CN112481384A - 一种检测人met基因扩增的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测人met基因扩增的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及人MET基因检测技术领域，尤其是指一种检测人MET基因扩增的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用，其应用为一种检测人MET基因扩增的方法，包括以下步骤：S1，提取受试者全血样本中的cfDNA；S2，以步骤S1中提取的cfDNA为模板，将待测样品cfDNA模板、用于检测人MET基因扩增的引物组合物、探针或试剂盒进行定量数字PCR反应，制备ddPCR混合液；S3，对步骤S2中PCR扩增反应后的产物进行信号收集；S4，根据步骤S3中收集的荧光信号类型判断待测样品中是否含有MET基因扩增。本发明敏感性高、准确性高、解读方便且易开展。

Description

一种检测人MET基因扩增的引物组合物、试剂和试剂盒及其 应用
技术领域
本发明涉及人MET基因检测技术领域，尤其是指一种检测人MET基因扩增的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用。
背景技术
MET基因位于人类7号染色体长臂(7q31)编码一种跨膜酪氨酸激酶受体，MET与配体肝细胞生长因子HGF结合后，发生二聚化并引起细胞内多种酪氨酸残基的磷酸化，进而激活一系列下游信号通路，促进肿瘤细胞增殖、生长、迁移、血管生成。cMET基因导致肿瘤可以通过三种形式：MET外显子14突变、MET基因扩增和MET过度表达。研究显示MET基因扩增能激活ErbB3/PI3K/AKT信号途径，引发对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)的耐药，MET基因高表达则预后不佳。MET基因扩增导致的EGFR-TKI耐药约占全部EGFR-TKI耐药的9.8～20.0％。因此，MET基因扩增检测可以很好的预测分子靶向药物的治疗效果，对指导临床开展非小细胞肺癌(NSCLC)的个体化靶向治疗具有重要意义。
目前MET基因扩增的检测方法主要有下一代测序(NGS)、荧光原位杂交(FISH)以及荧光定量PCR(qPCR)的方法。下一代测序(NGS)技术能够同时对多个样本同时检测，且可以对多个基因位点检测，但成本较高、实验周期较长，且数据分析复杂；荧光原位杂交(FISH)技术检测MET基因扩增特异性高，但是样本处理周期长，成本高(探针价格昂贵)，结果判读主观性和专业性较强，临床应用不易推广；荧光定量PCR(qPCR)技术虽然具有重复性好、特异性强等特点，但由于其依赖于标准曲线和Ct值，定量的准确度不够，且灵敏度比较差，目前该方法的灵敏度最好的为1％，无法满足某些高灵敏度的检测需求。因此，迫切需要一种新的MET基因扩增检测方案来克服上述缺陷。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测人MET基因扩增的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用，敏感性高、准确性高、解读方便且易开展。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种检测人MET基因扩增的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1，提取受试者全血样本中的cfDNA；
S2，以步骤S1中提取的cfDNA为模板，将待测样品cfDNA模板、用于检测人MET基因扩增的引物组合物、探针或试剂盒进行定量数字PCR反应，制备ddPCR混合液；
S3，对步骤S2中PCR扩增反应后的产物进行信号收集；
S4，根据步骤S3中收集的荧光信号类型判断待测样品中是否含有MET基因扩增；
所述步骤S2中的具体反应步骤如下：
S01，制备PCR混合物总体积18-22μL：其中14-18μL使用2X ddPCR Master Mix(Bio-Rad)和定制的40X TaqMan探针和引物配置的TaqMan PCR反应混合物，再加入1-4μL模板DNA；
S02，混合好地样品加入到液滴反应装置(Bio-Rad)，每个反应通道加入,60-80μL地反应油(Bio-Rad)，待反应液滴产生后，将样品转移到96孔PCR反应板，在传统地PCR仪中进行扩增反应。
优选地，检测MET基因扩增的引物组合物和探针，包括MET引物组和探针、内参基因引物组和探针；其中用于检测MET基因扩增的上游引物序列：5'-AGTTCGCTACGATGCAAGAGT-3'，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
用于检测MET基因扩增的下游引物序列：5'-AGTTGGGCTTACACTTCGGG-3'，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
用于检测MET基因扩增的探针序列：5'-TCCTCATTTGGATAGGCTTGTA-3'，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
内参基因为RPP30，内参基因的上游引物序列：5'-GATTTGGACCTGCGAGCG-3'，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
内参基因的下游引物序列：5'-GCTGTCTCCACAAGTCCGC-3'，核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；
内参基因的探针序列：5'-CTGACCTGAAGGCTCT-3'，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地，MET基因扩增区域的探针SEQ ID No.3和内参基因的探针SEQ ID NO.6均可独立地于5'端结合荧光基团，于3'端结合淬灭基团；MET基因扩增区域的探针SEQ IDNO.3和内参基因的探针SEQ ID NO.6的3'端均可独立的结合MGB修饰基团后再结合淬灭基团。探针5'端至3'端的方向上，依次为荧光基团，探针序列，MGB修饰基团和淬灭基团。
优选地，MET基因探针标记的荧光基团为FAM。
优选地，RPP30内参基因探针标记的荧光基团为VIC。
优选地，MET基因探针和RPP30内参基因标记的淬灭基团为NFQ。
优选地，PCR反应混合物中用于MET基因扩增的上游引物、下游引物、用于检测MET基因扩增的内参基因的上游引物、下游引物含量均为0.8-1.2μM，进一步优选地，为0.8μM。
优选地，PCR反应混合物中用于MET基因扩增的探针、用于检测MET基因扩增的内参基因的探针含量均为0.4-0.5μM，进一步优选地，为0.45μM。
优选地，PCR反应混合物中DNA模板地含量为2-3ng/μL，进一步优选地，为2.5ng/μL。
优选地，ddPCR反应条件为：88-94℃预变性10-20分钟；91-93℃变性51-58秒，50-54℃退火/延伸72-80s，共进行45-50个循环，11-13℃保持。
本发明的有益效果：
(1)针对MET基因扩增设计了特定序列的引物对和特定序列的探针，实现对MET基因扩增的高灵敏度检测，灵敏度可达到0.001％；
(2)可检测的样本来源多样，既可以是肿瘤组织DNA，也可以是cfDNA，扩大了该试剂盒的使用范围，实现无创检测MET基因扩增。
附图说明
图1为样本B的ddPCR具体扩增结果。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例与附图对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例1
1)、基于微液滴数字PCR技术检测MET基因扩增的引物和探针的设计与合成
基于基因组分析数据，对MET基因进行分析，使用Oligo软件分析TaqMan引物和探针的位点，从中选择最佳组合如下：
MET基因上、下游引物：
MET上游引物SEQ ID NO1：5'-AGTTCGCTACGATGCAAGAGT-3'
MET下游引物SEQ ID NO2：5'-AGTTGGGCTTACACTTCGGG-3'
2)、利用上述的引物进行PCR扩增时，扩增片段为73bp，特别适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增。
3)、MET基因检测探针：SEQ ID NO3：5'-TCCTCATTTGGATAGGCTTGTA
选用能够稳定扩增、且经过测试扩增效果跟MET保持一致的基因为内参基因。
4)、本实施例中选用的内参基因为RPP30，内参基因RPP30上、下游引物：
上游引物SEQ ID NO3：5'-GATTTGGACCTGCGAGCG-3'
下游引物SEQ ID NO4：5'-GCGGCTGTCTCCACAAGT-3'
5)、利用上述的引物进行PCR扩增时，扩增片段为62bp，特别适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增。
6)、内参基因RPP30检测探针：SEQ ID NO6：5'-CTGACCTGAAGGCTCT-3'。
7)、本发明的引物和探针的设计特异性强，应用于PCR检测时灵敏度可达0.001％；且利用此套引物进行PCR扩增，扩增出来的片段不到100bp，特别适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增，能从cfDNA中检测到极低丰度的MET基因扩增变异，对于指导临床治疗、改善患者预后有重要作用。
实施例2
提取待检样本中的cfDNA：
本实施例中的待检样本为血浆样本，样本编号分别为A，B，C，D和E；采用试剂盒提取血浆样本中的cfDNA，具体的操作参见QIAGEN公司的QIAamp Circulating Nuleacid Kit试剂盒说明书，并且以提取出的cfDNA作为ddPCR检测的模板，其中A、B和C为MET阳性样本，D和E为MET阴性样本。
实施例3
在PCR板中按照表1所示配比制备PCR反应液：其中cfDNA模板和内参基因的浓度均为2.5ng/μL。
表1 PCR反应液配置
试剂 用量
2×ddPCR Master Mix 10μL
cfDNA模板 2μL
各条引物 0.8μM
各探针 0.45μM
补DEPC水至 20μL
实施例4
将装有配制好的20μL数字PCR混合液的PCR板、新的96孔PCR板、枪头、微滴发生卡和微滴生成油装入AutoDG自动化微滴发生器，用于制备PCR微反应微滴。
将装有PCR微反应液滴的96孔PCR板用封板膜进行热封，生成的微反应液滴数量为10000～20000个。
将96孔PCR板放入PCR仪按照下面条件进行扩增反应：94℃预变性20分钟；93℃变性51秒，54℃退火/延伸75s，共进行45个循环，12℃保持。
实施例5
PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号类型判断待测样品中是否含有MET基因扩增。可用QuantaSoft(Bio-Rad)软件进行数据分析，计算样品中两个基因的拷贝数，然后用MET基因拷贝数去除以内参基因拷贝数，得到拷贝数比值结果。样本B具体扩增结果见图1。
表2不同样品ddPCR检测结果与HIC结果比对
样本编号 IHC结果 ddPCR结果(拷贝数比值)
A +++ 16.2
B ++ 2.66
C ++ 2.29
D - 1.45
E - 1.84
根据本发明的判断依据，结合ddPCR检测结果，样本A、B和C中两种基因的拷贝数比值均大于2，为MET阳性；而样本D和E中，两种基因拷贝数比值均小于2，为MET阴性。结果表明本发明的检测结果与IHC结果完全一致。
最后需要说明，上述描述仅为本发明的优选实施例，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测人MET基因扩增的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1，提取受试者全血样本中的cfDNA；
S2，以步骤S1中提取的cfDNA为模板，将待测样品cfDNA模板、用于检测人MET基因扩增的引物组合物、探针或试剂盒进行定量数字PCR反应，制备ddPCR混合液；
S3，对步骤S2中PCR扩增反应后的产物进行信号收集；
S4，根据步骤S3中收集的荧光信号类型判断待测样品中是否含有MET基因扩增；
所述步骤S2中的具体反应步骤如下：
S01，制备PCR混合物总体积18-22μL：其中14-18μL使用2X ddPCR Master Mix(Bio-Rad)和定制的40X TaqMan探针和引物配置的TaqMan PCR反应混合物，再加入1-4μL模板DNA；
S02，混合好地样品加入到液滴反应装置(Bio-Rad)，每个反应通道加入,60-80μL地反应油(Bio-Rad)，待反应液滴产生后，将样品转移到96孔PCR反应板，在传统地PCR仪中进行扩增反应。
2.根据权利要求1所述的一种检测人MET基因扩增的方法，其特征在于：检测MET基因扩增的引物组合物和探针，包括MET引物组和探针、内参基因引物组和探针；其中用于检测MET基因扩增的上游引物序列：5'-AGTTCGCTACGATGCAAGAGT-3'，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
用于检测MET基因扩增的下游引物序列：5'-AGTTGGGCTTACACTTCGGG-3'，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
用于检测MET基因扩增的探针序列：5'-TCCTCATTTGGATAGGCTTGTA-3'，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
内参基因为RPP30，内参基因的上游引物序列：5'-GATTTGGACCTGCGAGCG-3'，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
内参基因的下游引物序列：5'-GCTGTCTCCACAAGTCCGC-3'，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
内参基因的探针序列：5'-CTGACCTGAAGGCTCT-3'，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求2所述的一种检测人MET基因扩增的方法，其特征在于：MET基因扩增区域的探针SEQ ID No.3和内参基因的探针SEQ ID NO.6均可独立地于5'端结合荧光基团，于3'端结合淬灭基团；MET基因扩增区域的探针SEQ ID NO.3和内参基因的探针SEQ ID NO.6的3'端均可独立的结合MGB修饰基团后再结合淬灭基团。探针5'端至3'端的方向上，依次为荧光基团，探针序列，MGB修饰基团和淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的一种检测人MET基因扩增的方法，其特征在于：MET基因探针标记的荧光基团为FAM。
5.根据权利要求3所述的一种检测人MET基因扩增的方法，其特征在于：RPP30内参基因探针标记的荧光基团为VIC。
6.根据权利要求3所述的一种检测人MET基因扩增的方法，其特征在于：MET基因探针和RPP30内参基因标记的淬灭基团为NFQ。
7.根据权利要求1所述的一种检测人MET基因扩增的方法，其特征在于：PCR反应混合物中用于MET基因扩增的上游引物、下游引物、用于检测MET基因扩增的内参基因的上游引物、下游引物含量均为0.8-1.2μM，进一步优选地，为0.8μM。
8.根据权利要求1所述的一种检测人MET基因扩增的方法，其特征在于：PCR反应混合物中用于MET基因扩增的探针、用于检测MET基因扩增的内参基因的探针含量均为0.4-0.5μM，进一步优选地，为0.45μM。
9.根据权利要求1所述的一种检测人MET基因扩增的方法，其特征在于：PCR反应混合物中DNA模板地含量为2-3ng/μL，进一步优选地，为2.5ng/μL。
10.根据权利要求1所述的一种检测人MET基因扩增的方法，其特征在于：ddPCR反应条件为：88-94℃预变性10-20分钟；91-93℃变性51-58秒，50-54℃退火/延伸72-80s，共进行45-50个循环，11-13℃保持。
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