CN111073827A - 一种贝莱斯芽孢杆菌jtb8-2及在瓜列当生物防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）JTB8‑2 GDMCC No：60755及其在瓜列当生物防治中的应用。本发明提供的编号为JTB8‑2的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），通过系列生理生化实验及***分类及***鉴定分析可知是一株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）的新菌种，利用分离出的菌种发酵液及发酵稀释液对瓜列当种子萌发的抑制率高达100%，使用菌株JTB8‑2菌株发酵液处理的瓜列当出土数量降低70.5%，瓜列当鲜重降低66.6%，对于瓜列当生物防治具有广泛的应用价值。

Description

一种贝莱斯芽孢杆菌JTB8-2及在瓜列当生物防治中的应用

技术领域

本发明涉及微生物菌种及其应用的技术领域，具体的涉及一种贝莱斯芽孢杆在生物防治中的应用的技术领域。

背景技术

瓜列当(Orabanche aegyptaica)是全寄生性高等植物，广泛地分布在地中海地区、亚洲西部和欧洲东部，对当地的农作物生产造成巨大的影响，被认为是世界范围内危害最严重的寄生性杂草。我国约有23种瓜列当，主要分布于新疆、吉林、甘肃、黑龙江、河北、山东、山西、陕西、辽宁、青海、内蒙古、四川等11个省份。在新疆瓜列当主要危害瓜类，多年来这种列当一直威胁着哈密瓜的生产，被寄生后，瓜的糖分下降，淡而无味，严重是不结瓜，一般的除草剂虽然能杀死列当但也伤害瓜株；拔出则损害瓜根。

近年来由于加工番茄种子大量无序地从国外和区外调入，植物检疫工作滞后，导致瓜列当在新疆大范围扩展蔓延，为害程度日益加重。根寄生杂草瓜列当(Orobancheaegyptiaca)严重危害打瓜、甜瓜和番茄等多种经济作物的产量和品质。如何有效防除瓜列当仍是当今研究重点之一。

近几年利用微生物防治瓜列当方法越来越受到重视，也是目前公认的成本低、效果好、较安全的抑制瓜列当生长方法。但不同微生物菌种对瓜列当生长的抑制能力有较大的差异，筛选优良的微生物菌种是研究生物防治瓜列当生长的重要步骤。目前报道的用于抑制瓜列当生长的菌株种类较少，主要包括镰刀菌、链格孢菌、腐霉菌等。因此，筛选有效抑制瓜列当生长能力的新菌株具有十分重要的意义。

贝莱斯芽孢杆菌来源于植物根际、土壤、植物内部、河流等各种生态环境，从植物根际分离的大部分贝莱斯芽孢杆菌可以在植物根部定殖，对抑制病原菌起着重要作用。近几年，国内外分离得到的贝莱斯芽孢杆菌，并对植物生长、抗病虫和诱导***抗病性等方面进行了研究，许多贝莱斯芽孢杆菌菌株在生物防治和作为粮食产量增产剂上起着重要作用。但利用贝莱斯芽孢杆菌进行瓜列当的生物防治尚未有相关文献报道。

发明内容

针对现有技术中尚未记载有关贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)领域在瓜列当生物防治方面应用的技术现状，本发明旨在为瓜列当生物防治技术提供具有显著防治效果的新菌株，通过在罹病瓜列当根际土壤中分离筛选出一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)JTB8-2，该菌种通过分类及***鉴定分析可知是一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)新菌种，通过利用这种新菌种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)在瓜列当生物防治中的应用，获得显著突出的生物防治效果，对于微生物菌种应用技术领域具有广泛的应用价值。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的技术方案：通过从罹病瓜列当根际土壤分离筛选获得一株编号为JTB8-2的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)(以下简称为“菌株JTB8-2”)，并经过系列鉴定确定为一株新菌种，利用液体发酵技术制备了贝莱斯芽孢杆菌发酵原液，通过施用发酵原液及发酵原液稀释液菌对瓜列当种子萌发具有显著的抑制作用，获得良好的效果，综合解决了贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) JTB8-2在瓜列当生物防治中的效果，同时方便实用。

进一步，本发明通过对新菌种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JTB8-2进行基因测序，序列参见附后提供的SEQ ID NO:1所示，所得序列经常见网站进行比对分析，结果发现，菌株 JTB8-2的16S rRNA基因序列与Bacillus velezensis JS64Y的同源性最高，为97.85％，菌株JTB8-2与Bacillus velezensis JS64Y的亲缘关系最近。利用本领域常见采用的MEGA 5.0软件通过Neighbor- Joining方法建立***进化树，结果经比对分析发现，菌株JTB8-2 与Bacillus velezensis JS64Y菌株来源于同一分支的可信度为96％，表明该菌种作为新菌种的支持率极高，在进化树中体现极好的稳定性，经过系列菌种鉴定可知该菌株JTB8-2确定其为贝莱斯芽孢杆菌 (Bacillus velezensis)新种，具有新菌种鲜明的典型性的特点，从分类学角度将菌株编号为JTB8-2的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)暂命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JTB8-2。

具体的，该菌株编号为JTB8-2的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)。地址：中国广州市先烈中路100 号，广东省微生物所，邮编：510070，保藏日期为2019年09月4 日，保藏号为GDMCC No：60755。

利用菌株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JTB8-2在NA 培养基上，细胞杆状，两端钝圆。单菌落表面光滑，为近圆形，乳白色，表面粗糙，近边缘***呈火山口状，边缘不完整。该菌能利用蔗糖、D-葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、D-甘露醇和半乳糖，水解淀粉和明胶，但不能水解纤维素。过氧化氢酶、V-P试验、硝酸盐还原和牛奶凝固与胨化等生理生化试验呈阳性，M.R.测定为阴性。需盐性及耐盐性测试表明，盐浓度0、5％为阳性，10％、20％为阴性。由此可见，菌株JTB8-2与常见的贝莱斯芽孢杆菌 (Bacillus velezensis)存在一些差异，具有一些新菌种的鲜明特征。

具体的，本发明利用分离自罹病瓜列当根际土壤的新菌种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JTB8-2 GDMCC No：60755的发酵液对对瓜列当种子萌发具有显著的抑制作用，具有被开发为瓜列当生物防治制剂的良好应用前景。

同时，本发明提供利用上述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JTB8-2菌株的发酵液。

进一步，本发明所述的新菌种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JTB8-2GDMCC No：60755菌株发酵液及发酵液1-500 倍稀释液均能够有效抑制瓜列当种子萌发。

优选的，本发明所述的新菌种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JTB8-2GDMCC No：60755菌株发酵液50-100倍稀释液对抑制瓜列当种子萌发效果极其显著。

同时，本发明采用上述的新菌种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JTB8-2GDMCC No：60755在瓜列当生物防治中的应用，通过浇灌其发酵液对瓜列当出土数量和瓜列当鲜重均具有显著的抑制作用，证实了采用本发明提供的新菌种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JTB8-2 GDMCC No：60755在瓜列当生物防治中具有显著突出的应用效果。

通过实施本发明提供上述具体技术方案，实施本发明内容，可以达到以下有益效果：

(1)本发明提供一种新菌种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JTB8-2，可在常见的NA培养基上生长，具有培养条件简单，繁殖快的特点，在营养琼脂培养基上，细胞杆状，两端钝圆。单菌落表面光滑，为近圆形，乳白色，表面粗糙，近边缘***呈火山口状，边缘不完整；该菌能利用蔗糖、D-葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、D-甘露醇和半乳糖，水解淀粉和明胶，但不能水解纤维素；通过过氧化氢酶、V-P试验、硝酸盐还原和牛奶凝固与胨化等生理生化试验呈阳性，M.R.测定为阴性；经盐性及耐盐性测试表明，盐浓度0、5％为阳性，10％、20％为阴性。并且利用本领域常见采用的MEGA 5.0软件通过Neighbor-Joining方法建立***进化树，结果经比对分析发现，菌株JTB8-2与Bacillus velezensis JS64Y 菌株来源于同一分支的可信度为96％，表明该菌种作为新菌种的支持率极高，在进化树中体现极好的稳定性，经过系列菌种鉴定可知该菌株JTB8-2确定其为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)新种，具有新菌种鲜明的典型性的特点。

(2)本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JTB8- 2在瓜列当生物防治中的应用，利用分离出的菌种发酵液及发酵稀释液对瓜列当种子萌发的抑制率高达100％，使用菌株JTB8-2菌株发酵液处理的瓜列当出土数量降低70.5％，瓜列当鲜重降低66.6％，对于瓜列当生物防治具有广泛的应用价值。

附图说明

图1所示为基于16SrDNA序列构建***发育树图。

图2所示为菌株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JTB8-2 GDMCC No：60755粗提液对瓜列当种子萌发抑制效果图。图中A 是菌株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)JTB8-2 GDMCC No： 60755发酵液处理瓜列当种子组，B是灭菌水处理瓜列当种子组。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。

本发明实施例中采用如下基础培养基：菌株分离纯化NA培养基：牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaCl 5g，琼脂17g，加蒸馏水至 1.0L，pH值为7.0；NA液体培养基：牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaCl 5g，加蒸馏水至1.0L，pH值为7.0。

DNA抽提试剂盒：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

实施例一：贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JTB8-2 GDMCC No：60755的分离、筛选及鉴定

(一)分离、纯化：

从土壤样品中，称取0.1g土壤样品加入到100mL无菌水中，使用玻璃棒搅拌均匀后静止备用(此为10^-3)。继续用无菌水进行梯度稀释，分别从10^-4、10^-5、10^-6、10^-7四个稀释度中各取150uL稀释液涂布于NA培养基平板上，置于28℃培养箱培养5d。从平板中挑取单菌落，接种于新的分离平板中进行纯化，重复3～4次进行纯化。纯化后的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JTB8-2接种于培养基上， 28℃培养箱恒温培养3～4d后，4℃保存备用。

(二)分类、鉴定：

1、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JTB8-2(以下简称为“菌株JTB8-2”)16S rDNA的序列测定与分析：

(1)PCR模板DNA的提取

将菌株JTB8-2接种于NA培养基中，28℃培养72h，获得菌体细胞，采用新型植物基因组DNA快速提取试剂盒进行基因组DNA 提取。

(2)PCR扩增

引物：

F16S-27:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

R16S-1492:5’-CGGTTACCTTGTTACGACTTC-3’。

反应体系：

组成	体积/ul
		2XMix	25
27F(10μM)	1
		1492R(10μM)	1
菌样模板	1
		ddH2O	22

PCR扩增条件为：预变性94℃5min；变性94℃30s，退火 54℃30s，延伸72℃1min30s，35个循环；延伸72℃10min。

(3)序列测定

PCR扩增产物经电泳检测和纯化后测序，其序列如SEQ ID NO:1所示。所得序列在NCBI网站进行比对分析，经比对分析发现，菌株JTB8-2的16S rRNA基因序列与Bacillus_velezensis JS64Y 的同源性最高，为97.85％，菌株JTB8-2与Bacillus_velezensis JS64Y的亲缘关系最近。利用本领域常见采用的MEGA 5.0软件通过Neighbor-Joining方法建立***进化树，发育树见附图1，结果经比对分析发现，菌株JTB8-2与Bacillus_velezensisJS64Y菌株来源于同一分支的可信度为96％，表明该菌种作为新菌种的支持率极高，在进化树中体现极好的稳定性，经过系列菌种分子水平鉴定可知该菌株JTB8-2确定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)新种，具有新菌种典型性的特点，从分类学角度暂命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JTB8-2。

将上述菌株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JTB8-2已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)。地址：中国广州市先烈中路100号，广东省微生物所，邮编：510070，保藏日期为2019年09月4日，保藏号为 GDMCC No：60755。

实施例二：贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JTB8-2 GDMCC No：60755生理生化特性测定

(1)通过生长条件研究结果显示菌株JTB8-2可生长温度为 15～45℃之间，最适培养温度为28℃；最适生长培养基为NA培养基，可在pH 6.0～10.0范围内生长，最适pH为7.0。

(2)菌株JTB8-2的生理生化特性情况如表1所示，菌株 JTB8-2革兰氏染色呈阳性，该菌能利用蔗糖、D-葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、D-甘露醇和半乳糖，水解淀粉和明胶，但不能水解纤维素。过氧化氢酶、V-P试验、硝酸盐还原和牛奶凝固与胨化等生理生化试验呈阳性，M.R.测定为阴性。需盐性及耐盐性测试表明，盐浓度0、5％为阳性，10％、20％为阴性。根据菌株的形态特征和生理生化特性，可以初步鉴定菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)。

表1：生理生化特性测定

菌株JTB8-2单菌落表面光滑，为近圆形，乳白色，表面粗糙，近边缘***呈火山口状，边缘不完整，细胞杆状，两端钝圆。

实施例三：贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JTB8-2 GDMCC No：60755发酵原液对种子萌发抑制效果

将纯化的菌株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JTB8-2 GDMCC No：60755单菌落接种至NA液体培养基中，28℃， 130r·min震荡培养24h作为种子培养液。取种子培养液5mL转入装有100mL NA液体培养基的三角瓶中，28℃，130r·min震荡培养 120h得到发酵原液备用。将一张whatman滤纸(GA/A)置于培养皿中，用无菌水浸湿，将20粒列当种子置于滤纸上，每处理4次重复。在每个培养皿中依次加入5mL GR24和5mL发酵液，阳性对照处理是5mL GR24和5mL灭菌水，阴性对照处理(NBCK)是5mL GR24和5mL液体培养基。在室温25℃，遮光条件下培养7～10d 后，体式显微镜下观察列当种子萌芽数量并记录。

试验结果表明，菌株JTB8-2原液对瓜列当种子萌发抑制率为 100％。

表2：菌株JTB8-2发酵原液对瓜列当种子萌发抑制效果

菌株编号	萌发率(％)	抑制率(％)	校正抑制率(％)
				JTB8-2	0	100	100
NBCK	85.97
				CK	93.68

实施例四：贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JTB8-2 GDMCC No：60755发酵稀释液对种子萌发抑制效果

将纯化的菌株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JTB8-2 GDMCC No：60755单菌落接种至NA液体培养基中，28℃， 130r·min震荡培养24h作为种子培养液。取种子培养液5mL转入装有100mL NA液体培养基的三角瓶中，28℃，130r·min震荡培养 120h得到发酵原液。将原液稀释使用灭菌水分别稀释50倍、100 倍、250倍和500倍。将一张whatman滤纸(GA/A)置于培养皿中，用无菌水浸湿，将20粒列当种子置于滤纸上。实验设置9个处理，分别为发酵液50倍液、100倍液、250倍液、500倍液、培养基稀释50倍液、100倍液、250倍液、500倍和CK，每处理4次重复。在每个培养皿中依次加入5mL GR24和5mL发酵液稀释液， CK处理是5mL GR24和5mL灭菌水，阴性对照处理是5mL GR24 和5mL液体培养基。在室温25℃，遮光条件下培养7～10d后，体式显微镜下观察列当种子萌芽数量并记录。

试验结果表明，菌株JTB8-2稀释液50倍和100倍对瓜列当种子萌发校正抑制率分别为100％和93.6％。

表3：不同稀释浓度菌株菌株JTB8-2发酵液对瓜列当种子萌发抑制效果比较

实施例五：盆栽试验测定菌株JTB8-2发酵液对瓜列当防治效果

采用基质穴盘育苗，番茄苗5～6片叶时将番茄苗移植到塑料盆中。塑料盆规格为直径25cm、高18cm，底部带孔。栽培土壤为土壤混合物(基质：蛭石：土壤＝1:1:2)，每盆装约4kg土壤混合物。将塑料盆中上层10cm左右土壤混合物取出后，将50mg(约10000粒) 列当种子装入600mL塑料瓶中，装入少量土，摇匀后均匀撒在塑料盆中，将1株番茄苗移栽至塑料盆后覆土。试验设置2个处理，分别为菌液处理和清水对照。每个处理3盆为一重复，设置3次重复。分别在番茄苗移栽后10d，25d和40d浇灌菌株发酵液，每盆浇灌400mL，对照浇灌清水400mL。盆栽番茄缓苗后放置在空旷地带，浇水、施肥均采用滴灌装置。列当出土15d后，拔出番茄植株，仔细冲洗番茄植株根部，调查番茄根部寄生列当数量，称取列当鲜重并记录，采用SPASS软件进行方差分析。

试验结果表明，菌株JTB8-2发酵液处理的瓜列当出土数量和瓜列当鲜重均显著低于空白对照。

表4：不同处理瓜列当出土数量和瓜列当鲜重比较

处理	瓜列当出土数量(株/盆)	瓜列当鲜重(克/盆)
			JTB8-2	2.78<sup>a</sup>	15.30<sup>a</sup>
CK	9.44<sup>b</sup>	45.83<sup>b</sup>

以上试验表明，本发明通过在罹病瓜列当根际土壤中分离筛选出的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JTB8-2 GDMCC No： 60755具有显著的瓜列当生物防治能力，利用分离出的菌种使用菌株JTB8-2菌株发酵液处理的瓜列当出土数量降低70.5％，瓜列当鲜重降低66.6％，对于瓜列当生物防治具有广泛的应用价值。

上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

序列表

<110> 新疆农业科学院植物保护研究所

<120> 一种贝莱斯芽孢杆菌JTB8-2及在瓜列当生物防治中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1444

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis JTB8-2)

<400> 1

gggtgctata ctgcaagtcg aggccacaga tgggtgcttg cagggtgatg ttaccgggcg 60

acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg ggaaaccggg 120

gctaataccg gatggttgtt tgaaccgcat ggttcagaca taaaaggtgg caacggctac 180

cacttacaca tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg 240

acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacacac ggactgagac acggggcaga 300

ctcctacggg aggctccagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac 360

gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga agaacaagtg 420

ccgttcaaat agggcggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc taactacgtg 480

ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaaggg 540

ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg gagggtcatt 600

ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta gcggtgaaat 660

gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt aactgacgct 720

gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac 780

gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc tgcagctaac gcattaagca 840

ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac 900

aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca 960

tcctctgaca atcctagaga taggacgtcc ccttcggggg cagagtgaca ggtggtgcat 1020

ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 1080

gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga caaaccggag 1140

gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac 1200

aatggacaga acaaagggca gcgaaaccgc gaggttaagc caatcccaca aatctgttct 1260

cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag taatcgcgga 1320

tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag 1380

agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggttt ggtttatgga gggtgccgcc gaacctgaca 1440

gagt 1444

Claims (5)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）JTB8-2，其特征在于，所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）JTB8-2的菌种保藏号为GDMCC No.60755。

2.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）JTB8-2，其特征在于，贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）JTB8-2的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

3.如权利要求1或2任意所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）JTB8-2在瓜列当生防中的应用。

4.如权利要求3所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）JTB8-2在瓜列当生防中的应用，其特征在于，使用菌株JTB8-2发酵液1-500倍稀释液均进行抑制瓜列当种子萌发。

5.如权利要求3所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）JTB8-2在瓜列当生防中的应用，其特征在于，使用菌株JTB8-2发酵液50-100倍稀释液均进行抑制瓜列当种子萌发。

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