KR102087084B1

KR102087084B1 - 항노화인자를 발현하는 지방유래 줄기세포의 대량 배양방법

Info

Publication number: KR102087084B1
Application number: KR1020200012437A
Authority: KR
Inventors: 이홍기; 이성훈; 김상헌; 진정아; 강태욱; 소수빈; 윤진상
Original assignee: 주식회사 이에이치엘바이오
Priority date: 2020-02-03
Filing date: 2020-02-03
Publication date: 2020-03-10

Abstract

본 발명은 항노화인자를 발현하는 지방유래 줄기세포의 대량 배양방법 및 지방유래 줄기세포의 증식배양용 배지 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항노화인자를 발현하는 지방유래 줄기세포의 대량 배양방법은 클로소(Klotho) 단백질을 처리함이 없이, 5-아자시티딘(5-Azacytidine) 및 PPAR-γ(Peroxisome proliferation activated receptor-γ) 작용제를 이용하여 항노화 인자 Foxo1, Foxo3a 및 Klotho의 발현을 증가시키고, 줄기세포 마커 Oct4, Sos2 및 Nanog의 발현을 증가시켜 줄기세포의 줄기성(Stemness)을 증가시킬 수 있다.

Description

항노화인자를 발현하는 지방유래 줄기세포의 대량 배양방법{CULTURE METHOD OF ADIPOSE-DRIVED STEM CELL PROLIFERATION EXPRESSING ANTI-AGING FACTORS}

줄기세포는 스스로 재생할 수 있고, 적절한 생체신호와 외부 자극에 의해 다양한 유형의 세포로 분화할 수 있는 미분화 세포이다. 줄기세포가 다양한 질병에 대한 세포치료제로써의 사용될 수 있는 가능성이 여러 연구들을 통해 밝혀져 왔다. 줄기세포는 배아줄기세포와 성체줄기세포로 구분된다. 그 중 성체줄기세포는 조혈모세포와 중간엽 줄기세포로 구분되며 중간엽 줄기세포는 제대혈, 골수, 지방 조직, 골격근 및 말초 혈액 등 인체의 다양한 조직으로부터 분리 될 수 있다.

지방 유래 줄기세포는 중간엽 줄기세포의 일종으로 지방조직을 교원질 분해효소로 처리함으로써 얻을 수 있는 세포 중 세포 배양용기에 부착하여 자라는 성질을 가진 세포이다. 지방 유래 줄기세포는 인체 내 다른 조직에 비하여 비교적 위험성이 적은 간단한 지방흡입술로 쉽게 얻을 수 있으며 그 양 또한 풍부하다는 점이 장점이다. 지방 유래 줄기세포를 이용하여 형태적인 모양, 면역학적 특징, 다양한 조직으로의 분화 가능성 및 활용가능성에 대한 많은 연구들이 선행되어 왔다. 이러한 연구들에서 지방 유래 줄기세포는 주변분비작용(paracrine effect) 또는 분화를 통한 창상치유와 면역기능의 조절, 세포사 예방 등의 다양한 효과가 있음이 밝혀졌다. 또한, 멜라닌 생성을 억제하며 광노화로 유발된 주름을 개선, 콜라겐 생성을 증가 시킨다고 보고된 바 있다(Kim WS et al., 2009; Kim WS et al., 2007.). 또한 최근에는 지방 유래 줄기세포의 배양액 성분을 이용하여 노화에 따른 피부의 다양한 문제들을 해결할 수 있는 재생의학적인 치료개념의 화장품이 연구되고 있다.

한편, 정상 세포는 정상적인 신진대사 활동을 함에도 불구하고 일정 기간 동안 세포분열을 하고 나면 더 이상 분열을 할 수 없는 상태에 빠진다. 이를 세포 노화(replicative senescence)라고 한다(Hayflick L., 1965). 노화된 세포는 특징적인 형태학적, 생화학적 변화를 나타낸다. 형태학적으로 세포 모양이 편평해지면서 커지고(Wagner M et al., 2001), 세포 내 소기관의 파괴, 세포막의 손상 등이 관찰 된다. 생화학적으로 노화 세포는 성장인자나 세포 사멸에 대한 반응이 늦어지고, p16, p21, p53과 같은 세포 분열 억제 인자들의 발현이 증가하며, G1 세포 주기 정지(G1 arrest), 노화 특이적 베타 갈락토시다아제 (SA-β-galactosidase)의 활성이 증가하는 것이 특징이다(Dimri GP et al., 1995). 이처럼 세포 노화는 세포의 체외 배양시 겪게 되는 필연적인 과정으로 다양한 생리적, 병리적 변화를 수반한다. 세포 노화는 Hayflick에 의해서 처음으로 보고된 현상으로 시간에 의해서 결정되는 것이 아닌 일정한 분열횟수에 의하여 결정된다고 알려져 있다(Cristofalo VJ et al, 1996). 최근 인구의 노령화가 심화되면서 여러 각도에서 인간 수명 및 그 조절에 관한 관심이 높아지고 있으며, 특히 세포 생물학적 노화기전 규명에 관한 연구와 항노화 물질을 개발하려는 연구들이 시도되고 있다.

본 발명자들은 특허출원 제10-2018-0171427호(발명의 명칭 “지방 유래 줄기세포의 증식배양용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용한 지방 유래 줄기세포의 배양 방법”)에서 클로소(Klotho)를 필수 구성요소로 포함하는 배지 조성물을 개시한바 있다.

본 발명자들은 지방 유래 줄기세포의 증식배양용 배지 조성물에 관한 후속 연구를 진행하던 중, 인간 재조합 단백질인 클로소(Klotho)를 포함하지 않고도, 5-아자시티딘(5-Azacytidine) 및 PPAR-γ(Peroxisome proliferation activated receptor-γ) 작용제를 처리함으로서 항노화 인자 및 줄기세포 마커의 발현량이 현저히 증가할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 5-아자시티딘(5-Azacytidine) 및 PPAR-γ(Peroxisome proliferation activated receptor-γ) 작용제를 이용한 항노화인자를 발현하는 지방유래 줄기세포의 대량 배양방법 및 지방유래 줄기세포의 증식배양용 배지 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "줄기세포(stem cell)"이란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, "성체 줄기세포"는 발생과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계 혹은 성체단계에서 나타나는 줄기세포를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "중간엽 줄기세포"는 인간 또는 포유류의 조직으로부터 분리해 낸 미분화된 줄기세포로서, 다양한 조직에서 유래할 수 있다. 특히, 제대 유래 중간엽 줄기세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포, 골수 유래 중간엽 줄기세포, 지방 유래 중간엽 줄기세포, 근육 유래 중간엽 줄기세포, 신경 유래 중간엽 줄기세포, 피부 유래 중간엽 줄기세포, 양막 유래 중간엽 줄기세포 및 태반 유래 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 각 조직에서 줄기세포를 분리하는 기술은 당해 업계에 이미 공지되어 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "지방 유래 줄기세포"란 지방조직에서 분리해 낸 미분화 줄기세포로, 그 분리 방법은 예를 들어 다음과 같을 수 있다. 즉, 지방흡입술로부터 얻어지는 생리 식염수에 부유된 지방 함유 suspension을 배양한 다음, 플라스크 등 배양용기에 부착된 줄기세포 층을 트립신으로 처리한 다음 회수하거나, 스크래퍼로 긁어서 소량의 생리 식염수에 부유되는 것을 직접 회수하거나 하는 방법 등을 통해 지방 유래 중간엽 줄기세포를 분리할 수 있다

제1구현예에 따르면,

본 발명은 항노화인자를 발현하는 지방유래 줄기세포의 대량 배양방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:

(I) 지방유래 줄기세포를 5-아자시티딘(5-Azacytidine)으로 처리하는 단계; 및

(II) 5-아자시티딘 처리된 지방유래 줄기세포를 PPAR-γ(Peroxisome proliferation activated receptor-γ) 작용제로 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 지방유래 줄기세포의 대량 배양방법에 있어서, 상기 5-아자시티딘은 0.5 내지 5 μM을 12 내지 48시간 동안 처리하는 것을 특징으로 한다. 바람직하기는 상기 5-아자시티딘은 1 μM은 24 내지 48시간 동안 처리하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 지방유래 줄기세포의 대량 배양방법에 있어서, 상기 PPAR-γ 작용제는 10 내지 100 nM의 양으로 12 내지 48시간 동안 처리하는 것을 특징으로 한다. 바람직하기는, 상기 PPAR-γ 작용제는 50 nM의 양으로 24 내지 48시간 동안 처리하는

본 발명에 따른 지방유래 줄기세포의 대량 배양방법에 있어서, 상기 배지 조성물은 Oct4, Sox2 및 Nanog의 발현의 발현 발현을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 지방유래 줄기세포의 대량 배양방법에 있어서, 상기 배지 조성물은 Foxo1, Foxo3a 및 Klotho의 발현 발현을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

제2구현예에 따르면,

본 발명은 항노화인자를 발현하는 지방유래 줄기세포의 증식배양용 배지 조성물에 관한 것으로, 상기 배지 조성물은

5-아자시티딘(5-Azacytidine)을 포함하는 제1배지조성물 및 PPAR-γ(Peroxisome proliferation activated receptor-γ) 작용제를 포함하는 제2배지조성물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 지방유래 줄기세포의 증식배양용 배지 조성물에 있어서, 상기 제1배지조성물 및 제2배지조성물을 각각 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM-F12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax, AminoMaxⅡ complete Medium 및 Chang's Medium MesemCult-XF Medium으로 구성된 군으로부터 선택되는 기본 배지를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 지방유래 줄기세포의 증식배양용 배지 조성물에 있어서, 상기 5-아자시티딘은 0.5 내지 5 μM, 바람직하기는 1 μM의 양으로 함유되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 지방유래 줄기세포의 증식배양용 배지 조성물에 있어서, 상기 PPAR-γ 작용제는 10 내지 100 nM, 바람직하기는 50 nM의 양으로 함유되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 지방유래 줄기세포의 증식배양용 배지 조성물에 있어서, 상기 배지 조성물은 Oct4, Sox2 및 Nanog의 발현의 발현 발현을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 지방유래 줄기세포의 증식배양용 배지 조성물에 있어서, 상기 배지 조성물은 Foxo1, Foxo3a 및 Klotho의 발현 발현을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항노화인자를 발현하는 지방유래 줄기세포의 대량 배양방법은 세포의 배양속도를 증가시키고, 체외 장기 배양으로 인한 복제적 노화를 감소시킬 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 항노화인자를 발현하는 지방유래 줄기세포의 대량 배양방법은 클로소(Klotho) 단백질을 포함 없이, 5-아자시티딘(5-Azacytidine) 및 PPAR-γ(Peroxisome proliferation activated receptor-γ) 작용제를 이용하여 항노화 인자 Foxo1, Foxo3a 및 Klotho의 발현을 증가시키고, 줄기세포 마커 Oct4, Sox2 및 Nanog의 발현을 증가시켜 줄기세포의 줄기성(Stemness)을 증가시킬 수 있다. 따라서, 지방 유래 줄기세포를 장기, 대량 배양하여 세포치료제로서 산업적으로 활발히 이용할 수 있는 계기가 마련될 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 줄기세포 관련 유전자의 발현량을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에 따른 항노화 관련 유전자의 발현량을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예 2에 따른 줄기세포 관련 유전자의 발현량을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예 2에 따른 항노화 관련 유전자의 발현량을 나타낸다.

이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

실시예 1 : 5-AZA 처리에 따른 줄기세포 마커 및 항노화 인자 발현량 분석

지방 유래 줄기세포를 4번 계대한 뒤, 1X10⁵개를 계수하여 60mm 배양접시에 접종하였다. 5-Azacytidine(이하 5-AZA)은 1 μM의 농도로 처리하였으며, 처리 시간은 0, 3, 6, 12, 24, 48 시간을 처리하였다. 시약 처리 후 세포를 수거하여 1500rpm에서 5분간 원심분리 한 뒤 상층액을 제거하고, 1XPBS(Gibco)를 이용하여 세척해주었다. 상층액을 제거한 세포 펠렛을 TAKARA MiniBEST Universal RNA Extraction Kit (Cat. #9767)를 이용하여 total RNA를 추출하였고, PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit (Cat. 6110A)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. SYBR Green Premix Ex Taq II (Cat. #RR820S/A/B)를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 유전자 발현 레벨을 분석하였다. Housekeeping gene으로 GAPDH를 사용하였고, 줄기세포의 유전자 발현 확인을 위해 대표적 줄기세포 마커인 Oct4, Sox2, Nanog와 항노화인자 마커인 Foxo1, Foxo3A, Klotho의 발현을 확인하였다.

그 결과, 5-AZA를 24 시간 이상 처리한 실험군에서 줄기세포 마커인 Sox2와 Nanog의 발현이 최소 2배 이상 증가함을 확인하였고(도 1), 항노화 관련 인자로 알려진 Foxo1, Foxo3a, Klotho의 유전자 발현 또한 최소 2배 이상 증가함을 확인하였다(도 2).

실시예 2: 5-AZA 및 MCC-555 처리에 따른 줄기세포 마커 및 항노화 인자 발현량 분석

각 계대의 지방 유래 줄기세포를 5X10⁴개를 계수하여 6-well plate 배양접시에 접종하였다. 대조군은 아무 시약도 처리하지 않았으며 실험군과 동일하게 3번의 계대를 진행하였다. 실험군은 접종 후 5-AZA 1 μM을 24시간동안 처리한 뒤, MCC-555 50 nM의 배지로 갈아주었다. 이후 계대 시에는 5-AZA는 처리하지 않고 MCC-555만을 50 nM로 처리하여 배양하였다. 처리 후 세포를 수거하여 1500rpm에서 5분간 원심분리 한 뒤 상층액을 제거하고, 1XPBS(Gibco)를 이용하여 세척해주었다. 상층액을 제거한 세포 펠렛을 TAKARA MiniBEST Universal RNA Extraction Kit (Cat. #9767)를 이용하여 total RNA를 추출하였고, PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit (Cat. 6110A)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. SYBR Green Premix Ex Taq II (Cat. #RR820S/A/B)를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 유전자 발현 레벨을 분석하였다. Housekeeping gene으로 GAPDH를 사용하였고, 줄기세포의 유전자 발현 확인을 위해 대표적 줄기세포 마커인 Oct4, Sox2, Nanog와 항노화인자 마커인 Foxo1, Foxo3a, Klotho의 발현을 확인하였다.

그 결과, 5-AZA와 MCC-555를 함께 처리한 3번째 계대 실험군에서 줄기세포 마커인 Oct4, Sox2, Nanog의 발현이 최소 20배 이상 증가함을 확인하였고(도 3), 항노화 관련 인자로 알려진 Foxo1, Foxo3a, Klotho의 유전자 발현 또한 최소 2배 이상 증가함을 확인하였다(도 4).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

(I) 지방유래 줄기세포를 5-아자시티딘(5-Azacytidine)으로 처리하는 단계; 및
(II) 5-아자시티딘 처리된 지방유래 줄기세포를 PPAR-γ(Peroxisome proliferation activated receptor-γ) 작용제로 처리하는 단계를 포함하는 항노화인자를 발현하는 지방유래 줄기세포의 대량 배양방법.
제1항에 있어서,
상기 5-아자시티딘은 0.5 내지 5 μM을 12 내지 48시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 것인, 항노화인자를 발현하는 지방유래 줄기세포의 대량 배양방법.
제1항에 있어서,
상기 PPAR-γ 작용제는 10 내지 100 nM의 양으로 12 내지 48시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 것인, 항노화인자를 발현하는 지방유래 줄기세포의 대량 배양방법.
제1항에 있어서,
상기 배지 조성물은 Oct4, Sox2 및 Nanog의 발현의 발현 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 것인, 항노화인자를 발현하는 지방유래 줄기세포의 대량 배양방법.
제1항에 있어서,
상기 배지 조성물은 Foxo1, Foxo3a 및 Klotho의 발현 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 것인, 항노화인자를 발현하는 지방유래 줄기세포의 대량 배양방법.
5-아자시티딘(5-Azacytidine)을 포함하는 제1배지조성물 및 PPAR-γ(Peroxisome proliferation activated receptor-γ) 작용제를 포함하는 제2배지조성물을 포함하는, 항노화인자를 발현하는 지방유래 줄기세포의 증식배양용 배지 조성물.
제6항에 있어서,
상기 제1배지조성물 및 제2배지조성물을 각각 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM-F12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax, AminoMaxⅡ complete Medium 및 Chang's Medium MesemCult-XF Medium으로 구성된 군으로부터 선택되는 기본 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 항노화인자를 발현하는 지방유래 줄기세포의 증식배양용 배지 조성물.