JP5785394B2 - ヒト臍帯から前駆細胞を単離及び保存するための最適化され、定義された方法 - Google Patents

Description

本発明の目的は、ヒト臍帯マトリックスから前駆細胞を単離及び保存するための、最適化され、定義された方法を提供することにある。

本発明において「前駆細胞」とは、表面及び定義された増殖培地において、接着及び拡大／増殖でき、培養中の大部分の細胞が、細胞表面マーカーＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５を発現し、大部分の細胞が、細胞表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３４及びＣＤ４５の残存発現しか示さず、大部分の細胞が、約１．７／２４時間の一定の複製係数、一定の繊維芽細胞様形態ならびに骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心筋細胞及びグリア／神経細胞などの特殊化細胞への部分分化又は最終分化の能力を維持しながら、最大１８の拡大／増殖段階を受けることができる細胞の種類を意味する。

本発明の目的は、最新技術に、処理される組織サンプルと関連して、より効率的には、臍帯量及びジスペンデド（ｄｉｓｐｅｎｄｅｄ）時間あたりの単離される幹細胞数に関連して、１００％有効性を得ることができるロバスト（ｒｏｂｕｓｔ）法を加えることにある。

本発明の技術革新の根幹は、基本的には、細胞単離工程を３つの独立した細胞回収段階に分割すること、及びいくつかの技術的パラメータを手順に沿って最適化することからなる。このようなパラメータは、最新技術では、いままで記載されていないか、定義されていないかのいずれかであった。

３段階回収法は、単離工程に沿った３種の異なる独立した起源からの解離細胞の逐次回収に基づいている。段階１−組織消化反応が実施される細胞培養フラスコの表面に接着できる第１次細胞回収。接着は、消化培養期間が終わった直後に、消化溶液の存在下のままで、室温で３０分間、フラスコを水平位置に静止したままで生じる。次いで、培養条件で接着細胞を培養し、コンフルエンスがほぼ１００％に達するまで拡大及び増殖させる。段階２−段階１後における、消化溶液の遠心分離の結果得られた上清からの第２細胞回収。次いで、これらの細胞を、培養条件で培養し、細胞培養フラスコの表面に接着できるものを、コンフルエンスがほぼ１００％に達するまで拡大及び増殖させる。段階３−段階２における遠心分離の結果得られた沈渣からの第３次細胞回収。これらの細胞は、接着、拡大及び増殖を伴わずに、直接凍結保存することができる。

手順に沿って最適化される技術的パラメータに関しては、これらは、１−機械的操作の種類及び最初の臍帯画分寸法、２−臍帯血管内の血液凝固の有無、３−酵素の種類、個々の、又は組み合わせた作用及び消化溶液中の酵素濃度、４−消化溶液の組成、５−消化反応の間のｐＨの漸進的変化、６−培養期間／時間、７−撹拌の種類（中程度又は激しく）、８−培養雰囲気の種類（乾式又は湿式）及び９−凍結保存の際の細胞密度である。

解離細胞回収のための３段階法の組合せと上記の技術的態様の最適化によって、細胞投与に基づく細胞療法における使用と、より一致した方法を生成した。これは、方法のロバスト性（１００％有効性）及び比較的短期間内に得られる高い細胞収率による。さらに、さらなる使用のために細胞生存力を最大化するための凍結保存法も最適化した。

新しく開発した方法を用いれば、細胞画分の直接凍結後、及び細胞の大部分の、２つの独立した、エクスビボでの１回の接着及び拡大／増殖段階後（Ｐ０の最後）、９日で、処理される臍帯サンプルの１００％から（最新技術では前例のない事実）約８．６（±０．１）×１０⁵個細胞／処理された臍帯１ｇの収率を得ることが可能である。このような効率は、１つの臍帯（平均長３５ｃｍ）から、合計３．０×１０⁹個細胞を得る可能性を意味する。次に、細胞の特徴によって、例えば、処理される臍帯画分の１００％から、３５日（Ｐ６の最後）で、６継代を通じて、５．０×１０⁵個細胞／ｃｍ²の一定播種材料を用い、平均７．７×１０¹⁵個細胞を得ることが可能となる。結局、このような効率は、最新技術中に存在する同様の手順を用いて同数の細胞を得るために必要とされる時間を約５６％低減させることを意味する。先に記載されたものによれば、同じ初期播種材料を使用して１．０×１０¹⁵個細胞近くの数を得るには、最小で８０日が必要であろう（特許文献１、非特許文献１参照）。

新規方法は、細胞療法に対して具体的に開発されているが、遺伝子療法手順において使用されるべき、薬理学的組成物及び化粧用組成物の基礎であるべき、分子又は分子化合物の製造のための細胞を作製するための細胞バンクの作製に、細胞培養支持体のための細胞層を製造するのに、遺伝子操作によって細胞株を製造するのにも適している。

前駆細胞（幹、胚、未分化又は原始的）は、相当な期間、自己再生能を有する、中でも、その他の種類の、より特殊化した細胞への部分分化又は最終分化のいずれかの能力を有す細胞の種類である。

胚性前駆細胞のずば抜けた分化能力にもかかわらず、研究又は／及び治療のためのこれらの利用には異論があり、深刻な倫理的問題及び安全性の問題を呼び起こしてきた。したがって、この領域における研究は、骨髄、骨膜、海綿骨、脂肪組織、滑膜領域、骨格筋、乳歯及び最終的な歯の歯髄及び嗅粘膜から得られるものなどの代替非胚幹細胞の同定及び評価に焦点を合わせてきた（非特許文献２、非特許文献３参照）。これらの組織から単離された細胞は、インビトロ及びインビボの両方で、とりわけ、軟骨細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、心筋細胞、星状細胞及び腱細胞へ分化する能力を有することがすでに実証されている（特許文献２、非特許文献４、非特許文献５参照）。非胚性供給源から単離され、非造血性の特殊化細胞に分化でき、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）に由来するこのような前駆細胞は、間葉系幹細胞と命名されている。

間葉系前駆細胞の利用に対する主要な制限は、臨床診療の際に、すなわち、細胞回収の際に生じる。間葉系細胞の採取は、常に、ドナーにとって侵襲的方法、例えば、全身麻酔さえも伴い得る外科的処置（例えば、骨髄からの幹細胞の採取のような）を伴う。さらに、間葉系幹細胞は稀であるので、得られる最終細胞数は通常少ない。

別の方法として、成体前駆細胞の可能性ある供給源として臍帯組織が記載されている（非特許文献６参照）。例えば、臍帯血は、主に、造血性（血液系列）ではあるが、前駆細胞の豊富な供給源であることがわかっている。間葉系幹細胞は、限られた数で臍帯血中に存在するので、この組織からこれらの細胞を単離する試みは、いくらかの苛立たしさをもたらしてきており、極めて多量の血液を使用して、最も成功した試みでさえ、処理された組織サンプルの総数に対して６０％の成功率を超えなかった。結局、単離細胞の起源についての依然として持続する懸念は、つまり、細胞の起源が本当に血液であったか、その他の胎児組織であったかということである（特許文献３、Ｂｉｅｂａｃｋら，２００４年参照）。

その他の報告には、その他の臍帯構成組織からの、臍帯血よりも相当に間葉性の豊富な間葉系幹細胞の単離が記載されている。これらの手順のいくつかの例は、Ｗｈａｒｔｏｎゼリー（特許文献４、特許文献５、非特許文献７、非特許文献８参照）、臍帯静脈（特許文献６、非特許文献６参照）、動脈組織（非特許文献９参照）又は羊膜などのその他の内層組織（特許文献７）によっても知られる臍帯マトリックスに基づいている。

詳細な分析によって、記載された手順は、いずれにせよ、得られる細胞の性質の点で制限されたものであり、単離される細胞の数における成功率及び効率の点ではむしろ曖昧であると示されている。実際、これらの手順の制限された性質は、常に、主に、臍帯構造内の特定の組織又は地理的位置に不必要に集中することによって、単離された細胞集団の表現型多様性の喪失をもたらした。さらに、結局、得られ得る幹細胞の実際の数について、常に、不確実性が残っていた。

したがって、例えば、間葉系幹細胞の供給源として、もっぱら羊膜に基づいているＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ手順は、すでに内皮系統の傾向のある細胞を創造する（特許文献７参照）。

さらに、記載された方法のうち、今までのところ、細胞療法手順において適用されるのに十分に信頼のおけるものであるよう、処理した成功した組織サンプルの数の点で有効性を実証したものはない。言い換えれば、臍帯マトリックスからの間葉系細胞単離の成功率は、臍帯血又はさらに骨髄からよりも高いが、これまでに、最終結果が、細胞療法適用のために十分にロバストであるよう、処理された組織サンプルの数の点で単離について１００％の成功率を保障する方法はない（非特許文献１０参照）。

さらに、臍帯血管の抽出（特許文献４、特許文献５、非特許文献７、非特許文献８参照）、又は機械的浸軟（特許文献８参照）などの構造的操作の不要な工程を取り入れることが、既存の手順を標準化及び再現するのを難しくしており、決して、細胞療法適用のための十分な細胞数を保証することがない。

さらに、過剰な組織操作は、前駆細胞表現型を維持することを望む場合には望ましくない細胞分化を誘導する（非特許文献１１乃至非特許文献１３参照）。

また、制限は、臍帯血管に基づく手順自体であるとも示している。これらの手順は、動脈又は臍帯静脈の複雑な抽出を含み、間葉系幹細胞の内皮下及び内皮系統への分化の可能性を制限する（特許文献６、非特許文献６、非特許文献９、Ｓａｒｕｇａｓｅｒら，２００５年参照）。

最後に、なお複雑なものは、それ自体が、間葉系幹細胞の供給源としてＷｈａｒｔｏｎゼリー（ＷＪ）に基づく手順である。これらの報告は、一貫しておらず、また、適用される方法論の定義及び基準がないことの一因ともなっている。したがって、特許文献４、非特許文献７及び非特許文献８は、複雑な、再現するのが困難な最初の血管抽出を実施しながら、細胞単離のために残存する組織を処理し、特許文献５はまた、臍帯血管を採取するが、残存する組織を使用する代わりに、細胞単離のために血管の周りにまだ結合している組織を処理し、最初のものを廃棄している。とはいえ、すべての著者が、彼らの手順をもっぱらＷＪに基づいていることが確認できることでは一致している（特許文献４、特許文献５、非特許文献７、非特許文献８参照）。これらのアプローチ間の相違は、理にかなったものではなく、これら２種の手順のいずれかにおける、存在する組織の過剰の組織操作は、前駆体表現型維持に対する望ましい効果を弱め、その結果、一般の人々の単離及び凍結保存サービスにおける単離された前駆細胞の利用を危険にさらすこととなる。

最新技術には、有効性及び効率が保証され、再現され得るような、簡単で、ロバストで定義された手順に基づく方法がないことは明らかである。ひとたび、間葉系幹細胞が、細胞療法において提供可能になれば、患者に、細胞単離に使用される方法が、治療薬の必要な質及び量の両方を提供することを保証することが必要である。最新技術において、これまでに記載された手順によって示される保証がないことを考えると、本発明が上記の特徴を有する方法の必要性を抑えると予測される。

国際公開第２００６／０７１７９４号 国際公開第２００７／０２０６１１号 国際公開第０３／０７０９２２号 国際公開第１９９８／０１７７９号 国際公開第２００４／０７２２７３号 国際公開第２００５／００１０８１号 国際公開第２００４／０１９３５７号 国際公開第２００６／１０１５４８号

Ｃａｎ Ａ．ａｎｄ Ｓ．Ｋａｒａｈｕｓｅｙｉｎｏｇｌｕ（２００７）．Ｃｏｎｃｉｓｅ ｒｅｖｉｅｗ：ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｓｔｒｏｍａ ｗｉｔｈ ｒｅｇａｒｄ ｔｏ ｔｈｅ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｆｅｔｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（ｏｎ ｌｉｎｅ−ｗｗｗ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ．ｃｏｍ）；ＤＯＩ：１０．１６３４／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．２００７−０４１７． Ｂａｒｒｙ Ｆ．Ｐ．ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｍｕｒｐｈｙ（２００４）Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３６：５６８−５８４． Ｒｏｉｓｅｎ Ｆ．Ｊ．，Ｋｌｕｅｂｅｒ Ｋ．Ｍ．，Ｌｕ Ｃ．Ｌ．，Ｈａｔｃｈｅｒ Ｌ．Ｍ．，Ｄｏｚｉｅｒ Ａ．，Ｓｈｉｅｌｄｓ Ｃ．Ｂ．ａｎｄ Ｓ．Ｍａｇｕｉｒｅ（２００１）Ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．８９０：１１−２２． Ｍａｊｕｍｄａｒ Ｍ．Ｋ．，Ｔｈｉｅｄｅ Ｍ．Ａ．ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｍｏｓｃａ（１９９８）．Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（ＭＳＣｓ）ａｎｄ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １７６：５７−６６． Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ Ｍ．Ｆ．，Ｍａｃｋａｙ Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｃ．Ｂ．Ｂｅｃｋ（１９９９）．Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：１４３−１４７． Ｒｏｍａｎｏｖ Ｙ．Ａ．，Ｓｖｉｎｔｓｉｔｓｋａｙａ Ｖ．Ａ．ａｎｄ Ｖ．Ｎ．Ｓｍｉｒｎｏｖ（２００３）．Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｆｏｒ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ｃａｎｄｉｄａｔｅ ＭＳＣ−ｌｋｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２１：１０５−１１０． Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｋ．Ｅ．，Ｗｅｉｓｓ Ｍ．Ｌ．，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｂ．Ｍ．，Ｍａｒｔｉｎ Ｐ．，Ｄａｖｉｓ Ｄ．，Ｍｏｒａｌｅｓ Ｌ．，Ｈｅｌｗｉｇ Ｂ．，Ｂｅｅｒｅｎｓｔｒａｕｃｈ Ｍ．，Ａｂｏｕ−Ｅａｓａ Ｋ．，Ｈｉｌｄｒｅｔｈ Ｔ．ａｎｄ Ｄ．Ｔｒｏｙｅｒ（２００３）．Ｍａｔｒｉｘ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ ｊｅｌｌｙ ｆｏｒｍ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｇｌｉａ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２１：５０−６０，２００３． Ｗａｎｇ Ｈ．Ｓ．，Ｈｕｎｇ Ｓ．Ｃ，Ｐｅｎｇ Ｓ．Ｔ．，Ｈｕａｎｇ Ｃ．Ｃ．，Ｗｅｉ Ｈ．Ｍ．，Ｇｕｏ Ｙ．Ｊ．，Ｆｕ Ｙ．Ｓ．，Ｌａｉ Ｍ．Ｃ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｃｈｅｎ（２００６）．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｅ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ ｊｅｌｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：１３３０−１３３７． Ｋａｄｎｅｒ Ａ．，Ｚｕｎｄ Ｇ．，Ｍａｕｒｕｓ Ｃ．，Ｂｒｅｙｍａｎｎ Ｃ．，Ｙａｋａｒｉｓｉｋ Ｓ．，Ｋａｄｎｅｒ Ｇ．，Ｔｕｒｉｎａ Ｍ．ａｎｄ Ｓ．Ｐ．Ｈｏｅｒｓｔｒｕｐ（２００４）．Ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏ−Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ ２５：６３５−６４１． Ｄｅｒｙｌ Ｌ．Ｔ．ａｎｄ Ｍ．Ｌ．Ｗｅｉｓｓ（２００８）．Ｃｏｎｃｉｓｅ ｒｅｖｉｅｗ：Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ ｊｅｌｌｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ａ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２６：５９１−５９９． Ｇａｒｄｎｅｒ Ｔ．Ｎ．，Ｓｔｏｌｌ Ｔ．，Ｍａｒｋｓ Ｌ．，Ｍｉｓｈｒａ Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｋ．Ｔａｔｅ（２０００）．Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｔｉｍｕｌｕｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｌｏｎｇ ｂｏｎｅ ｆｒａｃｔｕｒｅ− ａ ＦＥＭ ｓｔｕｄｙ．Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．３３：４１５−４２５． Ｃｌａｅｓ Ｌ．，Ｅｃｋｅｒｔ−Ｈｕｂｎｅｒ Ｋ．ａｎｄ Ｐ．Ａｕｇａｔ（２００２）．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｎ ｌｏｃａｌ ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｌｌｕｓ ｈｅａｌｉｎｇ．Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２０：２５５−２６６． Ｃｕｌｌｉｎａｎｅ Ｄ．Ｍ．，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ Ｋ．Ｔ．，Ａｌｋｈｉａｒｙ Ｙ．，Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ Ｓ．，Ｇｅｒｓｔｅｎｆｉｅｌｄ Ｌ．ａｎｄ Ｔ．Ａ．Ｅｉｎｈｏｒｎ（２００３）．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｏｃａｌ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｏｎ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｐａｉｒ：ｄｏｅｓ ｒｅｐａｉｒ ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ？Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．２０６：２４５９−２４７１． Ｈｕｎｇ Ｓ．−Ｃ．，Ｃｈｅｎ Ｎ．−Ｊ．，Ｈｓｉｅｈ Ｓ．−Ｌ．，Ｌｉ Ｈ．，Ｍａ Ｈ．−Ｌ．ａｎｄ Ｗ．−Ｈ．Ｌｏ（２００２）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｚｅ−Ｓｉｅｖｅｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２０：２４９−２５８ Ｋｏｔｏｂｕｋｉ Ｎ．，Ｋａｗａｇｏｅ Ｄ．，Ｎｏｍｕｒａ Ｄ．，Ｋａｔｏｕ Ｙ．，Ｍｕｒａｋｉ Ｋ．，Ｆｕｊｉｍｏｒｉ Ｈ．，Ｇｏｔｏ Ｓ．，Ｉｏｋｕ Ｋ．ａｎｄ Ｈ．Ｏｈｇｕｓｈｉ（２００６）．Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒａｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｏｎ ｎｅｗｌｙ ｆｏｒｍｅｄ ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ β−ｔｒｉｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ．Ｊ．Ｍａｔ．Ｓｃｉ．：Ｍａｔ．Ｍｅｄ．１７：３３−４１． Ｓｈｉｍ Ｗ．Ｓ．Ｎ．，Ｊｉａｎｇ Ｓ．，Ｗｏｎｇ Ｐ．，Ｔａｎ Ｊ．，Ｃｈｕａ Ｙ．Ｌ．，Ｔａｎ Ｙ．Ｓ．，Ｓｉｎ Ｙ．Ｋ．，Ｌｉｍ Ｃ Ｈ．，Ｃｈｕａ Ｔ．，Ｔｅｈ Ｍ．，Ｌｉｕ Ｔ．Ｃ．ａｎｄ Ｅ．Ｓｉｍ（２００４）．Ｅｘ ｖｉｖｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｄｕｌｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．３２４：４８１−４８８． Ｓｈｉｈ Ｄ．Ｔ．−Ｂ．，Ｌｅｅ Ｄ．−Ｃ，Ｃｈｅｎ Ｓ．−Ｃ，Ｔｓａｉ Ｒ．−Ｙ．，Ｈｕａｎｇ Ｃ．−Ｔ．，Ｔｓａｉ Ｃ．−Ｃ．，Ｓｈｅｎ Ｅ．−Ｙ．ａｎｄ Ｗ．−Ｔ．Ｃｈｉｕ（２００５）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｓｃａｌｐ Ｔｉｓｓｕｅ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：１０１２−１０２０． Ｄｏ Ｍ．，Ｊｅｏｎｇ Ｈ．，Ｃｈｏｉ Ｂ．，Ｈｕｎｔｅｒ Ｌ．，Ｌａｎｇｌｅｙ Ｓ．，Ｐａｚｍａｎｙ Ｌ．ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｙｈｕｒｎ（２００６）．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ＴＮＦ−α− ｔｒｅａｔｅｄ ＳＧＢＳ ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ．Ｙｏｎｓｅｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．４７，Ｎ°５，７２９−７３６． Ｏｋａｄａ Ａ．，Ｓｈｉｏｍｉ Ｔ．，Ａｏｋｉ Ｙ．ａｎｄ Ｍ．Ｆｕｊｉｗａｒａ（２００５）．Ｐｈｅｎｙｔｏｉｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｃｌｏｎａｌ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ＥＣ ｃｅｌｌｓ，ＡＴＤＣ５．Ｊ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．３０，Ｎ° ３，１４５−１５６． Ｌｅｅ Ｏ．Ｋ．，Ｋｕｏ Ｔ．Ｋ．，Ｃｈｅｎ Ｗ．Ｍ．，Ｌｅｅ Ｋ．Ｄ．，Ｈｓｉｅｈ Ｓ．Ｌ．ａｎｄ Ｔ．Ｈ．Ｃｈｅｎ（２００４）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｏｎｔｅｎｔ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ．Ｂｌｏｏｄ，１０３：１６６９−１６７５． Ｎａｎａｅｖ Ａ．Ｋ．，Ｋｏｈｎｅｎ Ｇ．，Ｍｉｌｏｖａｎｏｖ Ａ．Ｐ．，Ｄｏｍｏｇａｔｓｋｙ Ｓ．Ｐ．ａｎｄ Ｐ．Ｋａｕｆｍａｎｎ（１９９７）．Ｓｔｒｏｍａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ．Ｐｌａｃｅｎｔａ １８：５３−６４．

本発明は、コラーゲン、臍帯マトリックスの支持物質（Ｗｈａｒｔｏｎゼリー）の特異的消化による選択戦略に基づいて、ヒト臍帯から、特定の間葉系特徴を有する前駆細胞を単離するための選択方法を、最新技術に加えることを目的とする。

細胞遊離は、最初の組織の機械的操作を行わずに起こり、従って、元の細胞表現型が無傷で残っており、細胞生存力が維持されることは確実である。本発明において、「機械的操作」とは、臍帯の羊膜下、血管間及び血管周囲領域中の任意の組織の浸軟及び／又は粉砕及び／又は臍帯血管の抽出及び／又は臍帯マトリックス（Ｗｈａｒｔｏｎゼリー）中に存在する細胞の安定性、結果として、表現型及び生存力に干渉し得る任意のその他の機械的効果を意味する。

機械的操作がないことに加え、解離細胞回収及び工程に沿ったいくつかの技術的パラメータの最適化のために３つの独立段階を取り入れることによって、前記方法が、簡単で、ロバストで、有効性の点で１００％信頼のおけるものになり、時間に関連して得られた細胞の数の点で高効率のものになる。結果として、前記方法は、さらなる自己使用のための単離に起因する間葉系幹細胞の、細胞療法サービスならびに凍結保存に適用できる。

最新技術においては、これまで言及されていないか、定義されない様式で記載されているかのいずれかである、細胞単離及び個々の技術特徴の最適化に逐次３段階工程を取り入れることの結果が、各変数を取り入れた後に得られた総細胞収率によって評価された。総細胞収率は、接着及び拡大／増殖の段階を受けていない液体窒素の気相中で直接凍結されている小細胞部分及び組織消化直後の第１の接着選択段階及び消化生成物の遠心分離直後の第２の接着選択段階のいずれかから、これまでに単離された細胞の２群に対応する。これら両接着選択段階は、接着及び拡大／増殖の１段階を受け、対応する培養物が最大コンフルエンスに達するとすぐに、任意の継代の前（Ｐ０の最後）に凍結保存される。

本発明において「継代（Ｐ）」とは、新規拡大／増殖段階を開始するために、接着及び拡大表面、ならびに増殖培地の総容積を同時に増大するための、定義された増殖培地中での、その拡大／増殖によって、ほぼ１００％の増殖表面で接着細胞がコンフルエンス（細胞密度）に達した後の接着細胞のトリプシン化に先行する再接種を意味する。

本発明において「最大コンフルエンス」とは、細胞の単層によって均一に覆われている培養支持体の増殖表面を意味する。

３段階法を含む３種の逐次回収段階は、以下のとおりである。段階１−細胞培養フラスコの表面と接着でき、ここで、まだ、消化溶液の存在下で、組織消化反応が実施される第１次細胞回収。段階２−消化溶液の遠心分離からの、上清及び培養培地からなる溶液中で別の細胞培養フラスコの表面と接着できる第２次細胞回収。段階３−段階２における遠心分離に起因する沈渣から第３次細胞回収。これらの細胞を、接着及び拡大／増殖を行うことなく直接凍結保存する。

次に、最適化された技術的パラメータは、以下のとおりであった。

１−１ｃｍのヒト臍帯の画分が約１ｇの重量であることを考慮し、約１：２：２：３７の組織量（ｇ）、消化フラスコの底の表面積（ｃｍ²）、消化容積（ｍｌ）及びフラスコの総容積（ｍｌ）の一定割合を維持する、消化反応に使用される予定の最初の組織画分の寸法。羊膜を除去した後、いくつかの種類の分画法を調べた（下部（５ｃｍ画分）、中間部（２．５ｃｍ画分）、上部（０．３ｃｍ画分）及び刻んだ組織）。すべての分画はメスを用いて実施され、サンプルは、正確に同じ条件を使用して処理された。２．５ｃｍの画分を使用して、Ｐ０の最後での総細胞／臍帯量／時間の点で、最良の収率が得られると結論づけた。

２−組織血管（１静脈及び２動脈）内の血液凝固の有無。インビトロで、赤血球の溶解は毒性であり、細胞生存力を低下させることがわかっている。したがって、血液凝固の存在下又は不在下で、消化を実施した場合の細胞収率を比較した。後者のために、メスを使用して、血管を縦軸方向に切開し、開口部から凝血塊を除去できるようにした。血液凝固は、総細胞収率に対して負の効果を有すると結論づけた。

３−酵素の性質、組織消化工程において使用される酵素の濃度及び個々の作用又は組み合わせた作用。消化がない場合の、従って、酵素の不在下での、培養培地の存在下での培養フラスコとの直接細胞接着、及び単一酵素を用いた組織解離：０．０７５％（ｗ／ｖ）コラゲナーゼＩＩ又は２．０％（ｗ／ｖ）プロナーゼを調べた。コラゲナーゼＩＩ単独の利用が、最も効率的なアプローチであったので、次いで、この酵素を、その他の酵素と、具体的には、トリプシン０．１２５％（ｗ／ｖ）（ＥＤＴＡ ０．２６０ｍＭの存在下又は不在下）と、ヒアルロニダーゼ０．５％（ｗ／ｖ）単独と、プロナーゼ２．０％（ｗ／ｖ）と組み合わせたヒアルロニダーゼ０．５％（ｗ／ｖ）と組み合わせた。コラゲナーゼＩＩ ０．０７５％（ｗ／ｖ）とトリプシン０．１２５％（ｗ／ｖ）の組み合わせた作用によって、Ｐ０の最後での総細胞／臍帯量／時間の点で最良の収率が得られた。さらに、０．２６０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下で、０．１２５％（ｗ／ｖ）のトリプシン濃度を維持しながら、コラゲナーゼＩＩの濃度を変更した場合には（０．０３７５％、０．０７５％及び０．１５％ｗ／ｖ）、０．０７５％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼＩＩの濃度が、これまでに最適化した条件定数を維持しながら最良の結果を提供することを確認した。

４−消化溶液の組成。いくつかの酵素消化溶液組成、すなわち、２０％ ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補給したα−Ｍｅｍ、緩衝生理食塩水、例えば、ＥＤＴＡを補給したＨＢＳＳ、より具体的には、１８６ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、４００ｍｇ／ｍｌ ＫＣｌ、６０ｍｇ／ｍｌ ＫＨ₂ＰＯ₄、２００ｍｇ／ｍｌ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、８０００ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌ、３５０ｍｇ／ｍｌ ＮａＨＣＯ₃、９０ｍｇ／ｍｌ ＮａＨ₂ＰＯ４・７Ｈ₂Ｏ、１０００ｍｇ／ｍｌグルコース及び７６ｍｇ／ｍｌ（０．２６０ｍＭ）ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＣａＣｌ₂を補給した先のＨＢＳＳ溶液、５ｍＭ ＣａＣｌ₂を補給した２５ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファーを調べた。０．２６０ｍＭ ＥＤＴＡを補給した緩衝生理食塩水（ＨＢＳＳ）が、最良の収率をもたらした。

５−消化反応の間のｐＨの漸進的変化の監視。ｐＨを、消化工程に沿って監視し、培地の酸性化に気づいた。平均して、０．２６０ｍＭ ＥＤＴＡを補給したハンクス塩溶液（ＨＢＳＳ）中で、コラゲナーゼＩＩ ０．０７５％（ｗ／ｖ）とトリプシン０．１２５％（ｗ／ｖ）の組み合わせた作用を使用した場合に、初期ｐＨは７．２であり、４時間の培養後に６．４に低下し、１６時間後に５．９に低下した。培地酸性化は、長期の培養期間（１６時間）後の細胞単離における効率の欠如を説明できる。長い培養期間後には、より完全に消化されているという事実にもかかわらず、培地酸性化が細胞生存力にとって不利となる。したがって、溶液ｐＨは、培養期間を計画する場合には考慮するパラメータであり、生存単離細胞を計数することによって決定されるように、方法の効率にとって不利となる６．４を下回ってはならない。１６時間でより完全な消化が観察されたが、より長期間行うことは、細胞生存力に負の影響を与え、顕著な培地酸性化につながることがわかった。

６−消化反応のための培養期間／時間：いくつかの培養期間を調べた（２時間、４時間、６時間及び１６時間）。４時間の培養によって、最良の収率が得られると結論づけた。

７−消化反応の培養期間の間の撹拌の種類（中程度又は激しく）。培養は、それぞれ、１分あたり１００振動（ｏｐｍ）及び１分あたり１４０振動（ｏｐｍ）からなる、中程度又は激しい振動速度のいずれかで、環状振盪しながら、水浴中で実施した。１００ｏｐｍの中程度の撹拌が、細胞収率の点で良好な結果につながった。

８−酵素消化の培養の雰囲気（乾式又は湿式）。培養を３７℃で、２種の異なる環境、湿式及び乾式で実施した。この試験のために、組織サンプルを、熱交換が水及び飽和空気の両方によって起こる、浸漬した環状振盪器で、又は熱交換が乾燥した空気によって起こる、乾式チャンバーのいずれかで並行して処理した。乾式チャンバーでの培養が、良好な細胞収率をもたらした。

９−１段階の接着及び拡大／増殖を受けた後の細胞の凍結保存効率における細胞密度の効果。１ｍｌの細胞懸濁液を、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び９０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）からなる溶液中、種々の密度（細胞／ｍｌ）で、液体窒素の気相中で、ＰＯの最後に凍結した。各条件について、解凍後の細胞生存力（生細胞／総細胞）及び細胞回収率（解凍後に計数した生細胞／凍結保存前に計数した生細胞）を決定した。得られた結果より、３×１０⁶個細胞／ｍｌの細胞密度が、凍結保存後の生細胞の適切な維持及び回収を確実にする可能性が、調べた条件下では最も高いことが示された。

また、一般に、上記の最適化に鑑みて、本発明は、ヒト臍帯から前駆細胞を単離するための選択方法に基づき、ここで、各臍帯は、血液が枯渇しており、常に、無菌環境で、４８時間以内に処理される場合には、好ましくは、室温で、グルコース及び抗生物質を含有する緩衝食塩水中で実験室に輸送される。長期の保存期間のためには、２〜８℃の範囲の間の温度が賢明である。

臍帯を処理すること及び前駆細胞を単離することを含む以下の工程は、無菌条件下、垂直流動層流フードチャンバーで実施する。

最初に、組織採取の間、空気と接触しており、従って、微生物汚染をより起こしやすい内層構造である羊膜をはがし、臍帯を新しい塩溶液で洗浄する。

一般的には、所望の前駆細胞を単離するための方法として、組織の機械的操作を含まず、適用できる場合には、臍帯血管内の血液凝固を除く臓器の内部構造の任意の抽出を含む、最適化された組織分画に由来する規定の寸法の画分を用いて開始する。

臍帯組織からの細胞の遊離は、平均して、１ｃｍの臍帯の画分が１ｇの重量であることを考慮し、約１：２：２：３７の組織量（ｇ）、組織が拘束される消化フラスコの表面積（ｃｍ²）、消化溶液の容積（ｍｌ）及び消化フラスコの総容積（ｍｌ）間の確立された比例関係に留意して、臍帯マトリックスに対して行われる酵素的消化によって促進される。

酵素的消化を進めるために、指定の組合せの酵素を、指定の最小ｐＨで、培養期間の間、規定の組成を有する溶液中、指定の濃度で使用し、撹拌及び培養雰囲気の種類も同様に指定されている。

解離細胞の回収は、３段階で進行し、第１段階では、組織消化反応が実施される細胞培養フラスコの表面と接着できる細胞の集合を回収する。接着は、消化培養期間が終わった直後に、室温で、１０〜１２０分間の範囲、好ましくは、３０分間、フラスコを水平位置に静止したままで生じる。第２段階では、段階１後、消化溶液の遠心分離に起因する上清から、細胞の新規集合を回収する。段階１及び段階２の両方で、細胞を、培養条件で培養し、細胞培養フラスコの表面と接着できるものが、コンフルエンスがほぼ１００％に達するまで、１段階の拡大／増殖を受ける。最後に、段階３では、段階２における遠心分離に起因する沈渣から細胞の集合を回収し、一連の接着及び拡大／増殖を全く受けさせることなく、直接、凍結保存する。

逐次細胞回収及び先に記載されたすべてのその他の最適化された因子を、方法が、選択され、単離される細胞数の点で、１００％の有効性及び最大効率を示すよう最適化した。次いで、得られた細胞集団は、表面及び規定の増殖培地において接着及び拡大／増殖できる細胞によって同定され、これでは、培養中の大部分の細胞が、細胞表面マーカーＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５を発現し、大部分の細胞が、細胞表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３４及びＣＤ４５の残存発現しか示さず、大部分の細胞は、約１．７／２４時間の一定の複製係数、一定の繊維芽細胞様形態ならびに骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心筋細胞及びグリア細胞などの特殊化細胞への部分分化又は最終分化の能力を維持しながら、最大１８の拡大／増殖段階を受けることができる。

さらに、本発明は、さらなる使用のために細胞生存力の点で効率を最大化することを目的として、一連の接着及び拡大／増殖を受ける細胞の凍結保存のための細胞密度（細胞／容積）を最適化する。

新規方法を用いれば、どの臍帯サンプルを用いても、最新技術では前例のない事実、細胞画分を直接凍結した後、及び、エクスビボでの接着及び拡大／増殖（Ｐ０の最後）の２つの独立した段階の後、９日で、約８．６（±０．１）×１０⁵個細胞／臍帯１ｇの収率を得ることが可能である。このような効率は、１つの臍帯（採取後の平均長３５ｃｍ、約３５ｇ）から、合計３．０×１０⁹個細胞を得る可能性を意味する。次に、単離された間葉系幹細胞は、通常、１７５ｃｍ²増殖面を有する細胞培養フラスコにおいて、７ラウンド（６継代、Ｐ６）の接着及び拡大／増殖の間、５．０×１０⁵個細胞／ｃｍ²の一定播種材料を用い、一定の約１．７／２４時間の複製係数を示すので、３５日で平均７．７×１０¹⁵個の細胞を得ることが可能である。これは、５．０×１０⁵個細胞／ｃｍ²の同一の一定の初期播種材料を用いて、同数の細胞に達するために８０日が必要であろう、最新技術に記載される同様の手順を使用して同じ細胞数に達するのに必要とされる時間の５６％の獲得を意味する（特許文献１、非特許文献１参照）。

細胞療法手順において主に適用されるべき新規方法を開発したが、細胞バンキング、遺伝子療法手順、薬理学的組成物及び化粧用組成物、分子又は分子化合物の製造、細胞培養支持体のための細胞層の製造及び遺伝子操作による細胞株の製造などのその他の目標にも適している。

臍帯マトリックス由来細胞を用いたフローサイトメトリーの結果。細胞は、ＣＤ４４（９７％陽性細胞）、ＣＤ７３（９９％陽性細胞）、ＣＤ９０（９７％陽性細胞）及びＣＤ１０５（９５％陽性細胞）、すべて間葉系間質細胞の陽性マーカーに対する、ＰＥ又はＦＩＴＣと結合している抗体を使用して免疫標識した。 臍帯マトリックス由来細胞を用いたフローサイトメトリーの結果。細胞は、間葉系統の負のマーカーであるとわかっている抗原（ＣＤ１４、単球系統（＜１％陽性細胞）、ＣＤ３４、造血系統に特異的（１．２％陽性細胞）、ＣＤ３１、内皮マーカー（１％陽性細胞）及びＣＤ４５（１．１％陽性細胞）、汎白血球マーカー）に対するＰＥ又はＦＩＴＣと結合している抗体を使用して免疫標識した。 細胞接着及び拡大／増殖後の細胞凍結保存の効率に対する細胞密度の効果。Ａ−種々の細胞密度の解凍後生存力（生細胞／総細胞×１００％）。Ｂ−細胞回収率（解凍後に回収された生細胞／凍結された生細胞の最初の数）。試験した条件（１ｍｌの細胞懸濁液及び０．５ｍｌのヘッドスペースを含有する１．５ｍｌ滅菌クライオチューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ））について、３×１０⁶個細胞／ｍｌの細胞密度を用いて最良の結果が得られた。 解凍細胞のインビトロでの拡大。観察された複製係数は、１．７／２４時間であり、凍結保存の前にこれらの細胞について観察されたものと同様であった。解凍の３６時間後に（２４時間後に培地交換を行い）、８０〜９０％の範囲のコンフルエンスが観察された。Ａ−培地交換前の解凍の１２時間後の前駆細胞。Ｂ−解凍の３６時間後の前駆細胞（２４時間後に培地交換を実施した）。バーは１００μｍ。 骨芽細胞、脂肪細胞及び軟骨細胞への単離された前駆細胞の分化。Ａ−正常増殖培地中での対照細胞（非分化細胞）の細胞形態。Ｂ−造骨性分化。細胞を造骨性分化培地に播種し、３週間維持し、その後、アルカリホスファターゼを用いて染色した。Ｃ−脂肪生成分化。十分にコンフルエントな細胞培養物に脂肪生成分化培地を加え、細胞を３週間維持し、その後、オイルレッドOで染色した。Ｄ−軟骨形成分化。細胞を、軟骨形成分化培地中で、遠心分離管中に再懸濁し、４週間維持した。次いで、細胞をアルシアンブルー及びヘマトキシリンで染色した。バーは１００μｍ。 単離された前駆細胞の心筋細胞への分化。Ａ−正常増殖培地、１０％ ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補給したα−Ｍｅｍ中での対照細胞（非分化細胞）の細胞形態。Ｂ−心筋分化後の細胞形態。Ｃ−ＤＡＰＩで、及びトロポニンＴ（特異的心筋細胞マーカー）に対する抗体で印を付けた対照細胞（非分化細胞）。ＤＡＰＩで印を付けられた核のみが観察される。Ｄ−ＤＡＰＩで、及びトロポニンＴに対する抗体で印を付けた分化細胞。ＤＡＰＩで印を付けられた核及びトロポニンＴで印を付けられた細胞骨格の両方を観察することができる。 単離された前駆細胞の、グリア細胞／神経細胞への分化。Ａ−正常増殖培地、１０％ ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補給したα−Ｍｅｍにおける対照細胞（非分化細胞）の細胞形態。Ｂ−グリア／神経分化の細胞形態。Ｃ−ＤＡＰＩで、及びβ−チュブリンＩＩＩ（特異的神経タンパク質）に対する抗体で印をつけた対照細胞（非分化細胞）。ＤＡＰＩで印を付けられた核のみが観察される。Ｄ−ＤＡＰＩで、及びβ−チュブリンＩＩＩに対する抗体で印を付けた分化細胞。ＤＡＰＩで印を付けられた核及びβ−チュブリンＩＩＩで印を付けられた細胞骨格の両方を観察することができる。

本実施形態の方法の適用に先立って、ヒト臍帯を血液と分離し、採取後７２時間内に処理される場合には、好ましくは、室温で、又は４８〜１４４時間の範囲の期間内に処理される場合には、２〜８℃の範囲の間、好ましくは、４℃で、乾燥で、又は好ましくは、１８６μｇ／ｍｌ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、４００μｇ／ｍｌ ＫＣｌ、６０μｇ／ｍｌ ＫＨ₂ＰＯ₄、２００μｇ／ｍｌ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、８０００μｇ／ｍｌ ＮａＣｌ、３５０μｇ／ｍｌ ＮａＨＣＯ₃、９０μｇ／ｍｌ ＮａＨ₂ＰＯ４ ７Ｈ₂Ｏ、２０００μｇ／ｍｌグルコースならびに１％のペニシリンとストレプトマイシンの等モル混合物を含有する滅菌溶液中に浸漬し、ＨＢＳＳなどの滅菌生理食塩水溶液を伴わずに、又は好ましくは、伴って、滅菌密閉容器で実験室施設に輸送しなくてはならない。生理食塩水には、栄養分及び抗生物質、例えば、１ｇ／Ｌグルコース、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給してもよい。

前記方法は、無菌環境、例えば、ラミナーフローフードの内側で実施すべきである。臍帯を、ハンクス緩衝生理食塩液（ＨＢＳＳ）で３回洗浄し、滅菌ピンセットを用いて臍帯の周囲の羊膜を除去する。

次いで、メスを用いて、臍帯を約２．５ｃｍの画分に横方向に分画する。ヒト臍帯の平均密度（ほぼ１ｇ／ｃｍ）を考慮して、各画分は、約２．５ｇの組織に相当する。

血液凝固が、これらの画分中に存在する場合には、メスを用いて除去すべきである。以下の工程では、７つの２．５ｇの血液凝固のない画分の各群を独立に処理する。

約１：２：２：３７の組織量、フラスコの底面積、消化容積及びフラスコ総容積間の一定割合を維持しながら、０．０７５％（重量／総消化容積）の濃度のコラゲナーゼＩＩと０．１２５％（重量／総消化容積）の濃度のトリプシンの組み合わせた作用によって、ｐＨ緩衝した消化溶液を含有する滅菌、密閉フラスコ中で実施する７画分の各群の解離から細胞を得、これでは、フラスコを、培養時間、温度、加熱環境、周囲湿度及び撹拌の規定の条件下、より詳しくは、各々約２．５ｃｍ（２．５ｇ）を有し、血液凝固を含まない７つの臍帯画分の群から出発し、３５ｍｌの消化溶液の容積を使用し、総容積６５０ｍｌ及び６１５ｍｌ−消化中の７画分の水中容積という消化の際のヘッドスペースを有するＴ₁₇₅などの非通気型、密閉培養フラスコ中で培養し、消化溶液は、酵素を除いて、１８６μｇ／ｍｌ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、４００μｇ／ｍｌ ＫＣｌ、６０μｇ／ｍｌ ＫＨ₂ＰＯ₄、２００μｇ／ｍｌ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、８０００μｇ／ｍｌ ＮａＣｌ、３５０μｇ／ｍｌ ＮａＨＣＯ₃、９０μｇ／ｍｌ ＮａＨ₂ＰＯ４・７Ｈ₂Ｏ、１０００μｇ／ｍｌグルコース及び７６μｇ／ｍｌ（０．２６０ｍＭ）ＥＤＴＡからなり、ｐＨ６．４以上を維持し、酵素反応液を、１００振動／分（ｏｐｍ）の一定速度での撹拌のもと、密閉乾式培養器中、３７℃の一定温度で４時間培養する。

組織解離から得られた細胞の回収は、３段階で実施する（３段階法）。

第１段階では、解離した組織から、より詳しくは、消化が、室温で５〜３００分、好ましくは、３０分の期間行われたフラスコの静置水平培養から、細胞を回収する。消化上清を、未消化組織はいずれも吸引を避けながら、ピペッティングによって５０ｍｌ遠心分離管に移す。未消化組織はいずれも廃棄する。この時点で、消化フラスコに、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、グルタミン、抗生物質及び１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給した基本培養培地３５ｍｌを加える。非通気型フラスコカップを、フィルター含有通気型カップと置き換え、消化フラスコを、７％ＣＯ₂を含有する加湿雰囲気中、３７℃で培養する。最大表面コンフルエンスが達成されるまで、７２時間毎に総培養培地の交換を実施して、水平培養期間（選択期間）の間に接着する細胞の増殖を促進すべきである。

第２の回収段階では、細胞を、室温で、５０ｍｌ遠心分離管中、３５０ｇで１０分間の消化上清の遠心分離から回収する。遠心分離後、３５ｍｌの上清を、フィルター含有通気型カップを備えた静置培養フラスコ（Ｔ₁₇₅）に移し、３５ｍｌの、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、グルタミン、抗生物質及び１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給した基本培養培地を加える。次いで、最大表面コンフルエンスが達成されるまで、フラスコを、７％ ＣＯ₂を含有する加湿雰囲気中、３７℃で培養し、細胞接着及び拡大／増殖を促進するよう、総培養培地を７２時間毎に交換する。

最初の接着及び拡大／増殖ラウンド（Ｐ０の最後）の後に、第１段階及び第２段階から得られた細胞集団を凍結保存する。これは、１．５ｍｌ滅菌クライオバイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）中に、約３×１０⁶個細胞／ｍｌの最終濃度、したがって、１．０ｍｌの細胞懸濁液及び０．５ｍｌのヘッドスペースを得るための、０．５ｍｌの所望の総細胞数を含有する細胞懸濁液と、同容積の、１０％のジメチルスルホキシド（ｓｕｌｆｏｘｙｄｅ）（ＤＭＳＯ）を含有するウシ胎児血清（ＦＢＳ）の溶液の混合物の、液体窒素の気相中での直接凍結保存からなる。

第３段階及び最終段階の細胞回収は、２ｍｌの細胞懸濁液及び０．５ｍｌのヘッドスペースを含有する２．５ｍｌの滅菌クライオバイアル中での、１℃／分の温度低下速度で速度制御冷凍庫を使用して−８０℃に低下させた、２ｍｌの、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有するウシ胎児血清（ＦＢＳ）からなる溶液に再懸濁した、先に記載された消化上清の遠心分離によって得られた細胞沈渣の直接凍結保存からなる。

凍結保存された細胞は、必要な場合いつでも、３７℃の水浴中での急速解凍法によって回復させることができる。次いで、細胞を、同じ温度の培養培地に１：１０の希釈係数で再懸濁する。その後の拡大期は、５．０×１０³〜２．０×１０⁴個細胞／ｃｍ²の間の播種材料密度を使用し、７２時間毎の総培地交換を行って実施され得る。細胞は、通常、１．７／２４時間の複製係数を示す。

機械的操作の種類／量及び画分寸法の最適化。

約１：２：２：３７の組織量（ｇ）、消化フラスコの底の表面積（ｃｍ²）、消化容積（ｍｌ）及びフラスコの総容積（ｍｌ）の一定割合を維持し、１ｃｍのヒト臍帯の画分が約１ｇの重量であることを考慮して、機械的操作の種類及び最初の組織断片の大きさを最適化した。羊膜を除去した後、いくつかの種類の臍帯分画を調べた。下部（５ｃｍ画分）、中間部（２．５ｃｍ画分）、上部（０．３ｃｍ画分）、及び刻んだ組織。すべての分画をメスを用いて実施し、サンプルを、正確に同じ条件を使用して処理した。２．５ｃｍの画分を使用して、Ｐ０の最後での総細胞／臍帯量／時間の点で、最良の収率が得られると結論づけた。表１に、得られた結果を定性的に要約する。
表１：分画最適化：細胞収率。

臍帯血管（１静脈及び２動脈）内の血液凝固の有無に対する最適化。

赤血球の溶解は毒性を有し、インビトロにおける細胞生存力を低下させることがわかっている。したがって、血液凝固の存在下又は不在下で消化を実施した場合の細胞収率を比較した。後者の実験のために、血液凝固をメスを用いて除去した。血液凝固が、Ｐ０の最後での総細胞／臍帯量／時間の点で、収率に対して負の効果を有すると結論づけた。表２に、得られた結果を定性的に要約する。
表２：血液凝固：細胞収率に対する効果。

酵素の性質、個々の又は組み合わせた酵素の作用及び消化溶液中の酵素濃度に対する最適化。

最初の組織から単離される所望の特徴を有する細胞の数の点で、収率を最大にするために、酵素消化に関して２種の初期アプローチを適用した。消化を行わない、従って、酵素の不在下での、培養培地の存在下での、培養フラスコとの直接細胞接着、及び単一酵素、０．０７５％（ｗ／ｖ）コラゲナーゼＩＩ又は２．０％（ｗ／ｖ）プロナーゼを用いる組織解離。

コラゲナーゼＩＩ単独の利用が、最も効率的なアプローチであったので、次いで、この酵素を、その他の酵素と、具体的には、トリプシン０．１２５％（ｗ／ｖ）（ＥＤＴＡ ０．２６０ｍＭの存在下又は不在下で）と、ヒアルロニダーゼ０．５％（ｗ／ｖ）単独と、プロナーゼ２．０％（ｗ／ｖ）と組み合わせたヒアルロニダーゼ０．５％（ｗ／ｖ）と組み合わせた。

これらの試験のために、最適な画分の大きさ２．５ｃｍを使用し、約１：２：２：３７の組織量（ｇ）、フラスコの底の表面積（ｃｍ²）、消化の容積（ｍｌ）及びフラスコの総容積（ｍｌ）の割合を一定に維持した。

結果から、Ｐ０の最後での総細胞／臍帯量／時間の点で、コラゲナーゼＩＩ ０．０７５％（ｗ／ｖ）とトリプシン０．１２５％（ｗ／ｖ）の組み合わせた作用によって最良の収率が得られることが示された。さらに、０．２６０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下、０．１２５％（ｗ／ｖ）のトリプシン濃度を維持しながらコラゲナーゼＩＩの濃度を変更した場合（０．０３７５％、０．０７５％及び０．１５％ ｗ／ｖ）には、０．０７５％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼＩＩの濃度が最良の結果を提供することが確認された。表３に、得られた結果を定性的に要約する。
表３：酵素の性質、組み合わせた作用及び濃度：細胞収率に対する効果。

酵素溶液の化学組成の最適化。

いくつかの酵素消化溶液組成、すなわち、２０％ ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補給したα−Ｍｅｍ。緩衝生理食塩水、例えば、ＥＤＴＡ、さらに詳しくは、１８６ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、４００ｍｇ／ｍｌ ＫＣｌ、６０ｍｇ／ｍｌ ＫＨ₂ＰＯ₄ 、２００ｍｇ／ｍｌ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、８０００ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌ、３５０ｍｇ／ｍｌ ＮａＨＣＯ₃、９０ｍｇ／ｍｌ ＮａＨ₂ＰＯ４・７Ｈ₂Ｏ、１ＯＯＯｍｇ／ｍｌグルコース及び７６ｍｇ／ｍｌ（０．２６ＯｍＭ）ＥＤＴＡを補給したＨＢＳＳ、５ｍＭ ＣａＣｌ₂を補給した先のＨＢＳＳ溶液、５ｍＭ ＣａＣｌ₂を補給した２５ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファーを調べた。

これらの試験のために、これまでに最適化した条件、すなわち、コラゲナーゼＩＩ ０．０７５％（ｗ／ｖ）及びトリプシン０．１２５％（ｗ／ｖ）からなる酵素の組合せを維持した。

０．２６０ｍＭ ＥＤＴＡを補給した緩衝生理食塩水（ＨＢＳＳ）について最良の結果が得られた。表４に、得られた結果を定性的に要約する。
表４：酵素溶液の組成：細胞収率に対する効果。

酵素消化培養時間及びｐＨ漸進的変化の最適化。

いくつかの培養期間を調べた。２時間、４時間、８時間及び１６時間。得られた結果から、最良の培養期間は、４時間であった。１６時間で、より完全な消化が観察されたが、より長期間は、細胞生存力に対して負の影響を有し、相当な培地酸性化につながることがわかった。表５に、得られた結果を定性的に要約する。
表５：培養時間及び酵素消化溶液のｐＨ：細胞収率に対する効果。

消化の間の撹拌様式（中程度又は激しい）の最適化。

酵素消化溶液の培養を、中程度（１００ｏｐｍ）又は激しい（１４０ｏｐｍ）振動速度のいずれかで環状振盪しながら水浴中で実施した。１００ｏｐｍの中程度の撹拌が、細胞収率の点でより良好な結果につながった。表６に、得られた結果を定性的に要約する。
表６：撹拌速度：細胞収率に対する効果。

酵素消化の間の培養雰囲気の最適化（乾式又は湿式）。

酵素消化溶液の培養を、２種の異なる環境、湿式及び乾式において３７℃で実施した。この試験のために、組織サンプルを、熱交換が水及び飽和空気の両方によって起こる、浸漬した環状振盪器、又は熱交換が乾燥空気によって起こる、乾式チャンバーのいずれかで並行して処理した。乾式チャンバーでの培養が、良好な細胞収率をもたらした。表７に、得られた結果を定性的に要約する。
表７：培養環境：細胞収率に対する効果。

凍結保存中の細胞密度の最適化。

凍結保存後の細胞回収に対する細胞密度の効果を評価するために、細胞を、０．５ｍｌの細胞懸濁液と、ＦＢＳ（９０％）及びＤＭＳＯ（１０％）を含む同容積の溶液を含有する１．５ｍｌのクライオチューブ中、１×１０⁶〜１０×１０⁶個細胞／ｍｌの間の範囲の種々の密度で、液体窒素の気相中で、Ｐ１の最後に凍結した。

細胞を、最低３０日間、凍結保存し、次いで、３７℃に維持した水浴中にクライオチューブを入れることによって解凍した。解凍した細胞を、３７℃に予熱した培養培地１０ｍｌに再懸濁した。総細胞及び生存細胞を計数し、続いて、組織培養フラスコ（ＮＵＮＣ）中、１：１０の希釈係数で播種した。

２４時間後、培地を新鮮培地と交換し、細胞を上記のように維持した。

凍結保存のための最適細胞密度を決定するために、各条件について解凍後の細胞生存力（生存細胞／総細胞）及び細胞回収率（解凍後に計数した生存細胞／凍結保存前に計数した生存細胞）を求めた。得られた結果より、３×１０⁶個細胞／ｍｌの細胞密度が、調べた条件（１ｍｌの細胞懸濁液及び０．５ｍｌのヘッドスペースを含有する１．５ｍｌクライオチューブ）下で、凍結保存後の生細胞の適切な維持及び回収を確実にする可能性が最も高いことが示された。

解凍細胞のインビトロ拡大能をモニターした。細胞は、通常、凍結保存前に観察された値と同様の、１日あたり１．７１倍加の複製係数を示した（図４）。

開発した方法を使用した、ヒト臍帯からの前駆細胞の単離。

臍帯が採取された施設の倫理委員会からの承認及び母親からのインフォームドコンセントを得た後、出産後いくつかの臍帯を採取した。臍帯を胎盤から分離し、血液を枯渇させ、栄養分及び抗生物質、例えば、１ｇ／Ｌグルコース、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給した滅菌生理食塩水、ＨＢＳＳを含有する滅菌密閉フラスコ中で実験室施設に輸送した。

施設への輸送は、室温で実施した。方法は、ラミナーフローフードの内側の無菌環境で実施した。

各臍帯は、ハンクス緩衝生理食塩水（ＨＢＳＳ）で３回洗浄し、滅菌ピンセットを用いて臍帯の周りの羊膜を除去した。

次いで、メスを用いて、各臍帯を約２．５ｃｍの画分に横方向に分画した。ヒト臍帯の平均線密度（１ｇ／ｃｍ）を考慮すると、各画分は、約２．５ｇの組織に相当する。これらの画分では、同定された血液凝固は、メスを用いて除去した。７つの２．５ｇの血液凝固のない画分の各群を独立に処理した。

細胞は、約１：２：２：３７の組織量、フラスコの底面積、消化容積及びフラスコ総容積間の一定割合を維持しながら、０．０７５％（重量／総消化容積）の濃度のコラゲナーゼＩＩと０．１２５％（重量／総消化容積）の濃度のトリプシンの組み合わせた作用によって、ｐＨ緩衝した消化溶液を含有する滅菌、密閉フラスコ中で実施した７画分の各群の解離から得た。フラスコは、規定の期間、温度、加熱環境、周囲湿度及び撹拌のもと、より詳しくは、各々約２．５ｇを有し、血液凝固を含まない、７臍帯画分の群から出発し、３５ｍｌの消化溶液の容積を使用し、総容積６５０ｍｌ及び６１５ｍｌ−消化中の７画分の水中容積という消化の際のヘッドスペースのＴ１７５のような非通気型、密閉培養フラスコ中で培養し、これでは、消化溶液は、酵素を除いて、１８６ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、４００ｍｇ／ｍｌ ＫＣｌ、６０ｍｇ／ｍｌ ＫＨ₂ＰＯ₄、２００ｍｇ／ｍｌ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、８０００ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌ、３５０ｍｇ／ｍｌ ＮａＨＣＯ₃、９０ｍｇ／ｍｌ ＮａＨ₂ＰＯ４・７Ｈ₂Ｏ、１０００ｍｇ／ｍｌグルコース及び７６ｍｇ／ｍｌ（０．２６０ｍＭ）ＥＤＴＡからなり、ｐＨを６．４以上に維持した。酵素反応液を、１００振動／分（ｏｐｍ）の一定速度での撹拌のもと、密閉乾式培養器中、３７℃の一定温度で４時間培養した。

組織解離から得られた細胞の回収は、３段階で実施した。

第１段階では、解離した組織から、より詳しくは、消化が、室温で５〜３００分、好ましくは、３０分の期間行われたフラスコの静置水平培養から細胞を回収した。消化上清は、任意の未消化組織を避けながら、ピペッティングによって５０ｍｌ遠心分離管に移した。すべての未消化組織を廃棄した。この時点で、消化フラスコに、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、グルタミン、抗生物質及び１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給した基本培養培地３５ｍｌを加えた。非通気型フラスコカップを、フィルター含有通気型カップと置き換え、消化フラスコを、７％ＣＯ₂を含有する加湿雰囲気中、３７℃で培養した。細胞での表面コンフルエンスが達成されるまで、水平培養の間に接着した細胞の増殖を促進するよう、７２時間毎の総培養培地の交換を７日間実施した。

第２の回収段階では、細胞を、室温で３５０ｇ、１０分間の、上記から得た５０ｍｌの遠心分離から回収し、遠心分離後、３５ｍｌの上清容積を、フィルター含有通気型カップを備えたＴ₁₇₅などの静置培養フラスコに移し、同じ培養フラスコに３５ｍｌの、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、グルタミン、抗生物質及び１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給した基本培養培地を加え、培養フラスコを、７％ ＣＯ₂を含有する加湿雰囲気中、３７℃で培養し、最大コンフルエンスが達成されるまで、接着及び細胞拡大／増殖を促進するよう、培養培地を７２時間毎に交換した。

最初の拡大サイクルの最後（Ｐ０の最後）に、第１及び第２段階から得られた細胞集団を凍結保存した。これは、１．０ｍｌの細胞懸濁液及び０．５ｍｌのヘッドスペースを含有する１．５ｍｌの滅菌クライオバイアル中、約３×１０⁶個細胞／ｍｌの最終濃度を得るための、０．５ｍｌの所望の総細胞数を含有する細胞懸濁液と、同容積の、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有するウシ胎児血清（ＦＢＳ）の溶液との混合物の、液体窒素の気相中での直接凍結保存からなるものであった。

解離された組織からの第３及び最終段階の細胞回収は、１℃／分の温度低下速度で速度制御冷凍庫を使用して−８０℃に低下させた、消化上清の遠心分離によって得られた細胞沈渣の直接凍結保存からなるものであり、これでは、細胞を、２ｍｌの細胞懸濁液及び０．５ｍｌのヘッドスペースを含有する２．５ｍｌの滅菌クライオバイアル中、２ｍｌの、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有するウシ胎児血清（ＦＢＳ）の溶液に再懸濁した。

凍結保存した細胞を、３７℃の水浴中での急速解凍法によって３１日後に回収した。次いで、細胞を、同じ温度の培養培地に１：１０の希釈係数で再懸濁する。その後の拡大工程は、５．０×１０³〜２．０×１０⁴個細胞／ｃｍ²の間の播種材料密度を使用し、７２時間毎の総培地交換を行って実施され得る。細胞は、通常、１８継代の間、１日当たり１．７倍加の増殖速度を示す。

単離された前駆細胞のうち間葉系表現型の証明。

前駆体間葉系細胞のための選択培養培地において接着し、増殖する能力を超越して、単離細胞をフローサイトメトリーによってＰ１の最後に特性決定した。

細胞が、Ｐ１の最後に８０％〜９０％のコンフルエンスに達した時点で、培養培地を除去し、細胞表面をリン酸バッファー（Ｃａ²⁺及びＭｇ²⁺を含まない）で洗浄した。０．２５％のトリプシンを加え、細胞がフラスコ表面から剥離するとすぐに、２容積の培養培地を加えた。次いで、細胞懸濁液を、３５０ｇで１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を含有する沈渣を、２×１０⁶〜１０×１０⁶個細胞／ｍｌの間の最終細胞濃度を達成するよう、ブロッキング溶液（ｄＰＢＳ中、０．２％ ＢＳＡ）に再懸濁した。室温で１０分間の培養期間の後、蛍光マーカー、フィコエリトリン（ＰＥ）又はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）とコンジュゲートしている一次抗体を含有する各試験管に１００μｌの細胞懸濁液を加えた。細胞懸濁液を、２０〜４０分間、氷中で振盪及び培養し、光から保護した。この期間の後、各試験管に１．５ｍｌのｄＰＢＳを加え、細胞を再懸濁し、３５０ｇで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を含有する沈渣を、５００μｌのパラホルムアルデヒド中に、１％で再懸濁した。

細胞懸濁液は、さらなる使用まで４℃で保存した。フローサイトメトリーをＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒで実施し、間葉系細胞の陽性マーカーとしてＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５表面抗原を検出した。このために、ＦＩＴＣ又はＰＥとコンジュゲートしている一次抗体を使用した（図１）。負のマーカーＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３４及びＣＤ４５表面抗原の存在を調べた。これらは、造血（ＣＤ３４）、単球（ＣＤ１４）、内皮（ＣＤ３１）及び汎白血球（ＣＤ４５）系統に対して特異的であり、これらの抗体のすべてをＦＩＴＣとコンジュゲートした（図２）。予想通り、単離した間葉系細胞の大多数が、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５に対して陽性であり、上述の負のマーカーに対しては陰性であるか、残存的にのみ陽性であると示した。

単離細胞の前駆体表現型の実証：造骨性分化。

本発明の詳細な説明に従って、ヒト臍帯の画分から単離した前駆細胞は、種々の特殊化した細胞種に分化する能力を示した。この実施例では、これらの細胞の、骨芽細胞への分化能が実証されている。

細胞をＰ３で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０ｍＭ β−グリセロリン酸塩、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌアスコルベート−２−ホスフェート、１００ｎＭデキサメタゾンを補給したα−Ｍｅｍ基本培地（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及びウルトラグルタミンを含む）を含有する造骨性分化培地中に２．０×１０⁴個細胞／ｃｍ²の密度で播種した（非特許文献１４参照）。

全培地を、１週間に２回、３週間の間交換し、その後、アリザリンレッド及びアルカリホスファターゼを使用する特異的染色手順を実施し、両方とも陽性であった。アリザリンレッド染色に関しては、組織培養フラスコから培地を注意深く吸引し、細胞を４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間固定化した。

細胞を、ＰＢＳで洗浄し、特異的染色溶液、アリザリンレッドＳ、４０ｍＭ、ｐＨ４．２とともに、室温で１５分間培養した。アリザリンレッドＳ溶液を除去し、細胞を水で注意深く洗浄した（非特許文献１５参照）。

アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）試験の場合にも、細胞を、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間固定化した。次いで、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、２．５ｍｌのクエン酸溶液中に浸漬し、３０秒間培養のために放置した。

次いで、クエン酸溶液を除去し、細胞を脱イオン水（ｍｉｌｌｉＱ）で洗浄し、染色溶液、ニュートラルレッドとともに２分間培養した。次いで、溶液を除去し、細胞を水で注意深く洗浄した（非特許文献１６参照）。試験は、造骨性分化について陽性であった（図５）。

単離された細胞の前駆体表現型の実証：脂肪生成分化。

細胞を脂肪細胞に分化させるために、細胞をＰ３で、１０％ ＦＢＳ、１００ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したα−Ｍｅｍ基本培地（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及びウルトラグルタミンを含む）中、２．０×１０⁴個細胞／ｃｍ²の密度でプレーティングし、この培養培地で維持した。コンフルエントの時点で、培地を、１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０μｇ／ｍｌインスリン、２００μＭインドメタシン、０．５ｍＭイソブチル−１−メチルキサンチン及び１μＭデキサメタゾンを含むＤＭＥＭ−ＬＧからなる脂肪生成分化培地に交換した（非特許文献１７参照）。

全培地を１週間に２回、３週間の間交換し、その後、オイルレッドＯを用いる特異的染色アッセイを実施し、脂肪生成分化が確認された。このために、培養培地を、吸引によって組織培養フラスコ（ＮＵＮＣ）から注意深く除去し、４％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を、室温で１０分間固定化した。次いで、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、濾過したオイルレッドＯ溶液とともに（２：３）、室温で少なくとも１０分間培養した。次いで、オイルレッドＯ溶液を除去し、細胞を水で注意深く洗浄した（非特許文献１７参照）。試験は、脂肪生成分化について陽性であった（図５）。

単離された細胞の前駆体表現型の実証：軟骨形成分化。

軟骨形成分化のために、細胞をＰ３で、１．１×ｌ０⁶個細胞／ｍｌの最終密度に再懸濁し、コニカル１５ｍｌ試験管中にプレーティングし、軟骨球体（ｃｈｏｎｄｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）を形成させた。使用した培養培地は、１％ ＦＢＳ、６．２５μｇ／ｍｌインスリン、１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１及び５０μＭアスコルベート−２−ホスフェートを含むＤＭＥＭ−ＬＧからなる軟骨形成分化培地とした（非特許文献１７参照）。

全培地を、１週間に２回、４週間の間、軟骨球体の形成を妨げないよう注意深く交換し、その後、アルシアンブルー及びヘマトキシリンを用いる特異的染色アッセイを実施し、軟骨形成分化が確認された。このために、全培地を、吸引によって試験管から除去し、軟骨球体をＰＢＳで洗浄した。次いで、軟骨球体を寒天中に浸漬し、液体窒素気相中で凍結した。

ミクロトームを使用して、寒天を５μｍ厚の組織切片に切断した。これらの切片を、１％アルシアンブルーを用いて染色し、室温で５分間培養し、次いで、ＰＢＳで洗浄した。顕微鏡スライド上に固定された標本を、ヘマトキシリン溶液に通し、室温で５分間培養した。ヘマトキシリンは、ＰＢＳでの最終洗浄工程によって除去した（非特許文献１８参照）。試験の結果、軟骨形成分化について陽性であった（図５）。

単離された細胞の前駆体表現型の実証：心筋分化。

心筋分化が１８日間で起き、その間に、種々の培養培地を使用した（非特許文献１９参照）。細胞を、３０００個細胞／ｃｍ²の密度で、オルニチンでコーティングした１６ウェルチャンバースライドにプレーティングした。細胞を、１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したα−Ｍｅｍ基本培地（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及びウルトラグルタミンを含む）からなる培地Ｃ０にプレーティングした。プレーティングの２４時間後、培養培地を、１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｎｇ／ｍｌ β−ＦＧＦ及び１０μＭ ５−アザシチジンを補給したＤＭＥＭ−ＬＧからなる別の培地（培地Ｃ１）と置換した。

培地Ｃ１中の細胞をプレーティングした２４時間後、２回目の培地交換を実施して培地Ｃ２にした。培地Ｃ２は、１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び１０ｎｇ／ｍｌ β−ＦＧＦを補給したＤＭＥＭ−ＬＧ基本培地からなるものであった。細胞を、培地Ｃ２で２週間維持し、７２時間毎に培地を交換した。

並行して、対照（非分化）細胞を、５０００個細胞／ｃｍ²の密度でプレーティングし、培地０で維持した。分化期間の後、心筋細胞に対して特異的な、代表的な筋肉タンパク質、心筋トロポニンＴに対する一次抗体を用いて免疫蛍光アッセイを実施した。アッセイのために細胞の位置を定めるために、核酸に対して特異的な蛍光色素、ＤＡＰＩを用いて細胞核を染色した。予想された通り、典型的な心筋細胞形態をすでに示している、心筋分化手順に付された細胞だけが、蛍光シグナルを生じた（図６Ｄ）。

単離された細胞の前駆体表現型の実証：神経性分化／グリア分化。

神経性分化が、１２日間で起き、その間に、種々の培養培地を使用した（非特許文献１９参照）。細胞を、３０００個細胞／ｃｍ²の密度で、オルニチンでコーティングした１６ウェルチャンバースライドにプレーティングした。細胞を、１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ）、５ｎｇ／ｍｌ β−ＦＧＦ、０．５μＭレチノイン酸及び１ｍＭ ２−メルカプトエタノールを補給した基本ＩＭＤＭ培地からなる培養培地（培地Ｎ１）にプレーティングした。

プレーティングの３日後、培地Ｎ１を、１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭサイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）及び１００μＭアスコルベート−２−ホスフェートを補給した基本ＩＭＤＭ培地を含有する培地Ｎ２と交換した。

プレーティングの３日後、培地Ｎ２を、１０％ ＦＢＳ １００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭサイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）及び１０μＭヒドロコルチゾンを補給したＩＭＤＭ基本培地を含有する培地Ｎ３と交換した。

最後に、プレーティングの３日後、培地Ｎ３を、１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−１、１０ｎｇ／ｍｌ ＳＨＨ、１０ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦ、２５ｎｇ／ｍｌビトロネクチン、１００μＭアスコルベート−２−ホスフェート、１００μＭイソブチルメチルキサンチン、１０μＭフォルスコリン及び２０ｎＭ ＰＭＡを補給したＩＭＤＭ基本培地からなる培地Ｎ４と交換した。

並行して、対照（非分化）細胞を、５０００個細胞／ｃｍ²の密度でプレーティングし、培地Ｎ０で維持した（心筋分化手順を参照のこと）。

分化期間の後、ニューロン細胞に対して特異的な、β−チュブリン、ＩＩＩ型に対する一次抗体を用いて免疫蛍光アッセイを実施した。アッセイのための細胞の位置を定めるために、核酸に対して特異的な蛍光色素、ＤＡＰＩを用いて細胞核を染色した。予想された通り、典型的なグリア形態をすでに示している（図７Ｂ）神経性分化／グリア分化手順に付された細胞だけが、蛍光シグナルを生じた（図７Ｄ）。

Claims (11)

1. ヒト臍帯から細胞を単離するための方法であって、
   ａ）前記ヒト臍帯を血液から分離し、採取後７２時間以内に処理される場合には室温で、又は、４８〜１４４時間の範囲の時間内に処理される場合には２〜８℃の範囲の間、乾燥で又は１８６μｇ／ｍｌ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、４００μｇ／ｍｌ ＫＣｌ、６０μｇ／ｍｌ ＫＨ₂ＰＯ₄、２００μｇ／ｍｌ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、８０００μｇ／ｍｌ ＮａＣｌ、３５０μｇ／ｍｌ ＮａＨＣＯ₃、９０μｇ／ｍｌ ＮａＨ₂ＰＯ_４・７Ｈ₂Ｏ、２０００μｇ／ｍｌグルコースならびに１％のペニシリンとストレプトマイシンの等モル混合物を含有する滅菌溶液中に浸漬し、滅菌密閉容器で実験室施設に輸送する回収工程と、
   ｂ）１８６μｇ／ｍｌ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、４００μｇ／ｍｌ ＫＣｌ、６０μｇ／ｍｌ ＫＨ₂ＰＯ₄、２００μｇ／ｍｌ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、８０００μｇ／ｍｌ ＮａＣｌ、３５０μｇ／ｍｌ ＮａＨＣＯ₃及び９０μｇ／ｍｌ ＮａＨ₂ＰＯ_４・７Ｈ₂Ｏを含有する溶液での３回の臍帯洗浄工程と、
   ｃ）滅菌ピンセットを用いて実施される、外膜（羊膜）除去工程と、
   ｄ）前記臍帯を、メスを用いて、その縦軸に沿って横方向に分画して、２．５ｃｍの長さの画分を得る分画工程と、
   ｅ）凝血塊が同定された位置でメスを用いて切開を行い、前記凝血塊を除去する、ｄ）から得られた前記画分からの血液凝固除去工程と、
   ｆ）ｅ）から得られた画分を７つの群にし、７つの群が、以下の工程で独立に処理される、グループ化工程と、
   ｇ）１：２：２：３７の組織量（ｇ）、フラスコの底面積（ｃｍ²）、消化液容積（ｍｌ）及びフラスコ総容積（ｍｌ）間の一定割合を維持しながら、０．０７５％（重量／総消化液容積）の濃度のコラゲナーゼＩＩと０．１２５％（重量／総消化液容積）の濃度のトリプシンとを組み合わせた作用によって、ｐＨ緩衝した消化液を含有する滅菌密閉フラスコで実施され、前記フラスコを、培養時間、温度、散熱、周囲湿度及び撹拌の規定の条件下で、より詳しくは、各々２．５ｃｍ（２．５ｇ）を有し、血液凝固を含まない、７臍帯画分の群から出発し、３５ｍｌ容積の消化液を使用し、総容量が６５０ｍｌであり、消化時には６１５ｍｌと７つの群を浸漬させた容量との差分からなるヘッドスペースを有する非通気型密閉培養フラスコ中で培養し、消化液は、酵素を除いて、１８６μｇ／ｍｌ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、４００μｇ／ｍｌ ＫＣｌ、６０μｇ／ｍｌ ＫＨ₂ＰＯ₄、２００μｇ／ｍｌ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、８０００μｇ／ｍｌ ＮａＣｌ、３５０μｇ／ｍｌ ＮａＨＣＯ₃、９０μｇ／ｍｌ ＮａＨ₂ＰＯ_４・７Ｈ₂Ｏ、１０００μｇ／ｍｌグルコース及び７６μｇ／ｍｌ（０．２６０ｍＭ）ＥＤＴＡからなり、ｐＨ６．４以上を維持し、酵素反応液を、１００振動／分（ｏｐｍ）の一定速度での撹拌のもと、密閉乾式培養器中、３７℃の一定温度で４時間培養する、ｆ）から得られた７画分の各群の細胞解離工程と、
   ｈ）ｇ）に記載されるように、前記組織から解離した細胞を、消化が行われたフラスコで、室温で５〜３００分の範囲で行う静置水平培養と、前記消化液の消化後の上清である消化上清を、任意の未消化組織の吸引を避けながら、前記溶液のピペッティングによって５０ｍｌの遠心分離管に移すことと、次に、前記消化反応を行ったフラスコからのすべての未消化組織の除去を続け、前記遠心分離管に、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、グルタミン、抗生物質及び１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給した基本培養培地３５ｍｌを加え、非通気型フラスコカップが、フィルター含有通気型カップと置き換えられており、最大表面コンフルエンスが達成されるまで、接着及び細胞成長／増殖を促進するよう、７２時間毎に培養培地を交換して、７％ＣＯ₂を含有する加湿雰囲気中、３７℃で培養を続けることによって回収する第１次細胞回収段階と、
   ｉ）ｇ）に記載のとおりに、前記組織から解離し、ｈ）に記載されるようにして得られた前記消化上清中に含まれる細胞を、ｈ）から得た前記５０ｍｌ遠心分離管を、室温、３５０ｇで１０分間遠心分離し、遠心分離後に、前記３５ｍｌの上清を、フィルター含有通気型カップを備えた静置培養フラスコに移し、同じ培養フラスコに、３５ｍｌの、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、グルタミン、抗生物質及び１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した基本培養培地を加え、前記培養フラスコを、７％ＣＯ₂を含有する加湿雰囲気中、３７℃で培養し、最大表面コンフルエンスが達成されるまで、接着及び細胞成長／増殖を促進するよう、前記培養培地を７２時間毎に交換することによって回収する第２次細胞回収段階と、
   ｊ）ｇ）に記載のとおりに前記組織から解離した細胞を、ｉ）に記載のとおりに前記消化上清の遠心分離によって得られた細胞沈渣として回収し、２ｍｌの、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有するウシ胎児血清（ＦＢＳ）からなる溶液に再懸濁し、２ｍｌの細胞懸濁液及び０．５ｍｌのヘッドスペースを含有する２．５ｍｌの滅菌クライオバイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）中、１℃／分の温度低下速度で速度制御冷凍庫を使用して、−８０℃に低下させて直接凍結保存する、第３次細胞回収段階と、
   ｋ）最終細胞密度が、１．０ｍｌの細胞懸濁液及び０．５ｍｌのヘッドスペースを含有する１．５ｍｌ滅菌クライオバイアル中、３×１０ ⁶ 個細胞／ｍｌのものであるよう、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する、０．５ｍｌの細胞懸濁液及び０．５ｍｌのウシ胎児血清（ＦＢＳ）の溶液の混合物の液体窒素の気相における前記直接凍結保存からなる、細胞培養が最大表面コンフルエンスに達した後の、ｈ）及びｉ）に記載されるように始まった細胞集団の凍結保存段階と
   を含むことを特徴とするヒト臍帯から細胞を単離するための方法。
2. 細胞の大部分が、間葉系細胞にとって適当な表面及び培養培地において接着及び増殖する能力を有し、細胞の大部分が、細胞表面マーカーＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５を発現し、細胞の大部分が、細胞表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３４及びＣＤ４５を発現せず、細胞の大部分が、２４時間で１．７倍になる増殖速度と繊維芽細胞様形態を維持しながら、前記最大表面コンフルエンスに達するまで、接着及び拡大／増殖からなる最大１８段階の拡大能力を有し、細胞の大部分が、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心筋細胞及び神経細胞に、部分的に、又は最終的に分化する能力を維持することを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 最初の接着及び拡大サイクル（Ｐ０）の最後に、臍帯１グラムあたり８．６（±０．１）×１０ ⁵ 個細胞を生じることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の方法。
4. 前記工程ｋ）を伴うまたは伴うことなく、全身又は局所的な投与経路によって患者に細胞を投与し、患者への投与前では細胞はいかなる分化にも供されない細胞治療手順へ適用することを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項記載の方法。
5. 前駆細胞又は幹細胞の増殖、分化および移植効果の支持体として、単離した細胞を使用することを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項記載の方法。
6. 単離した細胞を、サイトカイン又はケモカインの合成によって免疫調節能による治療に使用することを特徴とする請求項５記載の方法。
7. 単離した細胞を、病的患部、腫瘍増殖が存在する領域に遊走及び／又は接着する細胞の能力による細胞治療に使用することを特徴とする請求項４乃至６の何れか１項記載の方法。
8. 前記細胞を、天然又は合成の分子又は分子化合物、タンパク質、ペプチド、小有機分子、オリゴ糖、多糖、プロテオグリカン、脂質又はそれらの任意の組合せの局所投与のための担体として機能させることを特徴とする請求項４乃至７の何れか１項記載の方法。
9. 細胞が、中間の凍結保存段階を伴って又は伴わずに、中間の細胞拡大段階を伴って又は伴わずに、全身又は局所的な投与経路によって患者に投与され、細胞を事前に、部分的又は最終的に分化した、ヒト身体の任意の細胞種、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心筋細胞及びグリア細胞を含めた神経細胞と平滑筋細胞、骨格筋細胞、腱細胞、線維芽細胞、毛包細胞、内分泌腺細胞、神経前駆細胞、グリア細胞以外の神経細胞、並びに、結膜上皮、皮膚上皮、角膜上皮、網膜上皮、肝臓上皮、腎臓上皮、膵臓上皮、小腸上皮、結腸上皮、膀胱上皮、子宮上皮、咽頭上皮及び喉頭上皮由来の細胞への誘導インビトロ分化を受ける細胞療法手順に適用されることを特徴とする請求項４乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
10. 無傷の細胞、細胞抽出物又は細胞成分を含有する薬理学的組成物から単離した細胞を使用することを特徴とする請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
11. 哺乳類細胞培養のための表面及び／又は表面層及び／又は支持体の製造において、前記薬理学的組成物を使用することを特徴とする請求項１０に記載の方法。