CN110172422B - 一株溶蛋白芽孢杆菌及其在防治根结线虫中的应用 - Google Patents

一株溶蛋白芽孢杆菌及其在防治根结线虫中的应用 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一株溶蛋白芽孢杆菌及其在防治根结线虫中的应用。该菌株为溶蛋白芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)Bp‑196，已于2018年9月21日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC NO.16525。该菌株为从发生根结线虫病的黄瓜根际土壤中分离到的细菌，对于根结线虫具有良好的防治效果，利于早期防控根结线虫的危害，有助于实现蔬菜的安全、无公害生产。

Description

一株溶蛋白芽孢杆菌及其在防治根结线虫中的应用
技术领域
本公开涉及微生物应用领域，具体是涉及一株溶蛋白芽孢杆菌及其在防治根结线虫中的应用。
背景技术
植物寄生线虫存在世界上许多国家和地区，种类多种多样。其中，根结线虫是最重要的植物寄生线虫之一，随着我国设施蔬菜种植面积的迅速增加和蔬菜复种指数的不断提高，根结线虫的发生面积逐渐扩大，可使蔬菜减产20％～30％，甚至60％～70％，严重制约了设施蔬菜产业的发展。根结线虫(M.incognita)的寄主超过3000多种植物，几乎能够侵染所有栽培植物的根部。
目前生产上主要采用化学杀线虫剂防治根结线虫，但是化学杀线虫剂普遍存在毒性较大、污染环境、易产生抗药性等诸多问题，因此在实践中人们逐步减少化学药剂的使用量。由于生防菌株具有不污染环境、不产生抗药性、对人畜安全的特点，因此筛选出高效的防治根结线虫的生防菌株成为目前国内外研究的热点。
发明内容
为了克服现有技术中存在的问题，本公开提供一株溶蛋白芽孢杆菌Bp-196，该菌株为从发生根结线虫病的黄瓜根际土壤中分离到的细菌，对于根结线虫具有良好的防治效果，利于早期防控根结线虫的危害，有助于实现蔬菜的安全、无公害生产。
本公开提供的菌株为溶蛋白芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)Bp-196，是由河北省廊坊市种植黄瓜田块中发生根结线虫病的黄瓜根际土壤中分离、纯化得到的，已于2018年9月21日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCC NO.16525。其具有以下生物学特性：在LB培养基平板上，在30℃下培养3天后，该菌株的菌落大，表面粗糙，扁平，不规则，内圈颜色较暗，所有菌株均为革兰氏阳性。在扫描电镜下观察发现，所有细菌的细胞均呈棒状并有丰富的鞭毛，在肿胀孢子囊中均形成椭圆形孢子。
在一例中，本公开提供的溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株为革兰氏阳性菌株。
在一例中，本公开提供的溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株的发酵方法，其中，该方法包括：将溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株接种到发酵培养基中，在30℃下，以220rpm的转速培养3天。
在一例中，发酵培养基包括：5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，利用蒸馏水定容至1L。
在一例中，本公开提供的溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株应用于制造防治根结线虫病的用药中。
本公开提供的溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株，为从发生根结线虫病的黄瓜根际土壤中分离到的细菌。一方面，该菌株对作物安全无害，有助于实现蔬菜的安全、无公害生产；另一方面，该菌株对于根结线虫具有良好的防治效果。通过实验表明，该菌株发酵液对根结线虫二龄幼虫的致死率达到100％，在防治试验中，对根结线虫的防治效果达到86.5％，防治效果高效且稳定。
附图说明
图1为本公开一些实施例中溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株的菌落图；
图2为图1所示的溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株的细菌形态图。
具体实施方式
下面将参考若干示例性实施方式来描述本公开的原理和精神。应当理解，给出这些实施方式仅仅是为了使本领域技术人员能够更好地理解进而实现本公开，而并非以任何方式限制本公开的范围。
实施例1：溶蛋白芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)Bp-196菌株的分离、纯化与鉴定
1.溶蛋白芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)Bp-196菌株的分离与纯化
本公开的溶蛋白芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)Bp-196菌株是由河北省廊坊市种植黄瓜田块发生根结线虫病的黄瓜根际土壤中采用土壤稀释方法分离得到的，其分离方法为：
从河北省廊坊市黄瓜种植田块中的黄瓜根际均匀采集土壤样品，共计六份，每份各取10g，并将采集的6份土壤均匀混合。将混合后的60g土壤样品加入1000mL蒸馏水中搅拌均匀，静置1min后，取其上层清液，并将该上层清液置于80℃的水浴锅中水浴加热30min，水浴过程中可以对上层清液进行充分搅拌，以使其受热均匀。水浴加热结束后，待上层清液冷却至室温，将其摇匀，并取1mL清液，利用灭菌水将该清液稀释100倍。然后取稀释后的清液0.25ml涂布在LB平板上，涂抹均匀，置于30℃恒温培养箱中培养2～4d，定时观察菌落的生长情况。
需要说明的是，LB平板的制作方法是：取5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠和0.13-0.15g/L琼脂粉置于培养皿中，利用蒸馏水定容至1L，获得LB平板基液；然后将LB平板基液在121℃下高温高压灭菌20分钟，并在培养皿中铺制成平板，从而获得LB平板。
待组织块长出菌落后，进行单孢分离，挑取单菌落在LB培养基上纯化。
2.溶蛋白芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)Bp-196菌株的鉴定
(1)微生物学特性：
如图1-2所示，获得的菌株在LB培养基平板上，在30℃下培养3天后，该菌株的菌落大，表面粗糙，扁平，不规则，内圈颜色较暗，所有菌株均为革兰氏阳性。在扫描电镜下观察发现，所有细菌的细胞均呈棒状并有丰富的鞭毛，在肿胀孢子囊中均形成椭圆形孢子。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对该菌株进行形态学鉴定，确定该菌株为溶蛋白芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)。
(2)分子生物学特性：
用灭菌的牙签挑取单菌落，放入盛有300μL菌细裂解液SDS的EP管中，65℃裂解2小时，然后用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA，以DNA为模板，用引物27F和1492R进行16s rRNA序列扩增。PCR扩增反应体系为50μL，含有25μL ExTaq酶，1μL正向引物，1μL反向引物，3μL DNA模板，无菌水20μL。扩增的条件是：94℃预变性5min，94℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸2.5min，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，PCR产物直接进行双向测序。需要说明的是，上述的细菌基因组DNA提取试剂盒选自天根生物科技有限公司。
用引物1492R、27F进行16S rRNA序列扩增，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳。经测序分析，该菌株扩增的16s rRNA序列长为1509bp。将该菌株的16S rRNA序列进行BLAST分析后，结果显示，该菌株与溶蛋白芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)相似度达到了100％。鉴定该菌株为溶蛋白芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)。该菌株的16s rDNA基因序列测定结果如下(SEQ No.1):AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGT。
此菌株已于2018年9月21日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCCNO.16525。
实施例2：溶蛋白芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)Bp-196菌株的杀线虫效果
1.溶蛋白芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)Bp-196菌株的发酵液制备
将溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株接种到发酵培养基中，在30℃下，以220rpm的转速培养3天，以获得溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株的发酵液。其中，发酵培养基包括：5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，利用蒸馏水定容至1L。
2.制备试验用线虫
根结线虫采自中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室。将根结线虫发病的辣椒的根系取出，用水轻轻冲洗，从根系表面小心取下卵块，放在1％的次氯酸钠中消毒3min，再用无菌水冲洗3次，放在含有少量无菌水的培养皿中，在25℃恒温箱中培养，24h-48h收集孵化的根结线虫二龄幼虫，用无菌水悬浮用于试验研究。
3.试验方法
取溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株的发酵液及其10倍、100倍稀释液分别处理上述根结线虫二龄幼虫，测定溶蛋白芽孢杆菌Bp-196发酵液对根结线虫的杀死效果。
取12个无菌的24孔细胞培养板，将12个细胞培养板分为四组，每组试验重复3次，并在每组细胞培养板中分别向孔内加入发酵液、稀释10倍发酵液、稀释100倍发酵液和无菌水各1mL，其中，将加入发酵液组、加入稀释10倍发酵液组和加入稀释100倍发酵液组作为试验组，将加入无菌水组作为对照组，然后分别向四组细胞培养板中加入100μL线虫悬浮液(约100条线虫)，放在室温下培养24h，观察根结线虫的死亡情况，并计算校正死亡率，即为杀线虫效果。
校正死亡率(％)＝(试验组根结线虫平均死亡率-对照组根结线虫平均死亡率)/(1-对照组根结线虫平均死亡率)*100％
表1为不同浓度的溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株的发酵液杀根结线虫二龄幼虫的试验结果。
表1不同浓度的溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株的发酵液杀根结线虫二龄幼虫的试验结果
死亡率(％) 发酵液组 稀释10倍发酵液组 稀释100倍发酵液组 无菌水组
重复试验1 100 94.5 10.2 1.2
重复试验2 100 90.7 9.8 1.1
重复试验3 100 92.2 9.6 1.1
平均死亡率 100 92.5 9.9 1.1
校正死亡率 100 92.5 9.9 —
通过上述试验可以看出，不同稀释倍数的溶蛋白芽孢杆菌Bp-196发酵液对线虫的作用效果不同。当未对发酵液进行稀释时，其对根结线虫的杀虫效果为100％；当对发酵液稀释10倍时，其对根结线虫的杀虫效果仍然达到92.5％；而当对发酵液稀释100倍时，其对根结线虫的杀虫效果很低，仅为9.9％，与对照组的差异很小，说明溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株的发酵液在高浓度下具有良好的防治根结线虫效果。
实施例3：溶蛋白芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)Bp-196菌株的杀线虫效果
1.溶蛋白芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)Bp-196菌株的发酵液制备
将溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株接种到发酵培养基中，在30℃下，以220rpm的转速培养3天，以获得溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株的发酵液。其中，发酵培养基包括：5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，利用蒸馏水定容至1L。
2.制备试验用线虫
根结线虫采自中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室。将根结线虫发病的辣椒的根系取出，用水轻轻冲洗，从根系表面小心取下卵块，放在1％的次氯酸钠中消毒3min，再用无菌水冲洗3次，放在含有少量无菌水的培养皿中，在25℃恒温箱中培养，24h-48h收集孵化的根结线虫二龄幼虫，用无菌水悬浮用于试验研究。
3.试验方法
取180株黄瓜幼苗进行试验，将180株黄瓜幼苗分为两组，每组试验重复3次，并在每组黄瓜幼苗土壤中分别均匀浇灌溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株的发酵液和无菌水各15mL，其中，将浇灌溶蛋白芽孢杆菌Bp-196发酵液的黄瓜幼苗组作为试验组，将浇灌无菌水的黄瓜幼苗组作为对照组。1天后，向试验组和对照组的黄瓜幼苗接种根结线虫二龄幼虫，每株接种500条，在室温下正常培养，并在5周后检测试验组和对照组的黄瓜幼苗上的根结数量，以此计算溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株的发酵液对根结线虫的预防效果。
防治效果计算公式：
防治效果(％)＝(1-试验组平均根结数量/对照组平均根结数量)*100％
表2为溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株的发酵液预防根结线虫的试验结果。
表2溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株的发酵液预防根结线虫的试验结果
根结数 发酵液组 无菌水组
重复试验1 18.9 135.7
重复试验2 17.1 124.5
重复试验3 16.2 127.1
平均根结数 17.4 129.1
根据防治效果计算公式可以计算得出，溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株的发酵液对根结线虫的防治效果达到了86.5％。
通过上述试验可以看出，经溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株的发酵液处理后黄瓜植株上的根结数量显著降低。在对照组中，黄瓜的根结数量平均为129.1个/株，而在经溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株的发酵液处理的黄瓜中的根结数量平均为17.4个/株。通过计算可以得到，溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株的发酵液对根结线虫的防治效果达到了86.5％，说明溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株可以有效的防治黄瓜根结线虫。在农业生产防治根结线虫病中具有重要价值。
出于示例和描述的目的，已经给出了本公开实施的前述说明。前述说明并非是穷举性的也并非要将本公开限制到所公开的确切形式，根据上述教导还可能存在各种变形和修改，或者是可能从本公开的实践中得到各种变形和修改。选择和描述这些实施例是为了说明本公开的原理及其实际应用，以使得本领域的技术人员能够以适合于构思的特定用途来以各种实施方式和各种修改而利用本公开。
序列表
<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 一株溶蛋白芽孢杆菌及其在防治根结线虫中的应用
<130> ZLP1900183CN
<141> 2019-05-28
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1509
<212> DNA
<213> 溶蛋白芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag gatgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60
gaatggatta agagcttgct cttatgaagt tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt 120
aacctgccca taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg ataacatttt 180
gaactgcatg gttcgaaatt gaaaggcggc ttcggctgtc acttatggat ggacccgcgt 240
cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcaa cgatgcgtag ccgacctgag 300
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gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggct 420
ttcgggtcgt aaaactctgt tgttagggaa gaacaagtgc tagttgaata agctggcacc 480
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aggtggcaag cgttatccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggtgg tttcttaagt 600
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cagaagagga aagtggaatt ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagagata tggaggaaca 720
ccagtggcga aggcgacttt ctggtctgta actgacactg aggcgcgaaa gcgtggggag 780
caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta agtgttagag 840
ggtttccgcc ctttagtgct gaagttaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacggcc 900
gcaaggctga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 960
aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgaaaa ccctagagat 1020
agggcttctc cttcgggagc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1080
tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg ccatcattaa 1140
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tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacggta caaagagctg 1260
caagaccgcg aggtggagct aatctcataa aaccgttctc agttcggatt gtaggctgca 1320
actcgcctac atgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac 1380
gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg 1440
gtggggtaac ctttttggag ccagccgcct aaggtgggac agatgattgg ggtgaagtcg 1500
taacaaggt 1509

Claims (4)

1.一种溶蛋白芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)Bp-196菌株，所述菌株的保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16525。
2.权利要求1所述的溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株的发酵方法，其中，所述方法包括：
将所述溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株接种到发酵培养基中，在30℃下，以220rpm的转速培养3天。
3.根据权利要求2所述的溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株的发酵方法，其中，所述发酵培养基包括：5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，利用蒸馏水定容至1L。
4.一种权利要求1至3中任一项所述的溶蛋白芽孢杆菌Bp-196菌株在制造防治根结线虫病的用药中的用途。
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