CN114460197A - 一种定量检测农产品中有机硒含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种定量检测农产品中有机硒含量的方法，所述方法包括以下步骤：(1)待测农产品总硒含量的测量；(2)利用高效液相色谱和电感耦合等离子体质谱仪组合而成的HPLC‑ICP‑MS联用***，以甲醇和柠檬酸二铵缓冲液为流动相，对标准硒形态溶液和所述农产品的无机硒浓缩提取液进行测定：(3)采用外标法对样品中的***根(SeO₃ ^2‑)和硒酸根(SeO₄ ^2‑)进行定量分析，相加即可得样品中无机硒含量；(4)采用差减法即可得样品中的有机硒含量。采用本方法检测植物硒形态，形态分离完全，流动相配制方便，实验操作简单，定量分析得出的结果准确可靠，检测迅速。

Description

一种定量检测农产品中有机硒含量的方法

技术领域

本发明涉及一种定量检测农产品中有机硒含量的方法，属于分析测试领域。

背景技术

目前检测无机硒含量的方法，有杭州地标《稻米中有机硒和无机硒含量的测定原子荧光光谱法》(DB 3301/T 117-2007)以及湖北地标《湖北省食品安全地方标准富有机硒食品硒含量要求》(DBS 42/002-2014)。

其中，湖北地标的方法是将水相中的硒经过环己烷萃取以除去部分有机硒，剩下的水溶性硒经过消化处理后，都计算为无机硒。通过总硒减去无机硒含量，得到有机硒的含量，属于水提差减法。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种定量检测农产品中有机硒含量的方法，优化了定量方法，排除实验干扰，提高检测效率与准确率。

为了实现上述目的，本发明提供了一种定量检测农产品中有机硒含量的方法，包括以下步骤：

(1)待测农产品中的总硒含量的测量；

(2)分析仪器***配置：将高效液相色谱和电感耦合等离子体质谱仪组合成HPLC-ICP-MS联用***；

所述高效液相色谱中的流动相为甲醇和柠檬酸二铵缓冲液；

(3)样品处理：向待测样品中加入超纯水和甲醇混匀，水浴超声提取后吸取上清液浓缩至干燥后复溶待测；

(4)对标准硒形态溶液和所述样品的硒形态酶解液进行测定，采用外标法对样品中的***根(SeO₃ ^2-)和硒酸根(SeO₄ ^2-)进行定量分析；

(5)用样品总硒含量减去色谱所得无机硒含量即可得样品中的有机硒含量。

优选地，其中步骤(1)中，所述总硒检测方法参考食品安全国家标准《食品中硒的测定GB 5009.93-2017》中的微波消解-电感耦合等离子体质谱法。

优选地，其中步骤(3)中，所述超纯水用量为10-20ml，甲醇用量为5-15ml，优选为超纯水15ml，甲醇10ml。

优选地，其中步骤(3)中，所述甲醇的纯度为色谱纯。

优选地，其中步骤(3)中，所述超声提取时长为30-60min。

优选地，其中步骤(3)中，所述过滤的滤膜使用的是Sep-Pak C18一次性小柱。

优选地，其中步骤(3)中，使用冷冻离心真空浓缩仪对提取液进行浓缩。

优选地，其中步骤(3)中，浓缩时仪器处在-25℃真空环境。

优选地，其中步骤(4)中，所述标准硒形态溶液包括***根和硒酸根两种种硒形态标准样品储备液，其中每种硒形态标准样品储备液的浓度分别为0、10、20、50、100、150μg/L(以硒计)。

相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明采用水提色谱法，通过HPLC-ICP-MS联用技术，用外标法对样品进行定量分析，能检测出农产品中的***根(SeO₃ ^2-)和硒酸根(SeO₄ ^2-)的具体含量从而计算出待测农产品中的有机硒含量。该提取方法简单快捷，流动相配制简便，分析结果准确可靠。本发明相比于现有水提差减法等对元素形态的选择性更好，稳定性更强，数据更精确。

附图说明

图1为本发明实施例的青菜样品1无机硒提取液的色谱图。

图2为本发明实施例的沃柑样品2无机硒提取液的色谱图。

图3为本发明实施例的脐橙样品3无机硒提取液的色谱图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的一种定量检测农产品中有机硒含量的方法其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构或特点可由任何合适形式组合。

若没有特殊说明，所涉及的组分均为本领域技术人员熟知的市售商品，若没有特殊说明，所涉及的方法皆为常规方法。

本发明的实施方式提供了一种定量检测农产品中有机硒含量的方法，包括以下步骤：

(1)待测农产品中的总硒含量的测量；所述农产品可以为日常可食用的蔬菜、水果等农产品，在此不做具体限定。

(2)分析仪器***配置：将高效液相色谱和电感耦合等离子体质谱仪组合成HPLC-ICP-MS联用***；

所述高效液相色谱中的流动相为甲醇(2％(v/v))和柠檬酸二铵缓冲液(6mmol/L)；

(3)样品处理：向待测样品中加入15ml超纯水和10ml甲醇混匀，水浴超声提取后吸取上清液浓缩至干燥后复溶待测；

(4)对标准硒形态溶液和所述样品的硒形态酶解液进行测定，采用外标法对样品中的***根(SeO₃ ^2-)和硒酸根(SeO₄ ^2-)进行定量分析；

(5)用样品总硒含量减去色谱所得无机硒含量即可得样品中的有机硒含量。

在一些实施例中，可选地，步骤(1)中，所述总硒检测方法参考食品安全国家标准《食品中硒的测定GB 5009.93-2017》中的微波消解-电感耦合等离子体质谱法。

在一些实施例中，可选地，步骤(3)中，所述甲醇的纯度为色谱纯，这样可以最大限度保护仪器。如选择分析纯、优级纯会使仪器噪声变大，可能会导致结果不准。

在一些实施例中，可选地，步骤(3)中，所述超声提取时长为30-60min，优选为40-45min，这样优选后能在保证提取效果的前提下最大限度降低时间成本。若低于30min，可能会导致提取不完全；若高于60min会导致增加成本。

在一些实施例中，可选地，步骤(3)中，所述过滤的滤膜使用的是Sep-Pak C18固相萃取一次性小柱。固相萃取结合了选择性保留、选择性洗脱等过程，可以确保洗脱的高回收率和重现性。

在一些实施例中，可选地，步骤(3)中，使用冷冻离心真空浓缩仪对提取液进行浓缩，这样离心作用可以防止样品之间交叉污染。

在一些实施例中，可选地，步骤(3)中，当冷井温度达到-105℃时，浓缩机温度调至-4℃，这样可以使溶剂升华，达到样品干燥要求。

在一些实施例中，可选地，步骤(4)中，所述标准硒形态溶液包括***根和硒酸根两种硒形态标准样品储备液，其中每种硒形态标准样品储备液的浓度分别为0、10、20、50、100、150μg/L(以硒计)。选0-150ppb是因为大部分农产品的水提液总硒都在这个标曲范围内；选6个点是为了更好地绘制标准曲线。

下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不能理解为是对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员根据上述本发明的内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例提供了一种定量检测农产品中有机硒含量的方法，包括以下步骤：

(1)待测样品总硒测定

总硒检测方法参考食品安全国家标准《食品中硒的测定GB 5009.93-2017》中的微波消解-电感耦合等离子体质谱法。所述农产品为青菜、沃柑或脐橙。

(2)分析仪器***配置

将高效液相色谱和电感耦合等离子体质谱仪组合成一个HPLC-ICP-MS联用***。

用高效液相色谱对***根(SeO₃ ^2-)和硒酸根(SeO₄ ^2-)等硒形态进行完全分离；在电感耦合等离子体质谱仪上得出色谱图，见图1-图3。从图1中仅仅可以看出硒代蛋氨酸的色谱峰，可知样品1不含无机硒，其有机硒含量即为总硒含量；从图2-图3中可以看出硒代半膀胱氨酸和***根的色谱峰，所以样品2及样品3的有机硒含量为总硒含量减去***根含量。

(3)仪器分析方法

称取1.13g柠檬酸二铵并加入850ml超纯水预溶，用玻璃棒搅拌均匀；加入20ml冷冻(-20℃)色谱纯甲醇，使用10wt％的稀盐酸调节pH值至5.7后定容至1L；使用0.22μm滤膜对流动相进行抽滤，之后将制备好的流动相超声脱气15min(目的是将流动相中的空气除去)，得到流动相；

(4)混合标准品的配置

称取***钠，用水定容，4℃避光保存。制成浓度为1mg/ml的***钠(SeO₃ ^2-)标准溶液。

称取硒酸钠，用水定容，4℃避光保存。制成浓度为1mg/ml的硒酸钠(SeO₄ ^2-)标准溶液。

将上述标准溶液逐级稀释1000倍至1mg/L，分别吸取0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5ml，用超纯水定容至10ml，配置成混合标准液，其中每种硒形态标准样品储备液的浓度分别为0、10、20、50、100、150μg/L(以硒计)，用0.22μm水相滤膜过滤后使用。

(5)样品的处理

称取待测样品1.0g(精确至0.0001g)于玻璃瓶中，依次加入15ml超纯水和10ml甲醇混匀，37℃水浴超声提取45min后过Sep-Pak C18一次性小柱，转移到50mL锥形聚丙烯管中，用冷冻离心真空浓缩仪将上清液浓缩直至完全干燥或呈冻状(具体地，当冷井温度达到-105℃时，浓缩机温度调至-4℃浓缩直至完全干燥或呈冻状，即无液体的状态)，加入2mL超纯水使样品复溶，转移到微型离心管中，4℃，10000r/min离心20min后，用移液枪转移管中的上清液至HPLC专用进样瓶。

(6)有机硒含量测定

采用外标法对样品中***根(SeO₃ ^2-)和硒酸根(SeO₄ ^2-)进行定量分析得出无机硒含量；所述外标法为：首先用待测组份的标准样品绘制工作曲线，测出各峰的峰高或峰面积对应的样品浓度，绘制出标准曲线。实际应用时，测出峰高或峰面积对应标准曲线，就可以得到样品浓度。用总硒减去无机硒计算出样品中的有机硒含量。而现有的方法(如背景技术部分中提及的杭州地标)默认水提溶液中全是无机硒，只是单纯地用样品总硒减去水提液总硒得出有机硒；而本实施例多了一个步骤，即用色谱法检测水提液，得出水提液中准确的无机硒含量，最后用样品总硒含量减去水提液中的无机硒含量，即可得出有机硒含量。

根据HPLC-ICP-MS(高效液相色谱仪(HPLC，日本岛津LC-20A)，X series2型ICP-MS(ThermoFisher)作为HPLC的在线监测装置，搭建HPLC-ICP-MS联用检测***)联用检测样品1～3，用外标法测量出样品中无机硒含量，见表1。

根据微波消解-电感耦合等离子体质谱法流程(GB 5009.93-2017)检测样品1-3总硒及样品1-3水提无机硒上清液总硒，见表2。

表1色谱法测样品水提上清液中的无机硒含量

注：SeO₃ ^2-、SeO₄ ^2-分别为***根离子和硒酸根离子，N.D.表示未检出。

表2样品水提上清液总硒及样品总硒

根据现有水提差减法得出样品1的有机硒含量，根据本发明的水提色谱法得出样品1的有机硒含量，具体数据见表3。

表3样品不同检测方法下的有机硒含量

由表3结果可知，水提差减法得出的有机硒含量只是用样品总硒减去水提上清液总硒得出，该方法默认水提上清液中只含有无机硒，有失偏颇；本发明采用的水提色谱法则是明确得出水提上清液中的无机硒含量，如实施例1中的样品1，提取液中无机硒含量为0(见表1)，说明该样品中的硒全为有机形态，则有机硒含量即为总硒含量。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种定量检测农产品中有机硒含量的方法，其特征在于，利用高效液相色谱和电感耦合等离子体质谱仪组合，对标准硒形态溶液和所述样品的无机硒浓缩提取液进行测定，采用外标法对样品中的***根和硒酸根进行定量分析，采用差减法即可得样品中的有机硒含量。

2.根据权利要求1所述的定量检测农产品中有机硒含量的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

1)测量待测农产品中的总硒含量；

2)分析仪器***配置：将高效液相色谱和电感耦合等离子体质谱仪组合成HPLC-ICP-MS联用***；

所述高效液相色谱中的流动相为甲醇和柠檬酸二铵缓冲液；

3)样品处理：称取待测样品于带盖玻璃瓶中，加入超纯水和甲醇混匀，水浴超声提取后过滤，得到无机硒提取液，将提取液浓缩至完全干燥，复溶后待测；

4)对标准硒形态溶液和所述样品的无机硒提取液进行测定，用外标法对样品中的***根(SeO₃ ^2-)和硒酸根(SeO₄ ^2-)进行定量分析；

5)采用差减法计算样品中的有机硒含量。

3.如权利要求2所述的定量检测农产品中有机硒含量的方法，其特征在于，步骤1)中，所述总硒检测方法参考食品安全国家标准《食品中硒的测定GB 5009.93-2017》中的微波消解-电感耦合等离子体质谱法。

4.如权利要求2所述的定量检测农产品中有机硒含量的方法，其特征在于，步骤3)中，所述待测样品称样量为0.8-1.2g。

5.如权利要求2所述的定量检测农产品中有机硒含量的方法，其特征在于，步骤3)中，所述超纯水用量为10-20ml，甲醇用量为5-15ml。

6.如权利要求2所述的定量检测农产品中有机硒含量的方法，其特征在于，步骤3)中，所述甲醇纯度为色谱纯；所述水浴超声提取时长为30-60min。

7.如权利要求2所述的定量检测农产品中有机硒含量的方法，其特征在于，步骤3)中，所述过滤使用的是Sep-Pak C18固相萃取一次性小柱。

8.如权利要求2所述的定量检测农产品中有机硒含量的方法，其特征在于，步骤3)中，使用冷冻离心真空浓缩仪对剩余提取液进行浓缩。

9.如权利要求2所述的定量检测农产品中有机硒含量的方法，其特征在于，步骤3)中，浓缩时仪器处于-4℃～0℃真空环境中。

10.如权利要求2所述的定量检测农产品中有机硒含量的方法，其特征在于，步骤4)中，所述标准硒形态溶液包括***根和硒酸根两种硒形态标准样品储备液，其中每种硒形态标准样品储备液以硒计的浓度分别为0、10、20、50、100、150μg/L。

Images