CN114478478B - N-(1-(6-(取代苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)胺/酰胺衍生物及制备方法 - Google Patents

N-(1-(6-(取代苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)胺/酰胺衍生物及制备方法 Download PDF

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Abstract

N‑(1‑(6‑(取代苯基)哒嗪‑3‑基)哌啶‑3‑基)胺/酰胺衍生物及制备方法，属于化学医药领域，N‑(1‑(6‑(取代苯基)哒嗪‑3‑基)哌啶‑3‑基)胺/酰胺衍生物具有式(I)或(II)所示的结构，
Figure DDA0003510161850000011
本发明提供的N‑(1‑(6‑(取代苯基)哒嗪‑3‑基)哌啶‑3‑基)胺/酰胺衍生物可以靶向抑制JMJD6，为治疗与之相关的疾病(如肿瘤)提供新的选择。

Description

N-(1-(6-(取代苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)胺/酰胺衍生物 及制备方法
技术领域
本发明涉及化学医药领域，尤其涉及N-(1-(6-(取代苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)胺/酰胺衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
表观遗传信息在细胞生长和分化中的重要作用。在肿瘤领域，表观遗传学的研究有助于人们解析病人基因组、环境暴露和生活方式等因素之间的关系，进而更好地预防、诊治癌症，促进人类健康。组蛋白是表观遗传修饰中的重要组成部分，组蛋白甲基化的失衡被认为与部分癌症存在密切的关系。以JMJD6为例，研究发现，在乳腺癌细胞中，JMJD6与MED12结合，并最终形成复合体，激活***-***受体增强子，从而促进乳腺癌细胞的生长和肿瘤的发生。因此，迫切需要开发出选择性JMJD6抑制剂，为进一步研究JMJD6生物学功能和治疗JMJD6相关的疾病(如肿瘤)提供选择。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中的上述问题，提供N-(1-(6-(取代苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)胺/酰胺衍生物及其制备方法和应用。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
N-(1-(6-(取代苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)胺/酰胺衍生物，具有以下式(I)或(II)所示的结构：
Figure BDA0003510161830000011
其中R1代表甲氧基、卤素、乙基、氨基或取代氨基；R2和R3代表脂肪烃基，取代或未取代的芳基。
其中R1代表甲氧基、卤素、乙基、氨基或取代氨基；优选甲氧基、氨甲基。
其中，R2和R3代表脂肪烃基，取代或未取代的芳基；优选4-氟-苯基、2,4-二氟-苯基、3,4-二氟-苯基、3,4,5-三氟-苯基、2-氟-5-甲氧基-苯基、2-氯-苯基、2-氯-5-硝基-苯基、3-氯-4-氟苯基、4-氯-苯基、4-氯-3-三氟甲基-苯基、4-溴-苯基、4-溴-3-氟-苯基、4-溴-3-甲氧基-苯基、3-三氟甲基-苯基、4-三氟甲基-苯基、3,5-双三氟甲基-苯基、4-硝基-苯基、2-羧基-苯基、4-二甲氨基-苯基、2,4-二羟基-苯基、3羟基-4-甲氧基-苯基、4-羟基-3-甲氧基-苯基、4-甲氧基-苯基、3,4-二甲氧基-苯基、4-甲氧羰基-苯基、4-甲基-苯基、2-萘基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、6-甲基吡啶-2-基、6-溴-吡啶-2-基、1H-吡唑基-3-基、1H-苯并[d]咪唑-2-基、噻吩-2-基、噻吩-3-基、正丁基、正戊基、正庚基、正辛基、环己基、3-甲基-2-烯基、3-苯基-烯丙基。
一种药物组合物，含有所述的N-(1-(6-(取代苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)胺/酰胺衍生物、或该衍生物在药学上可接受的盐或药学上可接受的载体。
所述在药学上可接受的盐为通式(I)和(II)化合物的酸加成盐，其中用于成盐的酸包括无机酸及有机酸，所述无机酸包括：盐酸、硫酸、磷酸和甲磺酸，有机酸包括乙酸、三氯乙酸、丙酸、丁酸、马来酸、对甲苯磺酸、苹果酸、丙二酸、肉桂酸、柠檬酸、富马酸、樟脑酸、二葡糖酸、天冬氨酸和酒石酸。优选地，本发明中所述的药学上可接受的盐为盐酸盐。
所述药学上可接受的载体指的是对有机体不引起明显的刺激性和不干扰所给予化合物的生物活性和性质的赋形剂或稀释剂。
本发明所述的N-(1-(6-(取代苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)胺/酰胺衍生物或其药学上可接受的盐在制备JMJD6抑制剂药物中的应用。
本发明所述JMJD6抑制剂药物可用于治疗癌症或肿瘤相关疾病，包括乳腺癌、***癌、肺癌、多发性骨髓瘤、白血病、胃癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌以及人神经胶质瘤。
本发明所述的N-(1-(6-(取代苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)胺/酰胺衍生物或其药学上可接受的盐，具有JMJD6抑制活性，对细胞恶性增值肿瘤具有治疗效果。
相对于现有技术，本发明技术方案取得的有益效果是：
本发明衍生物通过调控JMJD6和下游的P53相关信号通路活性，阻断肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，从而可以用于其相关疾病的治疗和预防。
附图说明
图1A为本发明实施例8的实验结果图，显示本发明合成的化合物中中分化合物在40μM浓度下对MCF7细胞的抑制率超过50％。图1B为本发明实施例8的实验结果图，显示化合物WL-004(A)、WL-012(B)、WL-069(C)对肿瘤细胞HepG2的抑制作用。
图2为本发明实施例8的实验结果图，显示化合物WL-004(A)、WL-012(B)、WL-069(C)对肿瘤细胞克隆形成的干预作用。
图3为本发明实施例9的实验结果图，显示化合物WL-012诱导肿瘤细胞凋亡的作用。
图4为本发明实施例11的实验结果图，显示化合物WL-004、WL-012、WL-069对JMJD6下游靶基因P53、P21和PUMA表达的影响。
图5为本发明实施例11的实验结果图，显示化合物WL-004、WL-012、WL-069在浓度梯度(A)和时间梯度(B)下对JMJD6和下游蛋白P53、P21的影响。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚、明白，以下结合附图和实施例，对本发明做进一步详细说明。
本发明提供的N-(1-(6-(取代苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)胺/酰胺衍生物的制备方法：以哌啶-3-基氨基甲酸叔丁酯(1)和3,6-二氯哒嗪(2)为原料，无水四氢呋喃为溶剂，加入碳酸钾后搅拌升温至回流反应，反应结束后加水打浆，过滤的中间体(1-(6-氯哒嗪-3-基)哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯(3)；以(1-(6-氯哒嗪-3-基)哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯(3)为原料，与取代苯硼酸(4)在钯催化剂的作用下发生Suzuki反应，得到中间体(1-(6-(2-取代苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯(5)；在使用1,4-二氧六环/盐酸溶液脱去(1-(6-(2-取代苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯(5)的Boc保护基后，化合物1-(6-(2-取代苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-胺(6)与不同的酰氯或醛缩合得到终产物N-(1-(6-(取代苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)胺/酰胺(7)和(8)。路线如下：
Figure BDA0003510161830000031
在本发明优选实施方案中，R1代表甲氧基、卤素、乙基、氨基或取代氨基；R2代表脂肪烃基，取代或未取代的芳基，优选4-氟-苯基、2,4-二氟-苯基、3,4-二氟-苯基、3,4,5-三氟-苯基、2-氟-5-甲氧基-苯基、2-氯-苯基、2-氯-5-硝基-苯基、3-氯-4-氟苯基、4-氯-苯基、4-氯-3-三氟甲基-苯基、4-溴-苯基、4-溴-3-氟-苯基、4-溴-3-甲氧基-苯基、3-三氟甲基-苯基、4-三氟甲基-苯基、3,5-双三氟甲基-苯基、4-硝基-苯基、2-羧基-苯基、4-二甲氨基-苯基、2,4-二羟基-苯基、3羟基-4-甲氧基-苯基、4-羟基-3-甲氧基-苯基、4-甲氧基-苯基、3,4-二甲氧基-苯基、4-甲氧羰基-苯基、4-甲基-苯基-2-萘基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、6-甲基吡啶-2-基、6-溴-吡啶-2-基、1H-吡唑基-3-基、1H-苯并[d]咪唑-2-基、噻吩-2-基、噻吩-3-基、正丁基、正戊基、正庚基、正辛基、环己基、3-甲基-2-烯基、3-苯基-烯丙基等。具体如下表1所示。
表1
Figure BDA0003510161830000041
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Figure BDA0003510161830000051
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Figure BDA0003510161830000061
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Figure BDA0003510161830000071
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Figure BDA0003510161830000081
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Figure BDA0003510161830000091
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Figure BDA0003510161830000101
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Figure BDA0003510161830000111
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Figure BDA0003510161830000121
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Figure BDA0003510161830000131
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Figure BDA0003510161830000141
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Figure BDA0003510161830000151
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Figure BDA0003510161830000161
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Figure BDA0003510161830000171
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Figure BDA0003510161830000181
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Figure BDA0003510161830000191
本发明中间体的合成如下。
1、(1-(6-氯哒嗪-3-基)哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯(3)的合成：
在干燥的100mL反应瓶中，室温条件下先依次加入哌啶-3-基氨基甲酸叔丁酯(4.00g,20.00mM)，3,6-二氯哒嗪(2)(2.98g,20.00mM)，无水碳酸钾(8.29g,60.00mM)升温至回流，反应24h。薄层色谱法检测反应已结束，停止反应。反应液减压浓缩除溶剂后，加水打浆，乙酸乙酯重结晶后得到(1-(6-氯哒嗪-3-基)哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯(3)5.4g，收率87％。波谱数据：ESI-MS(-):m/z 311.1[M-H]-。
2、(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯(5-1)的合成：
在干燥的100mL反应瓶中，室温条件下先依次加入(1-(6-氯哒嗪-3-基)哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯(3)(1.56g,5.00mM)，2-甲氧基苯硼酸(4-1)(0.85g,5.60mM)，无水碳酸钠(2.12g,20.00mM)，[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.36g,0.50mM)，再加20mL1,4-二氧六环和10mL水溶解，除去氧气后，在氮气保护的条件下加热回流10h。薄层色谱法检测反应已结束，停止反应，加水稀释后用二氯甲烷萃取三次，饱和氯化钠反萃后有机相加入无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，有机相浓缩后用硅胶拌样，快速硅胶柱纯化得到白色结晶状固体1.1g，收率57％。波谱数据：ESI-MS(+):m/z 385.2[M+H]+。
3、(1-(6-(2-氯苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯(5-2)的合成：
反应同步骤2，将2-甲氧基苯硼酸(4-1)(0.85g,5.60mM)换成2-氯苯硼酸(4-2)(0.88g,5.60mM)，最后分离得到浅黄色固体1.20g，收率62％。波谱数据：ESI-MS(+):m/z389.2[M+H]+。
4、(1-(6-(2-乙基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯(5-3)的合成：
反应同步骤2，将2-甲氧基苯硼酸(4-1)(0.85g,5.60mM)换成2-乙基苯硼酸(4-2)(0.84g,5.60mM)，最后分离得到浅黄色油状固体1.26g，收率66％。波谱数据：ESI-MS(+):m/z 383.2[M+H]+。
5、1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-胺(6-1)的合成：
在干燥的100mL反应瓶中，室温条件下依次加入(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯(5-1)(500mg,1.30mM)，10mL 1,4-二氧六环和5mL浓盐酸，室温反应6h，薄层色谱法检测反应已结束，停止反应。减压蒸除1,4-二氧六环和浓盐酸。加水溶解后用饱和碳酸钠溶液将pH调至8.0后，二氯甲烷萃取三次，饱和氯化钠反萃后有机相加入无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，有机相浓缩后用硅胶拌样，快速硅胶柱纯化得白色固体状产物0.33g，收率89％。波谱数据：ESI-MS(+)：m/z 285.2[M+H]+。
6、1-(6-(2-氯苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-胺(6-2)的合成：
反应同步骤3，将(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯(5-1)(500mg,1.30mM)换成(1-(6-(2-氯苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯(5-2)(500mg,1.29mM)，最后分离得到白色固体0.3g，收率81％。波谱数据：ESI-MS(+)：m/z289.1[M+H]+。
7、1-(6-(2-乙基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-胺(6-3)的合成：
反应同步骤3，将(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯(5-1)(500mg,1.30mM)换成(1-(6-(2-乙基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯(5-3)(500mg,1.31mM)，最后分离得到浅黄色油状固体0.35g，收率95％。波谱数据：ESI-MS(+)：m/z 283.2[M+H]+。
8、叔丁基(2-(6-(3-氨基哌啶-1-基)哒嗪-3-基)苯基)氨基甲酸酯(6-4)的合成：
反应同步骤2，将(1-(6-氯哒嗪-3-基)哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯(3)(1.56g,5.00mM)换成1-(6-氯哒嗪-3-基)哌啶-3-胺(7)(1.06g,5.00mM)，2-甲氧基苯硼酸(4-1)(0.85g,5.60mM)换成2-BOC-氨基苯基硼酸频哪醇酯(1.79g,5.60mM)，最后分离得到白色固体0.98g，收率53％。波谱数据：ESI-MS(+)：m/z 370.2[M+H]+。
实施例1：N-(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)-4-甲基苯甲酰胺(WL-001)的制备
在干燥的20mL反应瓶中依次加入1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-胺(6-1)(142mg,0.5mmol)，对甲基苯甲酰氯(77mg,0.5mmol)，三乙胺(209μL,1.5mmol)，二氯甲烷(10mL)，0℃下反应4h。薄层色谱法检测反应已结束，停止反应。反应液加水，DCM萃取3次，弃水合并有机相后饱和氯化钠反萃，无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，有机相浓缩后用硅胶拌样，再用柱层析硅胶色谱分离纯化(等度洗脱方法，二氯甲烷:甲醇＝100:1，v/v)，得白色固体状产物N-(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)-4-甲基苯甲酰胺120mg，收率60％。
本发明所列举的化合物：4-氯-N-(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(WL-002)、3,4-二氯-N-(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(WL-003)、4-甲氧基-N-(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(WL-004)、4-氟-N-(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(WL-005)、2-氯-N-(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(WL-006)、N-(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)肉桂酰胺(WL-007)、2-氯-N-(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)-5-硝基苯甲酰胺(WL-008)、N-(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)-4-硝基苯甲酰胺(WL-009)、4-((1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)氨甲酰)苯甲酸甲酯(WL-010)、4-溴-N-(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(WL-011)、3-氯-4-氟-N-(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(WL-012)、2,4-二氟-N-(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(WL-013)、3,4-二氟-N-(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(WL-014)、N-(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)-3-(三氟甲基)苯甲酰胺(WL-015)、N-(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)-4-(三氟甲基)苯甲酰胺(WL-016)、N-(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)-3,5-二(三氟甲基)苯甲酰胺(WL-017)、3,4,5-三氟-N-(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(WL-018)、N-(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)-2-萘酰胺(WL-019)、N-(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)-3-甲基-2-烯酰胺(WL-020)、N-(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)辛酰胺(WL-021)、N-(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)烟酰胺(WL-022)、N-(1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-2-基)吡啶酰胺(WL-023)与化合物WL-001合成方法类似。
实施例2：4-((1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)氨基)甲基)苯-1,3-二醇(WL-024)的制备
在干燥的20mL反应瓶中依次加入1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-胺(6-1)(142mg,0.5mmol)，2,5-二羟基苯甲醛(69mg,0.5mmol)，三乙酰氧基硼氢化钠(318mg,1.5mmol)，二氯甲烷(10mL)，0℃下反应8h。薄层色谱法检测反应已结束，停止反应。反应液减压蒸馏，二氯甲烷溶解后加水洗涤3次，饱和氯化钠反萃后有机相加入无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，有机相浓缩后用硅胶拌样后，再用柱层析硅胶色谱分离纯化(等度洗脱方法，二氯甲烷:甲醇＝100:1，v/v)，得白色固体状产物4-((1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)氨基)甲基)苯-1,3-二醇105mg，收率52％。
本发明所列举的化合物：2-甲氧基-4-((1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)氨基)甲基)苯酚(WL-025)、3-((1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)氨基)甲基)苯甲酸(WL-026)、2-甲氧基-5-((1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)氨基)甲基)苯酚(WL-027)、N-(环己基甲基)-1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-胺(WL-028)、N-(3,4-二甲氧基苄基)-1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-胺(WL-029)、1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)-N-(4-甲基苄基)哌啶-3-胺(WL-030)、1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)-N-(4-硝基苄基)哌啶-3-胺(WL-031)、N-(4-氯-3-(三氟甲基)苄基)-1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-胺(WL-032)、N-(4-溴-3-氟苄基)-1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-胺(WL-033)、N-(4-(二甲氨基)苄基)-1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-胺(WL-034)、N-(4-溴-3-甲氧基苄基)-1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-胺(WL-035)、1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)-N-(4-(三氟甲基)苄基)哌啶-3-胺(WL-036)、N-(2-氟-5-甲氧基苄基)-1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-胺(WL-037)、1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)-N-(吡啶-2-基甲基)哌啶-3-胺(WL-038)、N-((1H-吡唑基-3-基)甲基)-1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-胺(WL-039)、1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)-N-((6-甲基吡啶-2-基)甲基)哌啶-3-胺(WL-040)、N-((1H-苯并[d]咪唑-2-基)甲基)-1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-胺(WL-041)、N-((6-溴吡啶-2-基)甲基)-1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-胺(WL-042)、1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)-N-(吡啶-3-基甲基)哌啶-3-胺(WL-043)、1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)-N-(吡啶-4-基甲基)哌啶-3-胺(WL-044)、1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)-N-(噻吩-2-基甲基)哌啶-3-胺(WL-045)、1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)-N-(噻吩-3-基甲基)哌啶-3-胺(WL-046)、1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)-N-戊基哌啶-3-胺(WL-047)、N-己基-1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-胺(WL-048)、1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)-正辛基哌啶-3-胺(WL-049)、1-(6-(2-甲氧基苯基)哒嗪-3-基)-N-壬基哌啶-3-胺(WL-050)与化合物WL-024合成方法类似。
实施例3：4-氯-N-(1-(6-(2-氯苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(WL-051)的制备
在干燥的20mL反应瓶中依次加入1-(6-(2-氯苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-胺(6-2)(144mg,0.5mmol)，4-氯苯甲酰氯(88mg，0.5mmol)，三乙胺(209μL,1.5mmol)，二氯甲烷(10mL)，0℃下反应4h。薄层色谱法检测反应已结束，停止反应。反应液加水，DCM萃取3次，弃水合并有机相后饱和氯化钠反萃，无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，有机相浓缩后用硅胶拌样，再用柱层析硅胶色谱分离纯化(等度洗脱方法，二氯甲烷:甲醇＝100:1，v/v)，得白色固体状产物4-氯-N-(1-(6-(2-氯苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺95mg，收率45％。
本发明所列举的化合物：N-(1-(6-(2-氯苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)-4-甲氧基苯甲酰胺(WL-052)、4-溴-N-(1-(6-(2-氯苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(WL-053)、4-氯-N-(1-(6-(2-氯苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)-3-氟苯甲酰胺(WL-054)、3,4-二氯-N-(1-(6-(2-氯苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(WL-055)与化合物WL-051合成方法类似。
实施例4：4-氯-N-(1-(6-(2-乙基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(WL-056)的制备
在干燥的20mL反应瓶中依次加入1-(6-(2-乙基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-胺(6-3)(141mg,0.5mmol)，4-氯苯甲酰氯(88mg，0.5mmol)，三乙胺(209μL,1.5mmol)，二氯甲烷(10mL)，0℃下反应4h。薄层色谱法检测反应已结束，停止反应。反应液加水，DCM萃取3次，弃水合并有机相后饱和氯化钠反萃，无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，有机相浓缩后用硅胶拌样，再用柱层析硅胶色谱分离纯化(等度洗脱方法，二氯甲烷:甲醇＝100:1，v/v)，得白色固体状产物4-氯-N-(1-(6-(2-乙基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺127mg，收率61％。
本发明所列举的化合物：4-甲氧基-N-(1-(6-(2-乙基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(WL-057)、4-溴-N-(1-(6-(2-乙基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(WL-058)、4-氯-N-(1-(6-(2-乙基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)-3-氟苯甲酰胺(WL-059)、3,4-二氯-N-(1-(6-(2-乙基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(WL-060)与化合物WL-056合成方法类似。
实施例5：叔丁基(2-(6-(3-(4-氯苯甲酰胺基)哌啶-1-基)哒嗪-3-基)苯基)氨基甲酸酯(WL-071)的制备
在干燥的20mL反应瓶中依次加入叔丁基(2-(6-(3-氨基哌啶-1-基)哒嗪-3-基)苯基)氨基甲酸酯(6-4)(185mg,0.5mmol)，4-氯苯甲酰氯(88mg，0.5mmol)，三乙胺(209μL,1.5mmol)，二氯甲烷(10mL)，0℃下反应4h。薄层色谱法检测反应已结束，停止反应。反应液加水，DCM萃取3次，弃水合并有机相后饱和氯化钠反萃，无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，有机相浓缩后用硅胶拌样，再用柱层析硅胶色谱分离纯化(等度洗脱方法，二氯甲烷:甲醇＝100:1，v/v)，得黄色油状产物叔丁基(2-(6-(3-(4-氯苯甲酰胺基)哌啶-1-基)哒嗪-3-基)苯基)氨基甲酸酯130mg，收率51％。
本发明所列举的化合物：叔丁基(2-(6-(3-(4-甲氧基苯甲酰胺基)哌啶-1-基)哒嗪-3-基)苯基)氨基甲酸酯(WL-072)、叔丁基(2-(6-(3-(4-溴苯甲酰胺基)哌啶-1-基)哒嗪-3-基)苯基)氨基甲酸酯(WL-073)、叔丁基(2-(6-(3-(4-氯-3-氟苯甲酰胺基)哌啶-1-基)哒嗪-3-基)苯基)氨基甲酸酯(WL-074)、叔丁基(2-(6-(3-(3,4-二氯苯甲酰胺基)哌啶-1-基)哒嗪-3-基)苯基)氨基甲酸酯(WL-075)与化合物WL-071合成方法类似。
实施例6：N-(1-(6-(2-氨基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)-4-氯苯甲酰胺(WL-061)的制备
在干燥的20mL反应瓶中依次加入叔丁基(2-(6-(3-(4-氯苯甲酰胺基)哌啶-1-基)哒嗪-3-基)苯基)氨基甲酸酯(WL-071)(250.0mg,0.5mmol)溶于二氯甲烷:三氟乙酸(2:1,v/v)的体系中室温搅拌反应4h。减压蒸除二氯甲烷和三氟乙酸，将残留固体继续用二氯甲烷溶解，饱和碳酸钠溶液洗涤后，再用饱和氯化钠反萃有机相，有机相加入无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，有机相浓缩后用硅胶拌样，用柱层析硅胶色谱分离纯化(二氯甲烷:甲醇:7M氨甲醇＝100:1:1，v/v/v)，得到黄色固体N-(1-(6-(2-氨基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)-4-氯苯甲酰胺190mg，收率93％。
本发明所列举的化合物：N-(1-(6-(2-氨基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)-4-甲氧基苯甲酰胺(WL-062)、N-(1-(6-(2-氨基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)-4-溴苯甲酰胺(WL-063)、N-(1-(6-(2-氨基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)-4-氯-3-氟苯甲酰胺(WL-064)、N-(1-(6-(2-氨基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)-3,4-二氯苯甲酰胺(WL-065)与化合物WL-061合成方法类似。
实施例7：4-氯-N-(1-(6-(2-(甲胺基)苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(WL-066)的制备
在干燥的20mL反应瓶中依次加入N-(1-(6-(2-氨基苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)-4-氯苯甲酰胺(WL-061)(200.0mg,0.5mmol)，碘甲烷(31μL，0.5mmol)，无水碳酸钾(207mg,1.5mmol)，丙酮(10mL)，0℃下反应20h。薄层色谱法检测反应已结束，停止反应。反应液减压蒸馏，将残留固体继续用二氯甲烷溶解，饱和碳酸钠溶液洗涤后，再用饱和氯化钠反萃有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，有机相浓缩后用硅胶拌样，再用柱层析硅胶色谱分离纯化等度洗脱方法，二氯甲烷:甲醇＝100:1，v/v)，得黄色粉末状产物4-氯-N-(1-(6-(2-(甲胺基)苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺50mg，收率24％。
本发明所列举的化合物：4-甲氧基-N-(1-(6-(2-(甲胺基)苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(WL-067)、4-溴-N-(1-(6-(2-(甲胺基)苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(WL-068)、3-氯-4-氟-N-(1-(6-(2-(甲胺基)苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(WL-069)、3,4-二氯-N-(1-(6-(2-(甲胺基)苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(WL-070)与化合物WL-066合成方法类似。
实施例8：肿瘤细胞的增值抑制活性的筛选
本实施例对本发明所涉及化合物用MTT法进行了化合物肿瘤增值抑制实验，首先，10.0μM化合物处理MCF7细胞株72h，结果显示部分化合物表现出了较好的体外抗肿瘤活性，其中化合物WL-002、WL-003、WL-004、WL-012、WL-069的活性最好。再对以上5个化合物进行进一步的改造后，测试这一系列化合物及其衍生物的IC50，发现大部分化合物对测试的肿瘤细胞表现出明显的增值抑制活性，化合物的IC50<40.0μM(图1A)，其中WL-004、WL-012、WL-069等化合物的IC50小于10.0μM，结果如图1B示。MTT实验操作：接种3000个细胞/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁12h后，在肿瘤细胞加入10％血清培养基溶解的不同浓度化合物再培养72h后，每孔加入20μL的MTT试剂，培养箱中孵育3-5h，于490nm测吸光度。
化合物WL-004、WL-012、WL-069在肿瘤细胞MCF 7中又进行了克隆形成实验：接种1000个细胞于六孔板中，WL-004、WL-012、WL-069的加药浓度分别为1.0μM、2.5μM、5.0μM、10.0μM和15.0μM，每隔三天换一次培养基，培养15天后置于显微镜中观察，发现对照组细胞已形成单克隆，使用0.1％的结晶紫染色液对细胞团进行染色，实验结果显示WL-004在5.0μM时，WL-012、WL-069在2.5μM时便具有显著的细胞增殖抑制作用，结果如图2所示。
实施例9：诱导肿瘤细胞凋亡实验
本发明所涉及化合物对细胞凋亡的诱导作用：对本发明涉及化合物在MCF7细胞中进行了细胞的凋亡实验，基于Annexin V-FITC/PI双染应用流式细胞术来检测化合物WL-012对细胞凋亡的诱导作用，加药浓度依次为5.0μM、10.0μM、15.0μM和20.0μM，10％血清加药时间为72h，结果如图3示，WL-012浓度依赖性的诱导细胞凋亡。
实施例10：化合物对JMJD6下游相关蛋白的调控作用
通过Q-PCR和Western-blot实验检测了本发明涉及化合物对JMJD6下游相关蛋白P53，P21和PUMA的影响。实验结果显示，大部分的化合物对肿瘤细胞MCF7中P53，P21的表达具有激活效果，这与相关文献中JMJD6被抑制后P53，P21和PUMA表达增加的结论相吻合。其中，化合物WL-004、WL-012、WL-069以时间/浓度依赖性的方式上调P53，P21和PUMA的表达(见图4和图5)。

Claims (5)

1.N-(1-(6-(取代苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)胺/酰胺衍生物，其特征在于具有以下式(I)或(II)所示的结构：
Figure FDA0004152870340000011
其中，R1代表甲氧基、卤素、乙基、氨基；R2和R3代表4-氟-苯基、2,4-二氟-苯基、3,4-二氟-苯基、3,4,5-三氟-苯基、2-氟-5-甲氧基-苯基、2-氯-苯基、2-氯-5-硝基-苯基、3-氯-4-氟苯基、4-氯-苯基、4-氯-3-三氟甲基-苯基、4-溴-苯基、4-溴-3-氟-苯基、4-溴-3-甲氧基-苯基、3-三氟甲基-苯基、4-三氟甲基-苯基、3,5-双三氟甲基-苯基、4-硝基-苯基、2-羧基-苯基、4-二甲氨基-苯基、2,4-二羟基-苯基、3-羟基-4-甲氧基-苯基、4-羟基-3-甲氧基-苯基、4-甲氧基-苯基、3,4-二甲氧基-苯基、4-甲氧羰基-苯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、6-甲基吡啶-2-基、6-溴-吡啶-2-基、1H-吡唑基-3-基、1H-苯并[d]咪唑-2-基、噻吩-2-基、噻吩-3-基、正丁基、正戊基、正庚基、正辛基、环己基、3-甲基-2-烯基、3-苯基-烯丙基。
2.如权利要求1所述的N-(1-(6-(取代苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)胺/酰胺衍生物，其特征在于：所述R1优选甲氧基或氨甲基。
3.权利要求1～2任一项所述的N-(1-(6-(取代苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)胺/酰胺衍生物的制备方法，其特征在于反应路线为：
Figure FDA0004152870340000012
4.一种药物组合物，其特征在于：含有权利要求1～2任一项所述的N-(1-(6-(取代苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)胺/酰胺衍生物、或该衍生物在药学上可接受的盐或药学上可接受的载体。
5.权利要求1～2任一项所述的N-(1-(6-(取代苯基)哒嗪-3-基)哌啶-3-基)胺/酰胺衍生物、权利要求3所制备的衍生物或权利要求4所述药物组合物的应用，其特征在于：用于制备抗肿瘤药物中的应用。
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