CN114456981A - 一株耐盐碱地固氮大豆根瘤菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株耐盐碱地固氮大豆慢生根瘤菌及其应用。本发明分离获得一株渥太华慢生根瘤菌Dian菌株，已于2022年1月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62202。本发明研究表明，该菌株具有结瘤率高和固氮能力强的特性，能够优化碱性土壤作物根系生长微生态环境；采用Dian菌株对植株进行处理，能有效促进大豆结瘤固氮，增加植株氮素营养，促进植株生长，能显著提高大豆植株的生物量、根瘤数和氮含量。该菌株尤其适用于石漠化地区大豆的栽培生产，扩充了固氮根瘤菌的菌种资源库，有利于促进植株结瘤固氮，增加植株的氮素营养。

Description

一株耐盐碱地固氮大豆根瘤菌及其应用

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域。更具体地，涉及一株耐盐碱地固氮大豆根瘤菌及其应用。

背景技术

根瘤菌(Rhizobium)是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌。豆科植物与根瘤菌之间的共生固氮体系一直是研究热点。而土壤的物理化学特性是影响根瘤菌与豆科植株共生固氮的重要因素。在喀斯特生态***中，与豆科植物共生的根瘤菌以慢生根瘤菌属为主(刘璐等，2018)。已有研究表明，豆科植物与根瘤菌形成共生固氮体系能够改善因污染和退化而导致的土壤结构变差以及土壤养分不足等问题。例如，李建华(2010)在山西矿区复垦土壤上种植白三叶草的同时接种了根瘤菌。结果显示接种根瘤菌后白三叶草平均株高、平均冠幅分别比对照组高出了53.87％、32.33％，显著高于不接种根瘤菌的种植方式。另外，刘晓光等(2006)在内蒙古武川旱农的大田试验中也发现，在风蚀退化的土壤中，直接接种根瘤菌能够明显促进土壤团聚体的形成，改良土壤结构，增加土壤肥力，改善土壤蓄水状况，提高土壤的抗风蚀能力。除此之外，根瘤菌也能够改善石漠化地区土壤的理化性质，促进植被的生长。吕成群等(2008)发现广西喀斯特地区台湾相思(Acacia confusa Merr)的根瘤菌对高钙和偏碱土壤具有较强适应能力，且该根瘤菌能够分泌酸，从而改良喀斯特碱性土壤，加速林下植被的更新。

大豆是典型的固氮作物，也是我国主要的粮油作物。根瘤菌与大豆形成共生固氮体系，并且为大豆生长提供氮素。接种高效根瘤菌是促进大豆共生固氮，改善大豆氮素营养的重要措施。目前，大部分的根瘤菌均是分离自新鲜根瘤中，且都属于慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)，如中国专利CN101182478A公开了一种根瘤固氮菌株系BDYD1及其应用，其菌株BDYD1为慢生根瘤菌属，具有耐酸铝、高效结瘤的特性，该根瘤菌适用于华南酸性土壤地区。目前鉴定出的大多数慢生根瘤菌只适用于华南酸性土壤地区，而无法适用于碱性土壤，如石漠化地区的盐碱土壤。因此，为了扩充固氮根瘤菌的微生物菌种资源库，有必要筛选出更多新的具有高效固氮能力的微生物菌株，充实微生物菌种资源库。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供一株耐盐碱地固氮大豆根瘤菌及其应用。

本发明的第一个目的是提供一株耐盐碱地固氮大豆根瘤菌。

本发明的第二个目的是提供所述菌株的应用。

本发明的第三个目的是提供一种固氮微生物制剂。

本发明的第四个目的是提供所述固氮微生物制剂的应用。

本发明的第五个目的是提供一种促进大豆结瘤固氮的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明从贵州兴义石漠化地区种植的大豆根瘤中分离并筛选出一株根瘤菌Dian。该菌株形态特征如下：慢生型，生长最适温度为28℃，在YMA平板培养基上，形成近似圆形、粘稠、光滑、突起、乳白色菌落。光学显微镜下为短杆状，大多数运动，无芽孢。革兰氏染色为红色，革兰氏阴性菌。本发明对菌株的16S rDNA基因序列进行测序分析，Dian菌株的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，利用GenBank数据库中的BLAST程序对测序结果进行相似性检索，并通过MEGA 4.1软件进行多重序列比对及***发育树的构建，表明本发明提供的根瘤菌菌株的16S rDNA基因序列与慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.)的菌株Bradyrhizobiumottawaense strain OO99的序列相似性达到99.34％，从而鉴定为慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.)-渥太华慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium ottawaense)Dian菌株。

本发明提供一株耐盐碱地固氮大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)Dian菌株，所述菌株于2022年1月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC No：62202。

本发明研究表明，Dian菌株具有产酸和水解淀粉的特性，而一般的根瘤菌是没有水解淀粉的能力的，从而可将Dian菌株用于食品或者化工行业，替代淀粉酶进行水解淀粉；由于石漠化地区是碱性土壤，因此Dian菌株的产酸特性能够帮助优化碱性土壤作物根系生长微生态环境，促进植物的生长。将该菌株接种到植株上，能有效促进大豆结瘤固氮，增加植株氮素营养，促进植株生长，能显著提高大豆植株的生物量、根瘤数和氮含量。该菌株尤其适用于石漠化地区大豆的栽培生产，有利于促进植株结瘤固氮，增加植株的氮素营养。

因此，本发明提供的根瘤菌Dian菌株在增强大豆对石漠化土壤环境的适应性和促进植被恢复，以及促进大豆结瘤固氮、促进植株生长、提高大豆产量中的应用均在本发明的保护范围。

本发明提供所述根瘤菌Dian菌株在制备适用于石漠化地区的固氮微生物制剂中的应用。

本发明提供一种固氮微生物制剂，含所述根瘤菌Dian菌株和/或其菌液。

优选地，所述菌液为菌悬液。

优选地，所述菌悬液的OD值为0.6±0.05。

优选地，制备所述菌悬液的发酵条件为24～32℃，pH 6.8～7.0。

更优选地，发酵条件为28℃，pH 7.0。

本发明提供上述固氮微生物制剂在促进大豆结瘤固氮、促进植株生长中的应用，尤其是在促进石漠化地区大豆结瘤固氮、植株生长中的应用。

本发明还提供一种促进大豆结瘤固氮的方法，采用上述Dian菌株、菌液或微生物制剂对植株进行处理。

本发明具有以下有益效果：

本发明从大豆根瘤中分离并筛选出一株慢生根瘤菌Dian菌株，所述Dian菌株具有结瘤率高和固氮能力强的特性；接种慢生根瘤菌Dian对大豆的生物量有显著影响，对大豆植株鲜重增加了21.69％，还显著提高了大豆叶片的SPAD值和含氮量，分别增加幅度为12.26％和40.02％，从而促进植物的生长。通过回接试验表明，接种Dian菌株可显著提高大豆植株全氮含量，所以，利用本发明Dian菌株制备的微生物制剂可以用于大面积的推广施用，增强大豆对石漠化盐碱地土壤环境的适应性，提高大豆产量和促进当地植被恢复，该菌株为生产适合石漠化土壤的大豆微生物肥料提供了重要的微生物资源。

附图说明

图1为慢生根瘤菌Dian经革兰氏染色后在显微镜下的形态特征；

图2为慢生根瘤菌Dian的16S rDNA序列***发育树状图(注：圆圈为实验分离纯化得到的大豆根瘤菌，其他为参照根瘤菌)；

图3为慢生根瘤菌Dian柠檬酸盐反应、明胶液化反应、3-酮基乳糖反应溶磷能力检测、淀粉水解反应、石蕊牛奶反应；

图4为慢生根瘤菌Dian砂培回接大豆效果；

图5为砂培接种慢生根瘤菌Dian菌株对大豆生物量，氮含量和固氮酶活性的影响(注：*:0.01<P<0.05，**:0.001<P<0.01，***:P<0.001)。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

下述实施例采用的培养基和营养液的配方如下：

固体YMA培养基：甘露醇10g，酵母浸粉3g，K₂HPO₄ 0.25g，KH₂PO₄ 0.25g，无水MgSO₄0.2g，NaCl 0.1g，琼脂15g，用水定容至1000mL，调pH值为7.0～7.2，121℃灭菌30min。

液体YMA培养基：甘露醇10g，酵母浸粉3g，K₂HPO₄ 0.25g，KH₂PO₄ 0.25g，无水MgSO₄0.2g，NaCl 0.1g，用水定容至1000mL，调pH值为7.0～7.2，121℃灭菌30min。

淀粉固体培养基：可溶性淀粉20g，蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，琼脂15g，用水定容至1000mL，121℃灭菌15min。

低氮营养液成分为：(1)大量元素：56.676g/L Ca(NO₃)₂·4H₂O，13.24g/L(NH₄)₂SO₄，38.418g/L KNO₃，147.89g/L MgSO₄·7H₂O，34.025g/L KH₂PO₄，106.54g/L CaCl₂·2H₂O，264.88g/L K₂SO₄；

(2)微量元素：0.254g/L MnSO₄·7H₂O，0.431g/L ZnSO₄·7H₂O，0.125g/L CuSO₄·5H₂O，0.2g/L(NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O，14.68g/L Na₂-EDTA，0.95g/L NaB₄O₇·4H₂O。

实施例1菌株的分离纯化

采集贵州兴义石漠化地区栽培的大豆根系上的根瘤，选取新鲜饱满的根瘤，在超净台中先将根瘤放在无菌水中浸泡5～6min，清除表面的杂质，用75％无水乙醇表面消毒3～5min后，再用3.5％的NaClO消毒8min，之后用无菌水将其冲洗9～10次；再用消过毒的刀子将单个根瘤切开后，再用镊子夹住根瘤在固体YMA培养基上划线，在28℃恒温培养箱中倒置培养5～7d直至有清晰的菌落长出，并且根据菌体的形态、大小、透明度、黏稠度、颜色、光泽等特征，对分离得到的根瘤菌单克隆进行3～4次的划线纯化，直到长出清晰的单克隆，挑取单菌落转接斜面，4℃低温保存，并将获得的菌株命名为Dian菌株。

根据以下方法可初步判断是否为根瘤菌：

菌落形态：根瘤菌的菌落为圆形、乳白色、半透明、边缘整齐，粘质较多。培养3～5天菌落直径达2～4mm为快生型根瘤菌，培养7～10天菌落直径达1mm则为慢生型根瘤菌。

实施例2菌株的鉴定

1、菌株的形态学鉴定

将实施例1中分离得到的Dian菌株接种在YMA固体培养基上进行培养，并观察记录。在最适生长条件pH 7.0，温度28℃培养5～7天后，将分离并纯化得到的菌株Dian进行单菌落状态观察，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态、菌落边缘状态。同时对处于对数生长期的Dian菌株，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。

结果如图1所示，表明Dian菌株属革兰氏染色阴性，短小杆状，无芽孢，大多数能运动。在固体YMA培养基平板上生长，菌落形态近似为为圆形、乳白色、半透明、边缘整齐，粘质较多，菌落直径达0.8mm～1mm。

2、菌株生理生化特征鉴定

菌株的生理生化特征鉴定参考《伯杰氏细菌鉴定手册》(布坎南，伯杰氏细菌鉴定手册中译第八版.北京：科学出版社，2011.)测定Dian菌株的生理生化特征。结果如图2所示，表明Dian菌株为化能异养型，好氧生长，能利用葡萄糖、乳糖生长；不能利用柠檬酸盐，明胶液化呈阴性，不利用3-酮基乳糖，不具有活化难溶性磷源能力；石蕊牛奶反应为酸凝。

3、菌株16S rDNA基因的序列测序及分析

提取上述步骤获得的菌体总DNA，利用细菌通用引物对16S rDNA-F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和16S rDNA-R(5′-TACGGCTACCTTCTTGTTAC-3′)扩增16S rDNA序列。

PCR反应体系(50μL)：2×PCR Buffer 25μL，引物16S rDNA-F/16S rDNA-R各2.0μL，dNTP 1.0μL，TaqDNA聚合酶1μL，模板2μL，灭菌ddH2O 17μL。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸2min，扩增35个循环；72℃延伸10min。

扩增产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳检测后，由广州擎科生物技术有限公司对PCR产物进行克隆测序，测序得到菌株的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

将所得的序列结果在美国国立生物信息中心(NCBI)进行BLAST检索，从中选择了10个相似性高的模式菌株作为参比菌株，利用MEGA4.1软件中的邻接法(Neighbor-joining)进行16S rDNA基因***发育树的构建。由比对结果和***发育树如图3所示，根瘤菌Dian 16S rDNA基因序列与慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.)的模式菌株Bradyrhizobium ottawaense strain OO99的序列相似性达到99.34％，并位于同一进化分支，从而确定根瘤菌Dian为为慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.)-渥太华慢生根瘤菌(Bradyrhizobium ottawaense)的新菌株系。

鉴于上述形态、生理生化特征分析和16S rDNA序列同源性分析结果，并确定分离纯化得到的菌株Dian鉴定为耐盐碱性的慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)，与Bradyrhizobium ottawaense属于同一种群，命名为渥太华慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumottawaense)Dian菌株，该菌株于2022年1月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No：62202，保藏单位地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例3大豆根瘤菌Dian菌株性能鉴定

配制1L YMA液体培养基，分装于3个三角瓶中，于121℃灭菌20min；将已纯化并达到对数生长期的根瘤菌菌液，吸取100μL菌液于装有YMA培养基的三角瓶中，在28℃的摇床以180r/min的转速振荡过夜至菌液OD₆₀₀值达到0.6±0.05后，分装于灭过菌的50mL离心管中，在离心机中以5000rpm离心10min后取出，倒掉上清液，用低氮营养液重悬得到菌悬液备用。

取配制好的根瘤菌悬液5μL于可溶性淀粉固体培养基上进行点板接种，在28℃恒温培养箱中培养3～5d至出现明显单克隆后，均匀滴加碘液于平板上，菌落周围产生透明圈者表明该菌株具有水解淀粉的能力。

实验结果如图2中的淀粉水解反应结果所示，显示其菌落周围产生较为明显的透明圈，表明大豆慢生根瘤菌Dian水解淀粉能力较强。而在石蕊牛奶的反应的鉴定中，与CK相比，Dian菌株使石蕊变红，表明该菌株是产酸的，由于石漠化地区是碱性土壤，因此Dian菌株的产酸特性能够帮助优化碱性土壤作物根系生长微生态环境，促进植物的生长。

实施例4慢生根瘤菌Dian的回接大豆试验

大豆种子灭菌：挑选种皮无破损、饱满、大小一致的大豆种子，采用氯气干消毒的方法(100mL次氯酸钠加4.8mL盐酸)对大豆种子表皮灭菌12h，将豆子拿出于超净工作台上吹10min后置于室温待用。

菌体培养：配制1L YMA液体培养基，分装于3个三角瓶中，于121℃灭菌20min；将已纯化并达到对数生长期的根瘤菌菌液，吸取100μL菌液于装有YMA培养基的三角瓶中，在28℃的摇床以180r/min的转速振荡过夜至菌液OD₆₀₀值达到0.6±0.05后，分装于灭过菌的50mL离心管中，在离心机中以5000rpm离心10min后取出，倒掉上清液，用低氮营养液重悬得到菌悬液备用。

砂培及接种：将细砂、中砂、粗砂按照1:1:1比例混合制得培养砂，充分混合均匀后装入小盆中，每个盆中放入三颗上述步骤中的大豆种子并置于温室大棚中培养；待种子萌发，子叶变绿尚未张开时，在接种处理的盆中接种100mL上述步骤中的菌悬液。

以不接种为对照，每个处理5个重复，接种35天后收获大豆植株，以植株鲜重、结瘤数、固氮酶活、植株含氮量和SPAD值作为测定根瘤菌的结合性和固氮能力的判断指标。

在空白对照(-N)无结瘤现象，而接种根瘤菌Dian能够促使大豆结瘤，即回接处理平均每株大豆可结大根瘤16个，小根瘤130个，根瘤剖面显示为深红色，测定其根瘤固氮酶活性为78.48μmol/h/g，初步判定供试Dian菌株为具有固氮效率的根瘤菌。

结果由图4所示，与低氮不接种处理相比，接种根瘤菌的大豆叶片在35天后由缺氮状态的黄叶明显转绿，表明供试菌株Dian具有较高的固氮效率。

在图5中表明接种根瘤菌Dian对大豆的生物量有显著影响，即与不接种根瘤菌相比，接种处理的大豆植株鲜重增加了21.69％。同时，接种根瘤菌Dian显著提高了大豆叶片的SPAD值和含氮量，与不接种对照相比分别增加幅度为12.26％和40.02％。进一步明确了供试菌株Dian为具有较高固氮效率的根瘤菌。

综上，本发明从贵州兴义石漠化地区种植的大豆根瘤中分离并筛选出一株根瘤菌Dian菌株。本发明研究表明，Dian菌株具有水解淀粉的能力，具有结瘤率高和固氮能力强的特性；通过回接试验发现，接种Dian菌株可显著提高大豆植株全氮含量，能够优化碱性土壤作物根系生长微生态环境，从而促进植物的生长，在改良石漠化盐碱地土壤生态***方面有广泛的实用价值。

利用本发明Dian菌株制备的微生物制剂可以用于大面积的推广施用，增强大豆对石漠化盐碱地土壤环境的适应性，提高大豆产量和促进当地植被恢复，该菌株为生产适合石漠化土壤的大豆微生物肥料提供了重要的微生物资源。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一株耐盐碱地固氮大豆根瘤菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1384

<212> DNA

<213> 渥太华慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium ottawaense）Dian菌株(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 1

gcgctgctta cctgcgagtc gagcgggcgt agcaatacgt cagcggcaga cgggtgagta 60

acgcgtggga acgtaccttt tggttcggaa caacacaggg aaacttgtgc taataccgga 120

taagccctta cggggaaaga tttatcgccg aaagatcggc ccgcgtctga ttagctagtt 180

ggtgaggtaa tggctcacca aggcgacgat cagtagctgg tctgagagga tgatcagcca 240

cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca 300

atgggggcaa ccctgatcca gccatgccgc gtgagtgatg aaggccctag ggttgtaaag 360

ctcttttgtg cgggaagata atgacggtac cgcaagaata agccccggct aacttcgtgc 420

cagcagccgc ggtaatacga agggggctag cgttgctcgg aatcactggg cgtaaagggt 480

gcgtaggcgg gtctttaagt caggggtgaa atcctggagc tcaactccag aactgccttt 540

gatactgaag atcttgagtc cgggagaggt gagtggaact gcgagtggta gaggtgaaat 600

tcgtagatat tcgcaagaac acccagtggc gaaggcggct cactggcccg gtactgacgc 660

tgaggcacga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa 720

cgatgaatgc cagccgttag tgggtttact cactagtggc gcagctaacg ctttaagcat 780

tccgcctggg gagtacggtc gcaagattaa aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca 840

agcggtggag catgtggttt aattcgacgc aacgcgcaga accttaccag cccttgacat 900

gtccaggacc ggtcgcagag atgtgacctt ctcttcggag cctggagcac aggtgctgca 960

tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaacccc 1020

cgtccttagt tgctaccatt tagttgagca ctctaaggag actgccggtg ataagccgcg 1080

aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcctcat ggcccttacg ggctgggcta cacacgtgct 1140

acaatggcgg tgacaatggg atgctaaggg gcgacccttc gcaaatctca aaaagccgtc 1200

tcagttcgga ttgggctctg caactcgagc ccatgaagtt ggaatcgcta gtaatcgtgg 1260

atcagcacgc cacggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg 1320

gagttggttt tacctgaaga cggtgcgcta acccgcaagg gaggcagccg gccacggtag 1380

ctca 1384

Claims (10)

1.一株耐盐碱地固氮大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)Dian菌株，其特征在于，所述菌株于2022年1月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC No：62202。

2.权利要求1所述慢生根瘤菌Dian菌株在增强大豆对石漠化土壤环境的适应性和/或促进植被恢复中的应用。

3.权利要求1所述慢生根瘤菌Dian菌株在促进大豆结瘤固氮、促进植株生长和/或制备固氮微生物制剂中的应用。

4.一种固氮微生物制剂，其特征在于，含权利要求1所述慢生根瘤菌Dian菌株和/或其菌液。

5.根据权利要求4所述微生物制剂，其特征在于，所述菌液为菌悬液。

6.根据权利要求5所述微生物制剂，其特征在于，所述菌悬液的OD值为0.6±0.05。

7.根据权利要求6所述微生物制剂，其特征在于，制备所述菌悬液的发酵条件为24～32℃，pH 6.8～7.0。

8.权利要求4-7任一所述固氮微生物制剂在促进大豆结瘤固氮和/或促进植株生长中的应用。

9.权利要求1所述慢生根瘤菌Dian菌株在提高大豆产量中的应用。

10.一种促进大豆结瘤固氮的方法，其特征在于，采用权利要求1所述慢生根瘤菌Dian菌株或其菌液，或采用权利要求4-7任一所述微生物制剂对植株进行处理。

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