CN101921710B - 过度养殖区水体微生物修复剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种过度养殖区水体微生物修复剂，其是由下列细菌组成：芽孢杆菌属Bacillus、假单胞菌属Pseudomonas、短小芽孢杆菌Bacillus pumilus和不动杆菌属Acinetobacter；保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号分别为CGMCC No：3737、3739、3752、3712；上述细菌的质量比为1.4～1.7∶1.0～1.4∶0.9～1.1∶1.2～1.5，本发明是具有修复水环境过度养殖区且对养殖生物无害的微生态制剂，能抑制水体中有害微生物繁殖和生长，净化水质，提高水产品品质和性能。
Description
技术领域
本发明属于应用生物技术领域，涉及一种水环境过度养殖区微生物修复剂。
背景技术
微生物作为一种生态调节剂，治理养殖水环境可以明显改善水质，增加溶氧，降低氨氮与亚硝酸氮，抑制有害微生物的繁殖，降解有机物，同时具有成本低收效大等优点而日益受到重视。
随着水产集约化养殖的出现，养殖模式主要以投饵为主，且养殖密度大幅度提高，导致水体中残饵、粪便、氮、磷等富营养因子增多，促使微生物大量繁殖(包括致病菌)，COD、氨氮含量上升，溶氧下降，有的已超过国家三类水质标准，养殖环境不断恶化，使得水产养殖业遭受巨大损失，据估计每生产一吨虾会使水体中增加0.2吨的氮元素和0.05吨的磷元素，其结果是导致鱼虾病害和产量下降。因此水质好坏对养殖成败和产量大小有着很大的影响；水质良好，病原菌少，养殖的水生动物生长自然就好，而水质条件差，有毒物质积累，病原菌多且致病力强，养殖的水生动物便容易受到侵害。现有技术中，常使用化学药品来杀菌，但这样造成病原体产生抗药性，且药品的大量残留，污染水环境，同时会杀害水中有益细菌，造成水生生态的失调。因此向养殖区投入微生物制剂是改良水质的良好的方法，当向养殖水体中投入一定量的微生物制剂和菌种后，可以抑制有害微生物的生长，增加溶氧，降低氨氮与亚硝酸氮的含量，抑制有害微生物的繁殖，降解有机物，同时具有成本低收效大的优点，可以建立一种新的微生态平衡关系，改良水质，使养殖生物健康的生长发育。
有益微生物一般都是在实验条件下从土壤、水体底泥中分离筛选出来的，单一的微生物仅对某种有机污染物有特定的降解能力；基因工程菌虽能增强微生物制剂的净化功能，但生物安全又是难以逾越的生态问题。
微生物制剂投入养殖水体后，其降解活性受温度、DO等环境因子的影响，不适宜的温度、湿度、pH值和DO等环境因子会使微生物制剂的有效性降低或丧失，市场上的一些微生物制剂不能适应过度养殖区的原位环境条件，使其中的微生物不能很快的成为水体中的优势种群，修复效果很不明显，且这些外来的微生物对养殖鱼类的安全性造成潜在的威胁，限制了这些微生物在水环境养殖区微生物修复领域的应用。
发明内容
本发明是提供一种具有修复水环境过度养殖区且对养殖生物无害的微生态制剂。
本发明的目的是提供一种微生物制剂，由下列细菌组成：芽孢杆菌属Bacillus、假单胞菌属Pseudomonas、短小芽孢杆菌Bacillus pumilus和不动杆菌属Acinetobacter；保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号分别为CGMCC No：3737、3739、3752、3712；所述芽孢杆菌属Bacillus CGMCCNo：3737、假单胞菌属Pseudomonas CGMCC No：3739、短小芽孢杆菌 Bacilluspumilus CGMCC No：3752和不动杆菌属Acinetobacter CGMCC No：3712的质量比为1.4～1.7∶1.0～1.4∶0.9～1.1∶1.2～1.5。
本发明筛选菌株的菌落形态
芽孢杆菌属Bacillus CGMCC No：3737在营养琼脂上的菌落形态：菌落不规则，表面色暗，不透明，培养后期变成褐色，菌落较大。
假单胞菌属Pseudomonas CGMCC No：3739在营养琼脂上的菌落形态：菌落呈圆形，乳白色，不透明，表面光滑，边缘整齐，菌落较大。
短小芽孢杆菌Bacillus pumilus CGMCC No：3752在营养琼脂上的菌落形态：菌落不透明，乳白色，表面光滑，边缘整齐，菌落较小。
不动杆菌属Acinetobacter CGMCC No：3712在营养琼脂上的菌落形态：菌落无色，不透明，呈圆形，表面光滑，边缘整齐，菌落较小。
本发明的有益效果
(1)该微生态制剂用于水产养殖具有显著效益，可有效降低养殖水质中亚硝酸盐、氨氮、硫化氢等物质的浓度，抑制水体中有害微生物繁殖和生长，净化水质，提高水产品品质和性能。
(2)该微生物制剂具有投资小、效益高、使用方便等优点，且无毒、无害、无药物残留、不产生耐药性，长期使用可以减少养殖过程中抗生素的使用量，减少病害发生。
(3)该微生物制剂可迅速降解水体中的残存饲料、鱼类的粪便及其它有机物，特别是清除池塘长时间的养殖水体底部，如海边老虾池底部积累的残余饲料、***废物、动植物残体；同时，还能吸收利用水体中的氨、亚硝酸盐、硫化氢等有害物质，能有效避免固体有机物和有害物质的积累。这些藻类为主的浮游植物所产生的光合作用，又为池塘底栖动物，水产动物的呼吸，有机物的分解提供氧气，从而形成池塘良性的生态循环，促使有益微生物的大量繁殖，在池塘内形成优势种群，可抑制病原微生物的繁殖，减少疾病发生。
附图说明
图1是本发明发酵培养的空气净化***图；
图2是本发明菌剂的制备方法流程图；
图3是本发明菌株的对鱼饲料COD的去除率变化曲线图。
本发明所使用的菌株为：芽孢杆菌属Bacillus CGMCC No：3737、假单胞菌属Pseudomonas CGMCC No：3739、短小芽孢杆菌Bacillus pumilus CGMCCNo：3752、不动杆菌属Acinetobacter CGMCC No：3712，上述菌株代号分别为KB2、SL3、WZ3和WXW1。
具体实施方式
实施例：
实施例1-4见下表：
将本发明的这四株细菌按常规发酵后的培养基混入粘土、沸石粉吸附物质，经过低温压缩制成颗粒，吸附物质与培养基的质量比例为7∶3，制成微生物修复制剂，每克微生态修复制剂含菌量约100亿。使用时，先进行活化，活化方法是从过度养殖区水体中盛一些水倒入盛放制剂的器皿中，静置一晚上，然后第二天泼到过度养殖区水体中。
本发明四种菌种的筛选、培养和发酵过程
1、本发明菌种的富集和分离
取实验泥样置于塑料槽内，加入鱼饲料和灭菌淡水，培养一周后再加入鱼饲料，循环25天，取出泥样，稀释，涂布培养于TSB培养基上，28℃培养24h，划线分离得菌株，将上述菌株采用试管保种法保藏于4℃冰箱中。
TSB培养基组分：胰蛋白胨17克，植物蛋白胨3克，氯化钠2.5克，磷酸氢二钾2.5克，葡萄糖2.5克，1000mL蒸馏水。
2、筛选菌株
将上述保藏在冰箱中的菌株用TSB培养基活化，挑取单菌落接种于鱼饲料固体培养基上，28℃培养48小时，取生长较快、形成的菌落较大的菌株，这些细菌生长较快说明能利用鱼饵料作为唯一的碳源和氮源作为其生长所必需的营养。将这些生长较快、形成的菌落较大的菌株接种于鱼饲料液体培养基上，每天采用重铬酸钾法测定培养液的COD值，最终筛选到本发明的四株对鱼饲料分解能力较强的细菌。
3、本发明菌株分类地位的确定
将本发明四种菌株的16S rRNA序列通过NCBI的BLAST同源性搜索及MEGA 4软件***发育树评估，鉴定这四株细菌的分类地位，并保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，它们分别是：芽孢杆菌属Bacillus CGMCC No：3737、假单胞菌属Pseudomonas CGMCC No：3739、短小芽孢杆菌Bacillus pumilusCGMCC No：3752和不动杆菌属Acinetobacter CGMCC No：3712，在本发明中编号分别为KB2、SL3、WZ3和WXW1。
4、发酵培养
(1)、培养基成分
发酵培养基的主要成分有：豆粕、麦麸、淀粉，无机盐。
(2)、培养基灭菌
方法：采用湿热灭菌法。
(3)、空气除菌
采用空气过滤除菌的方法，空气过滤***如附图1所示，1为空气吸气口、2粗过滤器、3空气压缩机、4一级空气冷却器、5二级空气冷却器、6分水器、7空气贮罐、8旋风分离器、9丝网除沫器、10空气加热器、11总空气过滤器、分过滤器。
(4)、种子制备
种子制备包括实验室种子制备及生产车间种子制备
实验室种子制备的培养基为固体培养基，主要成分有豆粕、淀粉及无机盐，培养温度为30摄氏度，
培养时间2～8天，不同菌种培养时间有差别，依照不同菌株的常规实验方法来确定。生产车间种子制备亦采用固体培养基，主要成分豆粕、麦麸、淀粉及无机盐，培养温度为30摄食度，2级发酵。
(5)、发酵培养
采用带机械搅拌的筒柱式反应器将本发明四种菌进行固态混合发酵，培养基主要成分豆粕、麦麸、淀粉和无机盐；发酵条件：温度为30摄氏度，pH 7，盐度5。
如附图2所示为本发明菌剂的制备方法流程图，可以清楚的看到整个制备过程。
下面对本发明四种细菌进行生成条件实验、生态安全实验、拮抗性实验、协同性及作用效果检测实验。
一、有机物降解菌生长条件试验
1、实验方法
牛肉膏蛋白胨液体培养基基础成分(基础成分包括胰蛋白胨10克，牛肉膏3克，1000mL蒸馏水，pH7.4)，用氯化钠调节其盐度梯度为：0、5、10、15、20、25、30、35、40，将有机质降解菌接种到这几个浓度梯度的细菌培养液中，28℃下培养，每隔4h用分光光度计测定菌液的OD600值，比较菌株在这几个盐度梯度下的生长情况。
将本发明的四种细菌接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基内。分别在8℃、12℃、16℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、40℃、44℃几个温度梯度下培养，每隔4h用分光光度计测定菌液的OD600值，比较菌株在这几个温度梯度下的生长情况。
牛肉膏蛋白胨液体培养基，用煮沸的质量浓度为5％的氢氧化纳和质量浓度为10％稀盐酸调节pH值，使其pH梯度为5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4。将本发明的四种细菌接种到这几个浓度梯度的细菌培养液中，28℃下培养，每隔4h用分光光度计测定菌液的OD600值，以比较本发明菌株在这几个pH梯度下的生长情况。
2、实验结果
如表1所示，本发明的四株细菌生长的最适宜温度大多在28℃～30℃之间，可生长温度范围在16℃～36℃；最适宜生长的pH值在7.4左右，可生长的pH范围在6.4～8.4之间；最适宜生长的盐度大多为5～10左右，可生长盐度范围在0～20之间。
本发明菌株的生长条件试验表明本发明的四株细菌对温度环境的适应能力较强，且适宜生长温度与水环境养殖区的最适生长温度相吻合。
二、降解菌生态安全试验
塑料水槽消毒后，加入20升灭菌淡水，水槽中分别放入5～10cm的30尾鲤鱼、鲢鱼、草鱼、鳙鱼四种鱼，每种鱼设三个平行。将本发明的微生物修复剂制成菌悬液接入水槽内，使其在水槽内中的终浓度维持在106～107CFU/mL，以无菌淡水组作为对照，连续通气，依据养殖对象投喂相应的饵料早晚各一次，记录养殖对象的的存活情况以及及时清除死亡个体。
实验结果如表2、3、4和5所示，养殖10天后，将所得数据进行差异性检验，试验组与对照组的成活率无明显差别，证明本发明四株菌对试验品种生长无任何毒副作用。
三、本发明菌株的拮抗性实验
将本发明四株细菌在TSB培养基上活化，取单菌落于生理盐水中制成菌悬液，将一种菌的菌悬液涂布于TSB固体培养基表面，圆形无菌纸片于另一种菌的菌悬液中浸润，贴到涂布菌液的TSB培养基表面，48h后观察有无抑菌圈，检验这几种菌有无拮抗性。
TSB培养基配方：胰蛋白胨17克，植物蛋白胨3克，氯化钠2.5克，磷酸氢二钾2.5克，葡萄糖2.5克，1000mL蒸馏水。
实验结果显示，这几株菌之间均没有拮抗性。
四、本发明菌株的协同性及作用效果实验
将本发明的四株细菌在TSB培养基上活化，取单菌落接种于TSB液体培养基中，培养24h后，将每种菌的菌液接种于液体的鱼饲料培养基中，总共接种量为0.5～2.0％，每隔24小时取样品一次，5000r/min离心，重铬酸钾法测定上清液的COD，连续测定7天。如图3所示，在第7天的时候，SL3、WZ3与WXW1的COD去除率最高，约为60％，如表6所示，菌株KB2和SL3、WZ3与WXW1的混合菌液的COD去除率最高。每增加一种菌株，混合菌液的COD去除率依次增加，证明本发明的四株菌株之间存在协同作用。
结果分析
1、通过检验，本发明几株菌之间均没有拮抗性；
2、菌株KB2的COD去除率最高，以菌株KB2为基础，与其他几株菌株组合，检验混合菌的COD去除率变化，得如表6所示。以实验组KB2、SL3、WZ3与WXW1的混合菌对培养液的去除率最高，最高达87.9％，因此微生态制剂以这四种菌制作而成。
综上所述，通过上述四个实验得出如下结论：
1、由表6可知该微生态制剂用于水产养殖具有显著效益，可有效降低养殖水质中亚硝酸盐、氨氮、硫化氢等浓度，抑制水体中有害微生物繁殖和生长，净化水质，提高水产品商品性能。
2、由表1-6可知该微生物制剂具有投资小、效益高、使用方便等优点，且无毒、无害、无药物残留、不产生耐药性，长期使用可以减少养殖过程中抗生素的使用量，减少病害发生，排放的污水对环境污染也较小。
3、本发明微生物制剂可迅速降解水体中的残存饲料、鱼类的粪便及其它有机物，特别是清除池塘长时间的养殖水体底部，如海边老虾池底部积累的残余饲料、***废物、动植物残体；同时，还能吸收利用水体中的氨、亚硝酸盐、硫化氢等有害物质，能有效避免固体有机物和有害物质的积累。这些藻类为主的浮游植物所产生的光合作用，又为池塘底栖动物，水产动物的呼吸，有机物的分解提供氧气，从而形成池塘良性的生态循环，促使有益微生物的大量繁殖，在池塘内形成优势种群，可抑制病原微生物的繁殖，减少疾病发生。
附表
表1是本发明菌株的生长条件表；
表2是本发明的菌株芽孢杆菌属Bacillus CGMCC No：3737对鱼类的安全性试验表；
表3是本发明的菌株假单胞菌属Pseudomonas CGMCC No：3739对鱼类的安全性试验表；
表4是本发明的菌株短小芽孢杆菌Bacillus pumilus CGMCC No：3752对鱼类的安全性试验表；
表5是本发明的菌株不动杆菌属Acinetobacter CGMCC No：3712对鱼类的安全性试验；
表6是本发明菌株的协同性及作用效果实验表。
表1
表2
表3
表4
表5
表6
Claims (1)
1. 一种过度养殖区水体微生物修复剂，其特征是其由下列细菌组成：芽孢杆菌属Bacillus、假单胞菌属Pseudomonas、短小芽孢杆菌Bacilluspumilus和不动杆菌属Acinetobacter；保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号分别为CGMCC No：3737、3739、3752、3712；所述芽孢杆菌属Bacillus CGMCC No：3737、假单胞菌属Pseudomonas CGMCC No：3739、短小芽孢杆菌Bacillus pumilus CGMCC No：3752和不动杆菌属Acinetobacter CGMCC No：3712的质量比为1.5：1.2:1.0:1.3。
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