结果，其中，1道为三聚体蛋白，2道为三聚体蛋白A，3道为三聚体蛋白B，4道为三聚体蛋白C，M为蛋白质marker(分子量标准为：kDa：250、130、100、70、55、35、25、15、10)；
图4为本发明实施例2中纯化所得三聚体蛋白的Western-blot鉴定图，其中，1道为三聚体蛋白，2道为三聚体蛋白A，3道为三聚体蛋白B，4道为三聚体蛋白C，M为蛋白质marker(分子量标准为：kDa：250、130、100、70、55、35、25、15、10)；
图5为本发明实施例3中重组表达的蛋白与MM43中和性单克隆抗体结合曲线图；
图6为本发明实施例3中重组表达的蛋白与MM57中和性单克隆抗体结合曲线图；
图7为本发明实施例3中重组表达的蛋白与R001中和性单克隆抗体结合曲线图；
图8为本发明实施例3中重组表达的蛋白与R117中和性单克隆抗体结合曲线图；
图9为本发明实施例4中三聚体蛋白A的SDS-PAGE检测结果图，其中1道至4道为不同蛋白浓度的三聚体蛋白，5道至8道为不同蛋白浓度的三聚体蛋白A，M为蛋白质marker(分子量标准为：kDa：250、130、100、70、55、35、25、15、10)；
图10为本发明实施例4中三聚体蛋白A的Western-blot检测结果图，其中1道至4道为不同蛋白浓度的三聚体蛋白，5道至8道为不同蛋白浓度的三聚体蛋白A，M为蛋白质marker(分子量标准为：kDa：250、130、100、70、55、35、25、15、10)；
图11为本发明实施例4中利用量热差示扫描技术检测三聚体蛋白A的热稳定性结果图；
图12为本发明实施例4中利用透射电镜观察三聚体蛋白A形态结果图；
图13为本发明实施例4中利用表面等离子共振技术检测三聚体蛋白A与hACE2受体蛋白亲和力结果图；
图14为本发明实施例6中利用假病毒微量中和试验检测小鼠免疫血清的中和抗体滴度结果图。
序列说明
SEQ ID No.1为本发明实施例中的一种新型冠状病毒(原型株)RBD的氨基酸序列；
SEQ ID No.2为本发明实施例中的另一种新型冠状病毒(Beta(B.1.351)突变株)RBD的氨基酸序列；
SEQ ID No.3为本发明实施例中的另一种新型冠状病毒(Kappa(B.1.617.1)突变株)RBD的氨基酸序列；
SEQ ID No.4为本发明实施例中三聚体蛋白A的氨基酸序列；
SEQ ID No.5为本发明实施例中三聚体蛋白B的氨基酸序列；
SEQ ID No.6为本发明实施例中三聚体蛋白C的氨基酸序列；
SEQ ID No.7为本发明实施例中三聚体蛋白D的氨基酸序列；
SEQ ID No.8为本发明实施例中三聚体蛋白E的氨基酸序列；
SEQ ID No.9为本发明实施例中经优化的编码三聚体蛋白A的核苷酸序列；
SEQ ID No.10为本发明实施例中经优化的编码三聚体蛋白B的核苷酸序列；
SEQ ID No.11为本发明实施例中经优化的编码三聚体蛋白C的核苷酸序列；
SEQ ID No.12为本发明实施例中经优化的编码三聚体蛋白C的核苷酸序列；
SEQ ID No.13为本发明实施例中经优化的编码三聚体蛋白C的核苷酸序列；
SEQ ID No.14为本发明实施例中经优化的编码三聚体蛋白C的核苷酸序列；
SEQ ID No.15为本发明实施例中经优化的编码三聚体蛋白D的核苷酸序列；
SEQ ID No.16为本发明实施例中经优化的编码三聚体蛋白E的核苷酸序列；
SEQ ID No.17为本发明实施例中经优化的编码三聚体蛋白E的核苷酸序列；
SEQ ID No.18为本发明实施例中三聚体蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID No.19为本发明实施例中二聚体蛋白的氨基酸序列。
具体实施方式
本发明公开了一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“RBD”即代表新型冠状病毒的刺突蛋白的RBD结构域，其与“RBD”或“新型冠状病毒RBD区域”可以理解为能够相互替换使用。
下面就本发明中出现的部分术语作以解释。
术语“新型冠状病毒”，即SARS-CoV-2，属巢病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、正冠状病毒亚科、Betacoronavirus属、Sarbecovirus亚属、类SARS病毒种、单股正链RNA病毒，有包膜，基因组全长约为29.9kb，绝大部分编码非结构蛋白，参与病毒复制和翻译等功能，少部分序列编码结构蛋白，如：S蛋白(spike protein)、M蛋白(membrane protein)、E蛋白(envelope protein)和N蛋白(nucleo protein)，此外还有若干附属蛋白：3a,3b,p6,7a,7b,8b,9b和orf14，这些蛋白均参与病毒组装。S、M和E蛋白构成病毒囊膜，是病毒引起免疫反应的主要表面抗原。其中S蛋白是一种跨膜糖蛋白，分子量约为150kDa，在病毒表面形成突出的同源三聚体。S由两个功能亚基组成，在S1和S2亚基之间的边界处(S1/S2裂解点)被切割，这两个亚基在融合前构象中保持非共价结合。S2亚基也由多个结构域构成，它的功能主要是介导病毒与宿主细胞的融合。远端S1亚基在结构上分为四个不同的结构域：N端结构域(NTD)、受体结合结构域(RBD)、C端结构域1(CTD1)和C端结构域2(CTD2)，其中RBD主要负责与宿主细胞表面的受体血管紧张素转换酶2(angiotensinconverting enzyme 2,ACE2)结合，从而介导病毒侵染宿主细胞，因此S蛋白及RBD均为目前基因工程疫苗研发的主要靶标。
术语“三聚体形式”，是蛋白质高级结构中的一种类型。其中含有三个蛋白质亚基即为三聚体形式。
术语“至少有一个”可以理解为在三个氨基酸序列中的两个相同或者三个氨基酸序列各不相同。
术语“一级结构”，是肽或蛋白质中氨基酸的线性序列。按照惯例，蛋白质的一级结构是指从氨基末端(N)端到羧基末端(C)端。
术语“融合蛋白”，fusion protein，是指通过DNA重组技术得到的一个、两个或多个基因重组后的表达产物。融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法，利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。
术语“载体”，是可将多核苷酸***其中的一种核酸运载工具。当载体能使***的多核苷酸编码的蛋白质获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
术语“宿主细胞”，是已经通过分子生物学技术将核酸分子引入的细胞。这些技术包括转染病毒载体，用质粒载体转化，以及通过电穿孔、脂转染、和粒子枪加速引入裸DNA。
术语“治疗”，是指减少疾病病理的可能性，减少疾病症状的发生，例如在一定程度上受试者具有更长的存活期或减少的不适。治疗可以是指当向受试者给予疗法时该疗法减少疾病症状、体征或病因的能力。治疗还指缓和或减少至少一种临床症状和/或抑制或延迟病症的进展和/或预防或延迟疾病或疾患的发作。
术语“受试者”是指接受预防、治疗、诊断的任何人或其他动物，特别是其他哺乳动物。其他哺乳动物可以包括，例如，狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔子、大鼠、豚鼠、小鼠等。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：基于蛋白结构和计算生物学设计的新型冠状病毒RBD三聚体蛋白
通过对新型冠状病毒代表性突变株和原型株进行比对和分析(如表1所示)，Beta(B.1.351)突变株发生了3个位点的氨基酸突变，即K417N、E484K和N501Y；Kappa(B.1.617.1)突变株发生了2个位点的氨基酸突变，即L452R和E484Q。其中，E484K被认为是导致免疫逃逸的最主要的位点突变，通过分子动力学模拟和自由能计算发现，E484K突变会导致RBD与多个中和性单抗的亲和力显著降低，WHO列出的归类为VOC和VOI的10种突变株中，有6种突变株均含有E484K突变。另外，L452R突变也已经被证实能够对中和抗体以及新冠病人恢复者血清产生逃逸，10种VOC和VOI突变株中，有3株含有L452R突变。有实验证据显示，K417N和N501Y突变能够对一部分中和抗体产生抵抗，在10种VOC和VOI突变株中，有4株含有N501Y突变。此外，通过对目前已知的120万条SARS-CoV-2序列进行了进化分析，发现E484K、L452R和N501Y是RBD中最主要的趋同进化突变，这些突变在众多不同的病毒谱系独立出现，表明这些突变在病毒进化中具有明显的选择优势，也预示着这些突变可能会在将来的突变株中再次独立或组合出现。因此研发一种具有跨流行株广谱保护能力的新冠疫苗具有重要意义。
对天然S蛋白三聚体空间结构分析(如图1所示)，对RBD结构域的N端和C端的空间距离进行计算，发现在不引入外源载体或序列的情况下，可以利用RBD自身的结构特征实现三聚化，同时不会存在较大的空间位障。基于此，截取不同突变株的新型冠状病毒S蛋白RBD区序列片段(319～537位氨基酸)，将三个RBD区片段首尾串联，形成一个新的融合蛋白。针对新型冠状病毒原型株S蛋白RBD区序列片段(319～537位氨基酸)序列如SEQ ID No.1所示，针对Beta(B.1.351)突变株的S蛋白RBD区序列片段(319～537位氨基酸)序列如SEQ IDNo.2所示，针对Kappa(B.1.617.1)突变株的S蛋白RBD区序列片段(319～537位氨基酸)序列如SEQ ID No.3所示。
对SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3进行不同组合，以达到一种三聚体蛋白可同时产生针对不同新型冠状毒株的交叉中和活性，达到广谱性疫苗研发目的，具体如下：由SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3顺序连接形成的三聚体蛋白A，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；由SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.1顺序连接形成的三聚体蛋白B，氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；由SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.2顺序连接形成的三聚体蛋白C，氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；由SEQ ID No.2，SEQ ID No.1，SEQID No.2顺序连接形成的三聚体蛋白D，氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；由SEQ ID No.2，SEQ ID No.2，SEQ ID No.2顺序连接形成的三聚体蛋白E，氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
以三聚体蛋白A(氨基酸序列如SEQ ID No.4所示)为例，利用同源模建搭建了其可能的空间结构，结果如图2所示，显示该融合蛋白包含有三个独立RBD结构域，可以形成抗原构象稳定的三聚体形式，且该蛋白涵盖了关键的活跃突变位点和潜在的免疫逃逸位点，理论上推测对以此作为靶抗原的重组疫苗具备跨流行株的广谱保护能力，另外，与传统的制备多个单价疫苗，通过多价组合来实现广谱保护的策略相比，在一种抗原分子上实现了多价广谱保护效果，在疫苗制备的时间成本、经济成本以及疫苗产能方面具有明显的优势。
表1.SARS-CoV-2代表性流行株RBD区突变情况
Figure BDA0003120994430000121
Figure BDA0003120994430000131
实施例2：三聚体蛋白表达、纯化及鉴定
按照CHO细胞表达***的密码子偏爱性，对编码蛋白A至蛋白E(氨基酸序列如SEQID NO.4至SEQ ID NO.8所示)的核苷酸序列进行密码子优化，蛋白A(氨基酸序列为SEQ IDNO.4)优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，蛋白B(氨基酸序列为SEQ ID NO.5)优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，蛋白C(氨基酸序列为SEQ ID NO.6)优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14所示，蛋白D(氨基酸序列为SEQ ID NO.7)优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，蛋白E(氨基酸序列为SEQ IDNO.8)优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.17所示。
构建CHO细胞表达载体后转染至293FT细胞或CHO细胞内构建重组细胞株，通过有限稀释法筛选得到能够稳定分泌表达RBD三聚体蛋白的细胞株，最终蛋白A、蛋白B和蛋白C均成功得到表达，经系列层析纯化后蛋白A、蛋白B和蛋白C均获得纯度≥95％的三聚体蛋白，蛋白D和蛋白E表达量过低经纯化后未获得纯度较高的目的蛋白。蛋白A、蛋白B和蛋白C的SDS-PAGE检测结果如图3所示，蛋白分子量大小在70～100kD，同时可见有部分产品相关物质，如二聚体蛋白和单体蛋白等。
将纯化后蛋白A、蛋白B和蛋白C经SDS-PAGE电泳后电转至PVDF膜上，利用RBD特异性抗体(厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号：40591-T62；稀释度：2000倍)进行Western-blot鉴定(结果如图4所示)，所有蛋白可与RBD特异性抗体发生结合，具有良好的生物学活性。采用TSKgel G2500PW凝胶色谱柱对纯化后的蛋白A、蛋白B和蛋白C进行分子排阻色谱分析，所有纯化后蛋白纯度均大于90％。
实施例3：与中和性单克隆抗体结合生物学分析
将纯化后的三聚体蛋白A、蛋白B、蛋白C，以及三聚体蛋白(由3个如SEQ ID No.1所示的氨基酸片段顺序连接形成如SEQ ID No.18所示氨基酸序列的蛋白，经293FT细胞或CHO细胞重组表达、层析纯化所得)和二聚体蛋白(由2个如SEQ ID No.1所示的氨基酸片段顺序连接形成如SEQ ID No.19所示氨基酸序列的蛋白，经293FT细胞或CHO细胞重组表达、层析纯化所得)、RBD蛋白(厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号：40592-V08B)、与Beta(B.1.351)株病毒突变位点一致的RBD蛋白(K417N、E484K、N501Y；厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号：40592-V08H85)，与Kappa(B.1.617.1)株病毒突变位点一致的RBD蛋白(L452R、E484Q；厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号：40592-V08H85)，利用包被液稀释至4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml、0.03125μg/ml、0.015625μg/ml、0.007813μg/ml、0.003906μg/ml、0.001953μg/ml，100μl/孔，包被至96孔酶标板上，4℃，8～12h，以空白孔为阴性对照；PBST溶液洗板后加入封闭液，37℃封闭3h；PBST溶液洗板后分别加入稀释后的MM43单克隆抗体(厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号：40591-MM43，稀释度：2000倍)，或MM57单克隆抗体(厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号：40592-MM57；稀释度：2000倍)，或R001单克隆抗体(厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号：40592-R001；稀释度：2000倍)，或R117单克隆抗体(厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号：40592-R117；稀释度：2000倍)，100μl/孔，37℃孵育1h；PBST溶液洗板后加入稀释后的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG抗体，100μl/孔，37℃孵育1h；PBST溶液洗板后先后加入显色液A和B，室温下显色5～10min，加入终止液C；酶标仪上进行双波长(OD450nm和630nm)读值，确定cutoff值，并绘制蛋白浓度-吸光度值曲线。
与MM43单克隆抗体结合活性结果如图5所示，与MM57单克隆抗体结合活性结果如图6所示，与R001单克隆抗体结合活性结果如图7所示，与R117单克隆抗体结合活性结果如图8所示，结果可见三聚体蛋白A与所有中和性单克隆抗体均呈不同程度的结合，其中与MM43抗体结合活性与三聚体蛋白基本一致，与MM57和R117单克隆抗体结合活性低于三聚体蛋白，说明三聚体蛋白既具有原型株RBD蛋白性质，又具有Beta(B.1.351)株RBD蛋白特性。
实施例4：三聚体蛋白A理化性质及活性检测
三聚体蛋白A一级序列中包含有原型株、Beta(B.1.351)突变株和Kappa(B.1.617.1)突变株的RBD区氨基酸序列，是一种突变集成的RBD三聚体蛋白(mutations-integrated trimeric form of RBD，mutI tri-RBD)，进一步对纯化后的三聚体蛋白A进一步分析，利用SDS-PAGE检测和Western-blot分析，同时以三聚体蛋白为对照，结果如图9和图10所示，可见三聚体蛋白A与三聚体蛋白分子量大小基本一致，在70～100kD之间，利用MALDI-TOF MS方法检测蛋白完整分子量，三聚体蛋白A分子量约为87.836kD，较理论值(74kD)偏大，这与蛋白糖基化修饰相关，利用UPLC-MS方法检测蛋白糖基化修饰，结果显示重组表达的三聚体蛋白A具有较多位点的糖基化修饰。利用圆二色谱对三聚体蛋白A进行二级结构检测，结果显示α螺旋占比为13.5％，β折叠占比为23.3％，β转角占比为11.4％，其他为51.8％，这与理论值基本保持一致。利用UPLC-MS方法检测二硫键形成情况，结果也显示三聚体蛋白A中的每一个RBD单体都可形成4对二硫键，与RBD天然结构中二硫键配对结果一致。利用量热差示扫描方法检测三聚体蛋白A的热稳定性，结果如图11所示，Tm值为47.2℃，三聚体蛋白A具有良好的热稳定性。利用透射电镜观察蛋白形态，结果如图12所示，可见三聚体蛋白A粒径较小，约为3-5nm左右，但未观察到更为清晰的形态结构图像。另外，利用表面等离子共振技术检测三聚体蛋白A与hACE受体蛋白的亲和力，结果如图13所示，经过计算KD值为3.19×10-3nM，两者具有高亲和力，证明三聚体蛋白A具有良好的生物学活性。
实施例5：重组新型冠状病毒疫苗制备
将纯化后的蛋白稀释至2倍目标抗原浓度，与1.2mg/ml氢氧化铝佐剂按1:1比例(w/w)混合吸附，并于磁力搅拌器上搅拌40～120min，转速为200～300rpm，获得疫苗半成品，上清残留蛋白含量应低于总蛋白含量的10％，半成品每瓶按0.5ml装量无菌分装后即为疫苗成品。
实施例6：重组新型冠状病毒疫苗免疫学效果评价
将制备的疫苗(如三聚体蛋白A或三聚体蛋白)，分别经腹腔注射免疫BALB/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司，SPF级，雌性，6-8周龄)，2μg/剂/只，分别于0w、3w免疫2针，5w采血分离血清。利用假病毒微量中和试验检测免后小鼠血清针对多种假病毒(如表2所示)的中和活性，结果如图14所示，血清抗体GMT值如表3所示，可见三聚体蛋白A可产生针对多种假病毒的中和活性，对目前引起免疫逃逸突变株以及将来可能出现的突变株具有一定的保护潜力，预期可产生广谱保护能力。
表2.SARS-CoV-2假病毒信息列表
Figure BDA0003120994430000151
Figure BDA0003120994430000161
表3.中和抗体GMT值(假病毒微量中和试验)
Figure BDA0003120994430000162
Figure BDA0003120994430000171
假病毒微量中和试验：利用微量中和试验检测免后血清针对多种假病毒(如表2所示)的中和抗体滴度，假病毒报告基因均为萤火虫荧光素酶，假病毒工作浓度为(1～2)×104TCID50/ml，使用Reed-Muench法计算50％感染抑制率时血清稀释倍数，即为该血清样品的中和抗体滴度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 国药中生生物技术研究院有限公司
<120> 一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用
<130> /
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 219
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<213> Virus
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accccttgca acggcgtgaa gggatttaac tgctatttcc ctctgcagag ctacggcttc 540
caacctacct atggagtggg ctaccaaccc tacagagtgg tggtcctgag cttcgaactg 600
ctgcacgccc ctgccaccgt gtgtggccct aaaaagagca ccaatctcgt gaaaaacaag 660
agagtgcagc ctacagaaag cattgtgaga tttcctaata tcaccaacct gtgccctttc 720
ggcgaggtgt tcaacgctac aagattcgct agcgtgtacg cctggaatag aaagagaatc 780
agcaactgcg tggccgacta cagcgtgctg tacaacagcg cttcctttag caccttcaag 840
tgttacggcg tgagccccac caagctcaac gacctgtgct tcacaaacgt gtacgctgac 900
agcttcgtga tcagaggcga tgaggtgaga cagatcgccc ctggccaaac cggcaacatc 960
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aacaacctgg acagcaaggt gggcggcaac tacaactacc tctatagact gttcagaaaa 1080
tccaacctga agcctttcga gagagacatc tccaccgaga tttatcaagc cggaagcacc 1140
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<213> Artificial
<400> 18
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1 5 10 15
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser
20 25 30
Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
35 40 45
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
50 55 60
Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
85 90 95
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100 105 110
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val
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Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu
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Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
145 150 155 160
Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
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195 200 205
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210 215 220
Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe
225 230 235 240
Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn
245 250 255
Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn
260 265 270
Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys
275 280 285
Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile
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<213> Artificial
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Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys
435

Claims (18)

1.一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白，其特征在于，所述三聚体蛋白是由三个新型冠状病毒RBD区域的亚基组成，所述三聚体蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。
2.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列包含如权利要求1所述的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包含选自信号肽、标签或免疫增强肽中的一种或几种。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码如权利要求1所述的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白，或编码如权利要求2或3所述的融合蛋白的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列为如SEQID No.9所示的核苷酸序列。
6.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求4所述的核酸分子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求4所述的核酸分子或如权利要求6所述的载体。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为CHO细胞。
10.如权利要求1所述的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白或如权利要求2或3所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A）制备如权利要求4所述的核酸分子，构建该核酸分子的表达载体，将表达载体转化或转染至宿主细胞内；
步骤B）利用步骤A）的产物进行蛋白质表达；
步骤C）纯化步骤B）中获得的表达产物，得到所述重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白或融合蛋白。
11.如权利要求1所述的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白、如权利要求2或3所述的融合蛋白、如权利要求4所述的核酸分子、如权利要求6所述的载体或如权利要求7所述的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防新型冠状病毒感染和/或新型冠状病毒引起的疾病的药物中的用途。
12.一种重组蛋白疫苗，其特征在于，所述疫苗包含如权利要求1所述的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白或如权利要求2或3所述的融合蛋白，以及佐剂。
13.根据权利要求12所述的重组蛋白疫苗，其特征在于，所述佐剂为氢氧化铝、磷酸铝、MF59或CpG。
14.根据权利要求13所述的重组蛋白疫苗，其特征在于，所述佐剂为氢氧化铝。
15.如权利要求12、13或14所述的重组蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，将纯化所得的所述重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白或所述融合蛋白与所述佐剂混合。
16.一种基因工程载体疫苗，其特征在于，所述基因工程载体疫苗包含如权利要求4所述的核酸分子。
17.一种核酸疫苗，其特征在于，所述核酸疫苗包含如权利要求4所述的核酸分子。
18.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求12、16或17所述的疫苗，以及药学上可接受的载体。
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