CN103543221A

CN103543221A - 同时检测牛奶中多种霉菌毒素的方法

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Publication number: CN103543221A
Application number: CN201310461017.2A
Authority: CN
Inventors: 王加启; 郑楠; 黄良策; 程建波; 李松励; 张养东
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-09-30
Filing date: 2013-09-30
Publication date: 2014-01-29

Abstract

本发明公开了一种同时检测牛奶中多种霉菌毒素的方法，该方法包括以下步骤：（1）提取牛奶中的霉菌毒素，得到霉菌毒素粗提取物；（2）将霉菌毒素粗提取物纯化、浓缩；（3）浓缩后的霉菌毒素上色谱柱，用流动相梯度洗脱，收集洗脱物；（4）将收集的洗脱物用质谱仪进行定性定量检测。本发明建立了一种高效、灵敏、稳定的同时检测牛奶中黄曲霉毒素M₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉烯醇的方法。本发明在生鲜乳、液态奶和奶粉中验证了本发明检测方法的线性、灵敏度、回收率、精确性和重现性，验证结果证明本发明检测方法线性范围好、灵敏度高、可信性好、稳定性强。

Description

同时检测牛奶中多种霉菌毒素的方法

技术领域

本发明涉及一种检测牛奶中霉菌毒素的方法，尤其涉及一种采用液相色谱串联质谱法同时检测牛奶中黄曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉烯醇的方法，属于牛奶中霉菌毒素的检测领域。

背景技术

牛奶已成为人们生活的必需品，尤其婴幼儿牛奶是母乳的最佳替代品，但霉菌毒素已成为牛奶的主要质量安全风险因子之一，严重威胁人类健康。霉菌毒素在牛奶加工过程中，无论是巴氏杀菌还是高温杀菌均无法降解霉菌毒素，霉菌毒素可以完整残留至奶产品中，因此，牛奶中霉菌毒素越来越受到人们的广泛关注，特别是黄曲霉毒素M₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉烯醇因其污染程度和毒性而受到重视。

目前，奶业发达国家已经积极监测牛奶中霉菌毒素污染状况，但在中国相关报道较少，这可能与缺少高通量的检测技术存在一定关系。传统的检测方法各有其优缺点。酶联免疫吸附法作为当今最具代表性的快速检测方法，已广泛应用于霉菌毒素分析检测，但由于假阳性和不能精确定量等缺点限制了其进一步应用。因此，基于薄层色谱法、气相色谱、高压液相色谱等技术的定量检测方法已经建立，但这些方法只能检测一种或一类霉菌毒素，已不能满足现代奶业中霉菌毒素的监测和科研需求。近年来，超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）因其高灵敏、高选择性和高通量已成为多霉菌毒素分析的最普遍方法，广泛应用于食品、饲料、血浆、尿液和中草药中霉菌毒素的检测。随着人们日益关注牛奶中霉菌毒素污染，牛奶中UPLC-MS/MS多霉菌毒素同时检测方法成为研究的热点，但是该方法不同程度的存在着灵敏度低、可信性差、稳定性弱等缺陷，有待改进。

发明内容

本发明的目的是提供一种时检测牛奶中多种霉菌毒素的方法，该方法具有线性范围好、灵敏度高、可信性好、稳定性强等优点。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种同时检测牛奶中多种霉菌毒素的方法，该方法包括以下步骤：

（1）提取牛奶中的霉菌毒素，得到霉菌毒素粗提取物；（2）将霉菌毒素粗提取物纯化后浓缩；（3）将浓缩后的霉菌毒素上色谱柱，用流动相梯度洗脱，收集洗脱物；（3）将收集的洗脱物用质谱仪进行定性定量检测。

牛奶中霉菌毒素的提取效果对检测是否成功具有决定性影响。有学者在饮料、牛奶和小麦中霉菌毒素检测时，提取前利用甲酸或乙酸酸化样品，这主要是为了提高伏马菌素的回收率，而对黄曲霉毒素M₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉烯醇的回收率没有显著影响。适合的提取剂可大大提高牛奶中霉菌毒素的提取效率，在样品中加入甲醇或乙腈既可以沉淀蛋白还可以提取霉菌毒素，但不同的基质和霉菌毒素，甲醇和乙腈的提取效率存在差别，本发明比较了提取溶剂甲醇和乙腈的提取效果，结果表明乙腈对这四种霉菌毒素的提取效率非常显著的优于甲醇的提取效果，因此，本发明优选采用乙腈作为提取溶剂提取牛奶中的霉菌毒素。

采用超高压液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）检测牛奶中的多霉菌毒素普遍存在基质效应。基质效应影响信号强度、定量限和准确度，因此UPLC-MS/MS必须考察和避免基质效应，这已成为霉菌毒素的UPLC-MS/MS检测方法开发的重点。而减弱或消除基质效应影响的最佳办法是对样品进行预处理，预处理可去除干扰物、富集痕量样品、使得样品与采用的分离和检测技术更匹配。

在痕量分析中净化和富集步骤对灵敏度具有巨大的作用。分析结果显示，未经净化和富集的粗提取液样品直接进样，干扰峰较多，信号较差，因基质效应发生强烈的信号抑制作用，因此直接注入提取液不能满足相关限量标准的检测要求，需要净化和富集样品中的霉菌毒素。本发明比较了mycosep226和HLB柱对霉菌毒素的纯化效果，结果显示，Mycosep226柱净化富集时，OTA和α-ZOL的信号较差，以致无法准确定量OTA和α-ZOL。而HLB柱的净化富集效率较高，有效的去除了干扰物质。因此，本发明优选采用HLB柱净化富集牛奶中黄曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉烯醇这四种霉菌毒素。

在确定了HLB柱为最适宜的净化富集牛奶中黄曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉烯醇这四种霉菌毒素方式后，本发明对包括霉菌毒素粗提取物过柱pH值、过柱速度、水洗体积和洗脱溶剂等参数进行了优化以提高霉菌毒素的吸附和洗脱效率。

本发明根据2⁴+1全因子实验设计筛选出关键影响因子。实验结果发现，当其它参数不变时，过柱粗提液pH和洗脱液是影响纯化和富集结果的两个最关键参数。从响应面图中可看出，霉菌毒素粗提取液pH值越低，洗脱液中甲醇含量越高，信号越好。随pH(5.0–8.5)增高，信号抑制作用增强，回收率迅速降低。因此，本发明确定霉菌毒素粗提取液过柱最佳pH值为5.0，洗脱液优选为100%甲醇。现有文献报道pH低于6.0时，回收率会快速降低；过柱粗提取液pH为8.5时回收率最大，基质效应最小。本发明所优化的参数与文献报道的参数差异较大。

在确定过HLB柱粗提取液pH5.0和100%甲醇洗脱液后，本发明进一步考察了水洗体积和过柱速度对净化富集效果的影响，本发明通过多水平因子设计最终发现，当过柱速度为1.5mL/min和水洗体积2mL时，具有最佳的富集效果。

本发明中所用色谱分离采用BEH C₁₈色谱柱(2.1×50mm，1.7μm)，流动相为甲醇和0.1%氨水，梯度洗脱霉菌毒素分析物；

采用正、负离子扫描方式进行仪器方法学研究，确定丰度比最高的离子对为监测离子分别为定性和定量离子，采用多离子反应监测模式进行检测。

灵敏度检测结果表明，采用本发明进行检测，四种霉菌毒素的LOD和LOQ范围分别为0.001–0.005μg/kg和0.003–0.015μg/kg，完全满足中国、欧盟和美国等各国对牛奶中霉菌毒素检测的限量要求。

不同加标水平和牛奶基质中，本发明监测方法回收率为87.0%-109%，相对标准偏差为3.4%-9.9%，这表明本发明检测方法精密度较高。本发明方法在三个不同水平和基质中，相对标准偏差和重现性均低于10%，这表明本发明检测方法具备较高稳定性。

本发明建立了一种高效、灵敏、稳定的同时检测牛奶中黄曲霉毒素M₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉烯醇的超高效液相色谱串联质谱法。以0.1%氨水和甲醇为流动相进行梯度洗脱，利用BEH C₁₈色谱柱在2min内就能成功分离这四种霉菌毒素。本发明检测方法分别在生鲜乳、液态奶和奶粉中得到验证，线性、灵敏度、回收率、精确性和重现性都证明本发明检测方法线性范围好、灵敏度高、可信性好、稳定性强。

附图说明

图1 0.025μg/kg混合标准溶液在多反应监测模式下的选择性离子流图。

图2不同霉菌毒素提取剂的回收率：甲醇和乙腈牛奶样品加标浓度0.025μg/kg。

图3加标0.025μg/kg的牛奶样品直接进样的结果。

图4加标0.025μg/kg的牛奶样品过HLB柱对霉菌毒素的纯化效果。

图5加标0.025μg/kg的牛奶样品过mycosep226柱对霉菌毒素的纯化效果。

图6 AFM₁的过柱因子效应按减序排列的帕累托图。

图7 AFM₁的响应面图；水洗体积2mL，固相萃取流速0.5mL/min。具体实施方式

通过下列实施例将更具体说明本发明的实施方式，但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。1.实验仪器及试剂

1.1主要实验仪器

表1主要实验仪器

1.2标准品和主要试剂

表2标准品和主要试剂

1.3霉菌毒素标准溶液的配制

50mg/L各霉菌毒素标准储备液：称取5mg各霉菌毒素标准品分别溶于100ml甲醇中。500μg/L的中间混合标准溶液：吸取1mL各储备液于100mL容量瓶中，用甲醇定容混匀。5μg/L混合标准储备液：吸取1mL中间混合标准溶液于100mL容量瓶中，甲醇定容混匀。工作液用甲醇：水（50:50，V/V）稀释混合标准储备液配制。储备液和中间标准混合液在-20℃下冷冻保存，工作液在4℃保存。

2色谱条件

色谱分离采用ACQUITY

BEH C₁₈柱色谱柱(2.1×50mm，1.7μm)在400μL/min流速下分离。流动相是A（0.1%氨水）和B（甲醇）。流动相A随时间的线性变化梯度为：0min，90%；2.0min，10%；2.1min，90%；4.0min，90%。色谱柱温度是40℃，进样体积5μL。

色谱柱连接配备电喷雾离子源的质谱仪（TQS^TM，Micromass，Manchester，UK），脱溶剂气和锥孔气均为氮气，碰撞气体是氩气。

3样品预处理

称取2.0g（精确到0.1mg）均质牛奶于15mL离心管中，加8mL乙腈，涡旋2min（Vortex-Genie2，Scientific Industries,USA)，超声30min(KQ-500DE,China)。混合物在10000r/min转速下离心10min。取全部上清液。

在50℃下氮吹浓缩至2mL，浓缩液与4mL水混合，混匀，用PBS溶液调粗提液至pH5.0±0.2。该粗提液以0.5mL/min速度过HLB柱（活化：3mL甲醇→3mL水），接着分别用2mL水和4mL甲醇洗HLB柱，收集甲醇洗脱液，50℃氮吹至近干。另取等分的上清液直接过Mycosep226柱净化富集，收集流出液。用500μL甲醇水溶液（50:50，V/V）复溶，过0.22μm滤膜，待上机。采用外标法定量。

实验例1质谱条件优化

通过注射泵将标准溶液进样，正负离子模式(ESI⁺和ESI-)下全扫描，选择相对离子丰度最高的离子做为母离子。尽管OTA可以在ESI⁺模式下检测，本研究选择了ESI-模式，因为在该模式具有较高的灵敏度和稳定性。由于在相应模式中电离效率较高，ZON和α-ZOL选择负离子模式，AFM₁选择正离子模式。在一次进样检测中，正负离子模式通过正负极转换器自动转换。四种霉菌毒素的最佳母离子和电离模式见表3。

表3母子离子和质谱参数

注：标*的为定量离子。

Note：Asterisk(*)indicates quantitative ion.

在多反应模式下，优化碰撞能量和锥孔电压，寻找丰度最高的两个子离子分别做为定量和定性离子。由于ZON和α-ZOL的结构和母离子相似，在色谱分离中并不能完全分离。但ZON和α-ZOL在多反应监测模式下两个特征子离子分别是316.8>174.8、316.8>130.8和318.8>275.0、318.8>160.0，能够完全区分开来，互不干扰（图1）。最佳的子离子、碰撞能量和锥孔电压见表3。

实验例2霉菌毒素提取剂的选择

本实验比较了提取溶剂甲醇和乙腈的霉菌毒素提取效果，结果表明采用乙腈作为提取溶剂对四种霉菌毒素（黄曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉烯醇）的提取效率较高(图2)。

回收率R（%）是加标样品浓度和标准溶液浓度的比值，根据下面公式计算：

R（%）=（加标样品信号-不加标样品信号）×100/标准溶液信号

实验例3霉菌毒素粗提液纯化条件的优化

1纯化柱子的选择

在痕量分析中净化和富集步骤对灵敏度具有巨大的作用。结果显示，未经净化和富集的霉菌毒素粗提取液样品直接进样，干扰峰较多，信号较差，因基质效应发生强烈的信号抑制作用（图3），因此直接注入霉菌毒素提取液不能满足相关限量标准的检测要求，需要净化和富集样品中的霉菌毒素粗提取液。

本实验比较Oasis HLB柱(60mg，3cm³)和Mycosep226柱对霉菌毒素粗提取液的净化和提纯效果以选择较合适的净化柱。实验结果显示，HLB柱的净化富集效率较高，有效的去除了干扰物质（图4），而Mycosep226柱净化富集霉菌毒素粗提取物时，OTA和α-ZOL的信号较差，以致无法准确定量OTA和α-ZOL(图5)。因此，HLB柱较适合牛奶中这四种霉菌毒素提取液的净化富集。

2纯化条件的优化

在得到初步回收率后，本实验进一步优化过HLB柱的参数以提高分析物的吸附和洗脱效率，所述过HLB柱的参数包括过柱pH值、过柱速度、水洗体积和洗脱溶剂。

根据2⁴+1全因子实验设计筛选出关键影响因子，试验参数设计为：霉菌毒素过柱粗提液pH值（SPE pH：5-8.5），过柱速度S（SPE speed：0.5-1.5mL/min），水洗体积V（Wash volume：2-6mL），洗脱溶剂E（Eluating solution:0%-100%乙腈/甲醇溶液），分别在最低和最高的参数水平进行试验。试验应用于加标25ng/kg空白牛奶样，根据相应的峰面积评价纯化效果的最关键影响因素（表4）。

图6是AFM1的过柱因子效应按减序排列的帕累托图，每条的长度正比于标准化效应，根据标准误差可估计各因子对结果的影响。超过横线的柱子对应的过HLB柱因子效应在95%置信区间上差异显著。该图显示当其它参数不变时，过柱粗提液pH值和洗脱液是影响结果的两个最关键参数。两个最关键因子的数据的一阶模型及其对应的响应面如图7所示。从响应面图中可看出，粗提取液pH值越低，洗脱液中甲醇含量越高，信号越好；随pH值(5.0–8.5)增高，信号抑制作用增强，回收率迅速降低。因此，本实验确定过柱粗提液最佳pH值为5.0，洗脱溶剂的最佳组成为100%甲醇。

在确定过HLB柱粗提取液最佳pH值为5.0和最佳洗脱溶剂为100%甲醇之后，本实验进一步通过优化实验筛选最适宜的水洗体积和过柱速度；采用多水平因子设计，过柱速度三个水平：0.5mL/min、1.0mL/min、1.5mL/min，水洗体积三个水平2mL、4mL和6mL，利用0.025μg/kg加标样品进行随机顺序试验。优化结果见表5；过柱速度为1.5mL/min和水洗体积2mL时，相应峰面积最大，相比于其它过柱速度和水洗体积，峰面积有明显差异。试验结果说明，相比于其它的参数，当过HLB柱粗提取液pH值为5.0、洗脱溶剂为100%甲醇、过柱速度为1.5mL/min和水洗体积为2mL的条件下能够对霉菌毒素的纯化、富集取得最佳的技术效果。

表42⁴+1全因子试验设计及其相应面积（N=6）

表5萃取速度和水洗体积的优化(N=6)

实验例4本发明检测方法的灵敏度、精密度和稳定性验证

1灵敏度验证

色谱分离采用ACQUITY BEH C₁₈柱色谱柱(2.1×50mm，1.7μm)在400μL/min流速下分离。流动相是A（0.1%氨水）和B（甲醇）。流动相A随时间的线性变化梯度为：0min，90%；2.0min，10%；2.1min，90%；4.0min，90%。色谱柱温度是40℃，进样体积5μL。色谱柱连接配备电喷雾离子源的质谱仪（TQS^TM，Micromass，Manchester，UK），脱溶剂气和锥孔气均为氮气，碰撞气体是氩气，质谱参数见表3。

检出限（LOD）和定量限（LOQ）根据0.025μg/kg浓度水平时，信噪比大于或等于3倍（LOD）和10倍（LOQ）的信噪比计算，结果见表6。四种霉菌毒素的LOD和LOQ范围分别为0.001–0.005μg/kg和0.003–0.015μg/kg，完全满足中国、欧盟和美国等各国对牛奶中霉菌毒素的限量要求。

2精密度和稳定性验证实验

色谱分离采用ACQUITY

BEH C₁₈柱色谱柱(2.1×50mm，1.7μm)在400μL/min流速下分离。流动相是A（0.1%氨水）和B（甲醇）。流动相A随时间的线性变化梯度为：0min，90%；2.0min，10%；2.1min，90%；4.0min，90%。色谱柱温度是40℃，进样体积5μL。色谱柱连接配备电喷雾离子源的质谱仪（TQS^TM，Micromass，Manchester，UK），脱溶剂气和锥孔气均为氮气，碰撞气体是氩气，质谱参数见表3。

通过在三种不同牛奶基质中加标0.025、0.1和0.5μg/kg霉菌毒素，不同加标水平和牛奶基质中，回收率为87.0%-109%，相对标准偏差为3.4%-9.9%（表6），这表明本发明检测方法精密度较高。本发明检测方法在三个不同水平和基质中，相对标准偏差（RSDr）和重现性（RSD_R）均低于10%，这表明本发明检测方法具备较高稳定性。

表6本发明检测方法灵敏度,相对标准偏差(RSDr)和重现性(RSD_R)验证结果

1R±SD表示回收率±标准偏差.

2表示每个样品每个浓度的重复数为6.

Claims

1.一种同时检测牛奶中多种霉菌毒素的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）提取牛奶中的霉菌毒素，得到霉菌毒素粗提取物；（2）将霉菌毒素粗提取物纯化、浓缩；（3）将浓缩后的霉菌毒素上色谱柱，用流动相梯度洗脱，收集洗脱物；（3）将收集的洗脱物用质谱仪进行定性定量检测。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：用乙腈作为提取溶剂提取牛奶中的霉菌毒素。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：将霉菌毒素粗提取物过固相萃取柱HLB柱进行纯化、浓缩。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：将霉菌毒素粗提取液pH值调为5.0–8.5后上固相萃取柱HLB柱，水洗后再用洗脱液洗脱，收集洗脱液。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：将霉菌毒素粗提取液pH值调为5.0后再上固相萃取柱HLB柱。

6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的洗脱液是100%甲醇。

7.按照权利要求3或4所述的方法，其特征在于：将霉菌毒素粗提取液按照0.5-1.5mL/min的过柱速度过固相萃取柱HLB柱；优选的，将霉菌毒素粗提取液按照1.5mL/min的过柱速度过固相萃取柱HLB柱。

8.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：水洗体积为2-6mL，优选为2mL。

9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：色谱分离采用BEH C₁₈色谱柱，流动相为甲醇和0.1%氨水，梯度洗脱霉菌毒素分析物。

10.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的霉菌毒素是黄曲霉毒素M₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉烯醇。