CN112481384A - 一种检测人met基因扩增的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及人MET基因检测技术领域,尤其是指一种检测人MET基因扩增的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用,其应用为一种检测人MET基因扩增的方法,包括以下步骤:S1,提取受试者全血样本中的cfDNA;S2,以步骤S1中提取的cfDNA为模板,将待测样品cfDNA模板、用于检测人MET基因扩增的引物组合物、探针或试剂盒进行定量数字PCR反应,制备ddPCR混合液;S3,对步骤S2中PCR扩增反应后的产物进行信号收集;S4,根据步骤S3中收集的荧光信号类型判断待测样品中是否含有MET基因扩增。本发明敏感性高、准确性高、解读方便且易开展。
Description
技术领域
本发明涉及人MET基因检测技术领域,尤其是指一种检测人MET基因扩增的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用。
背景技术
MET基因位于人类7号染色体长臂(7q31)编码一种跨膜酪氨酸激酶受体,MET与配体肝细胞生长因子HGF结合后,发生二聚化并引起细胞内多种酪氨酸残基的磷酸化,进而激活一系列下游信号通路,促进肿瘤细胞增殖、生长、迁移、血管生成。cMET基因导致肿瘤可以通过三种形式:MET外显子14突变、MET基因扩增和MET过度表达。研究显示MET基因扩增能激活ErbB3/PI3K/AKT信号途径,引发对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)的耐药,MET基因高表达则预后不佳。MET基因扩增导致的EGFR-TKI耐药约占全部EGFR-TKI耐药的9.8~20.0%。因此,MET基因扩增检测可以很好的预测分子靶向药物的治疗效果,对指导临床开展非小细胞肺癌(NSCLC)的个体化靶向治疗具有重要意义。
目前MET基因扩增的检测方法主要有下一代测序(NGS)、荧光原位杂交(FISH)以及荧光定量PCR(qPCR)的方法。下一代测序(NGS)技术能够同时对多个样本同时检测,且可以对多个基因位点检测,但成本较高、实验周期较长,且数据分析复杂;荧光原位杂交(FISH)技术检测MET基因扩增特异性高,但是样本处理周期长,成本高(探针价格昂贵),结果判读主观性和专业性较强,临床应用不易推广;荧光定量PCR(qPCR)技术虽然具有重复性好、特异性强等特点,但由于其依赖于标准曲线和Ct值,定量的准确度不够,且灵敏度比较差,目前该方法的灵敏度最好的为1%,无法满足某些高灵敏度的检测需求。因此,迫切需要一种新的MET基因扩增检测方案来克服上述缺陷。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测人MET基因扩增的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用,敏感性高、准确性高、解读方便且易开展。
为了解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案:
一种检测人MET基因扩增的方法,其特征在于:包括以下步骤:
S1,提取受试者全血样本中的cfDNA;
S2,以步骤S1中提取的cfDNA为模板,将待测样品cfDNA模板、用于检测人MET基因扩增的引物组合物、探针或试剂盒进行定量数字PCR反应,制备ddPCR混合液;
S3,对步骤S2中PCR扩增反应后的产物进行信号收集;
S4,根据步骤S3中收集的荧光信号类型判断待测样品中是否含有MET基因扩增;
所述步骤S2中的具体反应步骤如下:
S01,制备PCR混合物总体积18-22μL:其中14-18μL使用2X ddPCR Master Mix(Bio-Rad)和定制的40X TaqMan探针和引物配置的TaqMan PCR反应混合物,再加入1-4μL模板DNA;
S02,混合好地样品加入到液滴反应装置(Bio-Rad),每个反应通道加入,60-80μL地反应油(Bio-Rad),待反应液滴产生后,将样品转移到96孔PCR反应板,在传统地PCR仪中进行扩增反应。
优选地,检测MET基因扩增的引物组合物和探针,包括MET引物组和探针、内参基因引物组和探针;其中用于检测MET基因扩增的上游引物序列:5'-AGTTCGCTACGATGCAAGAGT-3',核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
用于检测MET基因扩增的下游引物序列:5'-AGTTGGGCTTACACTTCGGG-3',核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
用于检测MET基因扩增的探针序列:5'-TCCTCATTTGGATAGGCTTGTA-3',核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
内参基因为RPP30,内参基因的上游引物序列:5'-GATTTGGACCTGCGAGCG-3',核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;
内参基因的下游引物序列:5'-GCTGTCTCCACAAGTCCGC-3',核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示;
内参基因的探针序列:5'-CTGACCTGAAGGCTCT-3',核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地,MET基因扩增区域的探针SEQ ID No.3和内参基因的探针SEQ ID NO.6均可独立地于5'端结合荧光基团,于3'端结合淬灭基团;MET基因扩增区域的探针SEQ IDNO.3和内参基因的探针SEQ ID NO.6的3'端均可独立的结合MGB修饰基团后再结合淬灭基团。探针5'端至3'端的方向上,依次为荧光基团,探针序列,MGB修饰基团和淬灭基团。
优选地,MET基因探针标记的荧光基团为FAM。
优选地,RPP30内参基因探针标记的荧光基团为VIC。
优选地,MET基因探针和RPP30内参基因标记的淬灭基团为NFQ。
优选地,PCR反应混合物中用于MET基因扩增的上游引物、下游引物、用于检测MET基因扩增的内参基因的上游引物、下游引物含量均为0.8-1.2μM,进一步优选地,为0.8μM。
优选地,PCR反应混合物中用于MET基因扩增的探针、用于检测MET基因扩增的内参基因的探针含量均为0.4-0.5μM,进一步优选地,为0.45μM。
优选地,PCR反应混合物中DNA模板地含量为2-3ng/μL,进一步优选地,为2.5ng/μL。
优选地,ddPCR反应条件为:88-94℃预变性10-20分钟;91-93℃变性51-58秒,50-54℃退火/延伸72-80s,共进行45-50个循环,11-13℃保持。
本发明的有益效果:
(1)针对MET基因扩增设计了特定序列的引物对和特定序列的探针,实现对MET基因扩增的高灵敏度检测,灵敏度可达到0.001%;
(2)可检测的样本来源多样,既可以是肿瘤组织DNA,也可以是cfDNA,扩大了该试剂盒的使用范围,实现无创检测MET基因扩增。
附图说明
图1为样本B的ddPCR具体扩增结果。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解,下面结合实施例与附图对本发明作进一步的说明,实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例1
1)、基于微液滴数字PCR技术检测MET基因扩增的引物和探针的设计与合成
基于基因组分析数据,对MET基因进行分析,使用Oligo软件分析TaqMan引物和探针的位点,从中选择最佳组合如下:
MET基因上、下游引物:
MET上游引物SEQ ID NO1:5'-AGTTCGCTACGATGCAAGAGT-3'
MET下游引物SEQ ID NO2:5'-AGTTGGGCTTACACTTCGGG-3'
2)、利用上述的引物进行PCR扩增时,扩增片段为73bp,特别适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增。
3)、MET基因检测探针:SEQ ID NO3:5'-TCCTCATTTGGATAGGCTTGTA
选用能够稳定扩增、且经过测试扩增效果跟MET保持一致的基因为内参基因。
4)、本实施例中选用的内参基因为RPP30,内参基因RPP30上、下游引物:
上游引物SEQ ID NO3:5'-GATTTGGACCTGCGAGCG-3'
下游引物SEQ ID NO4:5'-GCGGCTGTCTCCACAAGT-3'
5)、利用上述的引物进行PCR扩增时,扩增片段为62bp,特别适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增。
6)、内参基因RPP30检测探针:SEQ ID NO6:5'-CTGACCTGAAGGCTCT-3'。
7)、本发明的引物和探针的设计特异性强,应用于PCR检测时灵敏度可达0.001%;且利用此套引物进行PCR扩增,扩增出来的片段不到100bp,特别适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增,能从cfDNA中检测到极低丰度的MET基因扩增变异,对于指导临床治疗、改善患者预后有重要作用。
实施例2
提取待检样本中的cfDNA:
本实施例中的待检样本为血浆样本,样本编号分别为A,B,C,D和E;采用试剂盒提取血浆样本中的cfDNA,具体的操作参见QIAGEN公司的QIAamp Circulating Nuleacid Kit试剂盒说明书,并且以提取出的cfDNA作为ddPCR检测的模板,其中A、B和C为MET阳性样本,D和E为MET阴性样本。
实施例3
在PCR板中按照表1所示配比制备PCR反应液:其中cfDNA模板和内参基因的浓度均为2.5ng/μL。
表1 PCR反应液配置
试剂 | 用量 |
2×ddPCR Master Mix | 10μL |
cfDNA模板 | 2μL |
各条引物 | 0.8μM |
各探针 | 0.45μM |
补DEPC水至 | 20μL |
实施例4
将装有配制好的20μL数字PCR混合液的PCR板、新的96孔PCR板、枪头、微滴发生卡和微滴生成油装入AutoDG自动化微滴发生器,用于制备PCR微反应微滴。
将装有PCR微反应液滴的96孔PCR板用封板膜进行热封,生成的微反应液滴数量为10000~20000个。
将96孔PCR板放入PCR仪按照下面条件进行扩增反应:94℃预变性20分钟;93℃变性51秒,54℃退火/延伸75s,共进行45个循环,12℃保持。
实施例5
PCR扩增反应后的产物进行信号收集,根据荧光信号类型判断待测样品中是否含有MET基因扩增。可用QuantaSoft(Bio-Rad)软件进行数据分析,计算样品中两个基因的拷贝数,然后用MET基因拷贝数去除以内参基因拷贝数,得到拷贝数比值结果。样本B具体扩增结果见图1。
表2不同样品ddPCR检测结果与HIC结果比对
样本编号 | IHC结果 | ddPCR结果(拷贝数比值) |
A | +++ | 16.2 |
B | ++ | 2.66 |
C | ++ | 2.29 |
D | - | 1.45 |
E | - | 1.84 |
根据本发明的判断依据,结合ddPCR检测结果,样本A、B和C中两种基因的拷贝数比值均大于2,为MET阳性;而样本D和E中,两种基因拷贝数比值均小于2,为MET阴性。结果表明本发明的检测结果与IHC结果完全一致。
最后需要说明,上述描述仅为本发明的优选实施例,本领域的技术人员在本发明的启示下,在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下,可以做出多种类似的表示,这样的变换均落入本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种检测人MET基因扩增的方法,其特征在于:包括以下步骤:
S1,提取受试者全血样本中的cfDNA;
S2,以步骤S1中提取的cfDNA为模板,将待测样品cfDNA模板、用于检测人MET基因扩增的引物组合物、探针或试剂盒进行定量数字PCR反应,制备ddPCR混合液;
S3,对步骤S2中PCR扩增反应后的产物进行信号收集;
S4,根据步骤S3中收集的荧光信号类型判断待测样品中是否含有MET基因扩增;
所述步骤S2中的具体反应步骤如下:
S01,制备PCR混合物总体积18-22μL:其中14-18μL使用2X ddPCR Master Mix(Bio-Rad)和定制的40X TaqMan探针和引物配置的TaqMan PCR反应混合物,再加入1-4μL模板DNA;
S02,混合好地样品加入到液滴反应装置(Bio-Rad),每个反应通道加入,60-80μL地反应油(Bio-Rad),待反应液滴产生后,将样品转移到96孔PCR反应板,在传统地PCR仪中进行扩增反应。
2.根据权利要求1所述的一种检测人MET基因扩增的方法,其特征在于:检测MET基因扩增的引物组合物和探针,包括MET引物组和探针、内参基因引物组和探针;其中用于检测MET基因扩增的上游引物序列:5'-AGTTCGCTACGATGCAAGAGT-3',核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
用于检测MET基因扩增的下游引物序列:5'-AGTTGGGCTTACACTTCGGG-3',核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
用于检测MET基因扩增的探针序列:5'-TCCTCATTTGGATAGGCTTGTA-3',核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
内参基因为RPP30,内参基因的上游引物序列:5'-GATTTGGACCTGCGAGCG-3',核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;
内参基因的下游引物序列:5'-GCTGTCTCCACAAGTCCGC-3',核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;
内参基因的探针序列:5'-CTGACCTGAAGGCTCT-3',核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求2所述的一种检测人MET基因扩增的方法,其特征在于:MET基因扩增区域的探针SEQ ID No.3和内参基因的探针SEQ ID NO.6均可独立地于5'端结合荧光基团,于3'端结合淬灭基团;MET基因扩增区域的探针SEQ ID NO.3和内参基因的探针SEQ ID NO.6的3'端均可独立的结合MGB修饰基团后再结合淬灭基团。探针5'端至3'端的方向上,依次为荧光基团,探针序列,MGB修饰基团和淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的一种检测人MET基因扩增的方法,其特征在于:MET基因探针标记的荧光基团为FAM。
5.根据权利要求3所述的一种检测人MET基因扩增的方法,其特征在于:RPP30内参基因探针标记的荧光基团为VIC。
6.根据权利要求3所述的一种检测人MET基因扩增的方法,其特征在于:MET基因探针和RPP30内参基因标记的淬灭基团为NFQ。
7.根据权利要求1所述的一种检测人MET基因扩增的方法,其特征在于:PCR反应混合物中用于MET基因扩增的上游引物、下游引物、用于检测MET基因扩增的内参基因的上游引物、下游引物含量均为0.8-1.2μM,进一步优选地,为0.8μM。
8.根据权利要求1所述的一种检测人MET基因扩增的方法,其特征在于:PCR反应混合物中用于MET基因扩增的探针、用于检测MET基因扩增的内参基因的探针含量均为0.4-0.5μM,进一步优选地,为0.45μM。
9.根据权利要求1所述的一种检测人MET基因扩增的方法,其特征在于:PCR反应混合物中DNA模板地含量为2-3ng/μL,进一步优选地,为2.5ng/μL。
10.根据权利要求1所述的一种检测人MET基因扩增的方法,其特征在于:ddPCR反应条件为:88-94℃预变性10-20分钟;91-93℃变性51-58秒,50-54℃退火/延伸72-80s,共进行45-50个循环,11-13℃保持。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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