CN113373229B - 胃癌相关生物标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了胃癌相关生物标志物及其应用，所述的生物标志物为LINC01895。在本发明的具体实施例中，LINC01895在Notch1基因沉默的胃癌细胞中表达上调，进一步采用qPCR检测LINC01895在胃癌组织中的表达情况，结果显示，LINC01895在胃癌组织中表达下调，且具有较好的诊断效能，该实验结果提示LINC01895可用于诊断胃癌或预测胃癌患者使用Notch1抑制剂预后。本发明还提供了一种筛选预防或治疗胃癌的候选药物的方法。

Description

胃癌相关生物标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及胃癌相关生物标志物及其应用。
背景技术
胃癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，在世界最常见恶性肿瘤中发病率占第四位,仅次于肺癌、***癌及结肠癌(Patru C L,Surlin V,Georgescu I,etal.Current issues in gastric cancer epidemiology.[J].rev med chir soc med natiasi,2013,117(1):199-204.)。据统计年胃癌的预期发病率为64万人。在女性中，胃癌的发病率占第五位，仅次于乳腺癌、结肠癌、***与肺癌，年预期发病率高达35万人。胃癌死亡率占全球恶性肿瘤年死亡率的8～10％，而胃癌的病死率高达70％，显著高于其他恶性肿瘤如***癌(30％)与乳腺癌(33％)。
目前，胃癌的诊断依赖于内镜、病理检查和肿瘤标志物的测定[包括癌胚抗原(CEA)、糖链抗原19-9(CA19-9)、癌抗原72-4(CA72-4)和癌抗原50(CA50)等]。然而，内窥镜和病理检查虽然是确诊胃癌的“金标准”，但因其费用较高、取材困难和患者痛苦大，并不能用于早期癌症的筛查。肿瘤标记物也因缺乏高特异度和灵敏度，效用有限。因此，为优化治疗策略、预测疗效并延长患者生存期，必须尽快确定新型诊断标志物。循环长非编码RNA(lncRNA)由于可直接从患者血浆和血清中检测，具有检测方便快捷、无创伤性、高灵敏度和特异度等优点被视为胃癌潜在的肿瘤标志物。
Notch是一种重要的信号受体分子，它在脊椎与无脊椎动物中决定物种发育的时间与空间，并决定多种细胞的最终分化。Notch是一种单次跨膜蛋白，胞外段有两个明确的结构域：表皮生长因子样重复区，主要功能是结合配体；三个富含半胱氣酸Notch/lin-12重复区，主要功能是无配体存在的情况下阻断信号转导。Notch的胞质部分包括一个调节氨基酸代谢域、六个错蛋白重复序列结构域、两个核定位信号序列结构域、一个转录活化域和一个脯氦酸-谷氨酸-丝氨酸-苏氨酸富集序序列。Nocth家族共有四个成员,即Notch1～4，与相应的配体结合释放胞内段并转入核内与下游靶基因位点结合调控基因的转录。有研究显示，Notch家族参与多种肿瘤的发生发展，沉默Notch1的表达可以抑制胃癌细胞株的增殖与侵袭(Wei G,Chang Y,Zheng J,et al.Notch1 silencing inhibits proliferation andinvasion in SGC-7901gastric cancer cells[J].Molecular Medicine Reports,2014,9(4):1153-1158.)，因而，通过沉默Notch1的表达来寻找差异表达的lncRNA有望寻找到新的胃癌的生物标志物。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于诊断胃癌的生物标志物，为胃癌的诊断提供新的方法。为了实现该目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明第一方面提供了检测样本中LINC01895表达水平的试剂在制备诊断胃癌或预测胃癌患者使用Notch1抑制剂预后的产品中的应用。
所述的“LINC01895”是指Gene ID为105371964的基因。
进一步，所述的试剂包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测样本中LINC01895表达水平的试剂。
本发明的核酸测序方法的非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。
本发明中的核酸杂交方法包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。
将Southern和Northern印迹分别用于检测特异性DNA或RNA序列。使从样本中提取的DNA或RNA断裂，在基质凝胶上通过电泳分离，然后转移到膜滤器上。使滤器结合的DNA或RNA与和所关注的序列互补的标记探针杂交。检测结合到滤器的杂交探针。该程序的一种变化形式是反向Northern印迹，其中固定到膜的底物核酸为分离的DNA片段的集合，而探针是从组织提取并进行了标记的RNA。
本发明中的核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。
通常，PCR使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；RT-PCR则将逆转录酶(RT)用于从mRNA制备互补的DNA(cDNA)，然后将cDNA通过PCR扩增以产生DNA的多个拷贝；TMA在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝，TMA任选地包括使用阻断，部分、终止部分和其他修饰部分，以改善TMA过程的灵敏度和准确度；LCR使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复多个循环中通过DNA连接酶共价连接，以产生可检测的双链连接寡核苷酸产物；SDA使用以下步骤的多个循环：引物序列对与靶序列的相反链进行退火，在存在dNTPαS下进行引物延伸以产生双链半硫代磷酸化的(hemiphosphorothioated)引物延伸产物，半修饰的限制性内切酶识别位点进行的核酸内切酶介导的切刻，以及从切口3'端进行的聚合酶介导引的物延伸以置换现有链并产生供下一轮引物退火、切刻和链置换的链，从而引起产物的几何扩增。
术语“样本”与“样品”在本文中可以互换使用，用于本文时指获得自或衍生自受试者(例如感兴趣的个体)的组合物，其包含有待根据例如物理，生化，化学和/或生理特点来表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。例如，短语“疾病样本”或其变体指得自感兴趣的受试者的任何样本，预计或已知其包含待表征的细胞和/或分子实体。样本包括但不限于，组织样本(例如肿瘤组织样本)，原代或培养的细胞或细胞系，细胞上清，细胞裂解物，血小板，血清，血浆，玻璃体液，淋巴液，滑液，滤泡液，***，羊水，乳，全血，血液衍生的细胞，尿液，脑脊髓液，唾液，痰，泪，汗液，粘液，肿瘤裂解物，和组织培养液，组织提取物如匀浆化的组织，肿瘤组织，细胞提取物，及其组合。
作为优选的实施方式，所述样本选自组织。
进一步，所述的试剂选自：
特异性识别LINC01895的探针；
或特异性扩增LINC01895的引物。
“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
进一步，所述的特异性扩增LINC01895的引物序列如SEQ ID NO.5～6所示。
本发明第二方面提供了一种诊断胃癌或预测胃癌患者使用Notch1抑制剂预后的产品，所述的产品包括检测样本中LINC01895表达水平的试剂。
进一步，所述的产品包括芯片、试剂盒、核酸膜条。
在本发明中，核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。
在本发明中，“芯片”也称为“阵列”，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。
“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。
本发明提供的用于诊断受试者中的胃癌的试剂盒，该试剂盒用于确定生物标志物的水平。试剂盒可以包括适于选择性检测来源于受试者的样品中用于诊断胃癌的生物标志物或生物标志物组的存在的材料和试剂。例如，在一个实施方案中，该试剂盒可以包括与生物标志物特异性杂交的试剂。这类试剂可以是适于检测生物标志物的形式的核酸分子，例如，探针或引物。该试剂盒可以包括用于进行测定以检测一种或多种生物标志物的试剂，例如，可以用于在qPCR反应中检测一种或多种生物标志物的试剂。该试剂盒同样可以包括用于检测一种或多种生物标志物的微阵列。
在进一步的实施方案中，试剂盒可以含有标记或产品插页形式的合适操作参数的说明书。例如，说明书可以包括关于如何收集样品，如何确定样品中一种或多种生物标志物的水平，或如何将样品中一种或多种生物标志物的水平与受试者的胃癌状态相关联的信息或指导。
进一步，试剂盒可以含有一个或多个容器，其具有生物标志物样品，以用作参比标准，合适的对照，或用于测定的校准以检测测试样品中的生物标志物。
进一步，所述的产品还包括处理样本的试剂。
本发明第三方面提供了一种组合物，所述的组合物包括LINC01895的促进剂。
进一步，所述的促进剂为特异性促进LINC01895表达的载体。
本发明第四方面提供了本发明第三方面所述的组合物在制备预防或治疗胃癌的药物组合物中的应用。
本发明的药物组合物可另外包含药学上可接受的载体。术语载体包括适用于制备所需特定剂型的任何和所有溶剂、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。可用作药学上可接受的载体的材料的一些示例包括，但不限于，糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏液；乙醇和磷酸盐缓冲液，以及根据配制人员的判断，组合物中还可以存在其他无毒相容的润滑剂诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。
本发明第五方面提供了一种筛选预防或治疗胃癌的候选药物的方法，所述的方法包括如下步骤：
(1)用待测试物质处理表达或含有LINC01895的体系；
(2)检测所述体系中LINC01895的表达水平；
(3)选择可提高LINC01895表达水平的物质为候选药物。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了通过检测LINC01895表达水平可以诊断胃癌或预测胃癌患者使用Notch1抑制剂预后。
本发明还公开了一种筛选预防或治疗胃癌的候选药物的方法。
附图说明
图1是转染Notch1敲除慢病毒后胃癌细胞中的Notch1蛋白表达水平图；其中，图A是MKN45细胞的Notch1蛋白表达水平图；图B是MGC-803细胞的Notch1蛋白表达水平图；图C是AGS细胞的Notch1蛋白表达水平图；
图2是qPCR检测胃癌组织中LINC01895相对表达量统计图；
图3是LINC01895诊断胃癌的ROC曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1干扰胃癌细胞中的Notch1基因表达
一、实验材料
1、实验试剂：如表1所示，抗体信息如表3所示；
2、实验仪器：如表2所示；
3、Notch1敲除慢病毒、阴性对照慢病毒；
4、胃癌细胞系MKN45、MGC-803、AGS。
表1实验试剂
Figure BDA0003122785910000071
Figure BDA0003122785910000081
表2.实验仪器
Figure BDA0003122785910000082
Figure BDA0003122785910000091
Figure BDA0003122785910000101
表3抗体信息
Figure BDA0003122785910000102
二、实验方法
1、病毒感染
(1)铺板：对数生长期的细胞消化铺板后，按照1*105/孔接种于12孔板，生长过夜；
(2)感染：将12孔板中的培养液吸除，换新鲜的培养液，同时加入PBS浓度梯度稀释的病毒液，混合均匀后放入培养箱培养；
(3)24h左右可换液，48h左右可看荧光。
2、Western Blot验证
(1)细胞总蛋白提取
a.用PBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。
b.加入适当体积的RIPA(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)于培养板、瓶内3-5min。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c.用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5mL离心管中。
d.冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
e.12000rpm,4℃，离心10min，收集上清，即为总蛋白溶液。
(2)蛋白浓度测定
取未变性的蛋白溶液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度。
(3)蛋白变性
将蛋白溶液按照4:1的比例加入5*蛋白上样缓冲液，沸水浴变性15min，收入-20℃冰箱保存备用。
(4)SDS-PAGE电泳
a.配置蛋白质凝胶
b.将制胶器放入电泳槽后加足够的电泳液后上样电泳。将样品加入电泳孔中，电泳。浓缩胶电压75V，分离胶用120V。
c.电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
(5)转膜
a.准备6张7×9cm的滤纸和一张大小适中的PVDF膜，PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化。
b.在加有转移液的盆里放入转膜用的夹子，两块海绵垫，一支玻棒，滤纸和经过活化的PVDF膜。
c.将夹子打开使黑的一面保持水平。在垫子上垫海绵、三层滤纸。
d.小心剥下分离胶放在滤纸上，将PVDF膜盖于胶上，不要有气泡。在膜上盖三张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫。
e.转膜条件(湿转)
快转：300mA恒流转膜半小时，或者200mA转膜1小时，时间可以略微调整，电流对应调整。转膜过程中将转膜的槽子放在冰水中降温。
慢转：转膜过夜，25V恒压转膜过夜。
(6)免疫反应
a.将转好的膜于室温下脱色摇床上用5％的脱脂牛奶(0.5％TBST配)，封闭1h。
b.稀释一抗(TBST溶解的5％脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5％BSA)，4℃孵育过夜(快转)，或者4℃孵育抗体3小时(慢转)。
c.用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。
d.将二抗用TBST稀释3000倍，室温下孵育30min后，用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。
(7)化学发光
在暗室中将ECLA和ECLB两种试剂在离心管中等体积混合，在曝光匣上贴双层手套或者其他透明薄膜，将PVDF膜的蛋白面朝上放在曝光匣两层薄膜之间，加入混合好的ECL溶液充分反应，1-2min后，去尽残液，盖上上面的一层薄膜开始曝光。曝光后的胶片用显影、定影试剂进行显影和定影。根据不同的发光强度调整曝光条件。
(8)凝胶图像分析
将胶片进行扫描存档，PhotoShop整理去色，Alpha软件处理***分析目标带的光密度值。
三、实验结果
如图1所示，转染Notch1敲除慢病毒进行干扰后，胃癌细胞(MKN45、MGC-803、AGS)中Notch1蛋白表达量显著下调，该结果证明成功获得敲低Notch1基因的胃癌细胞系。
实施例2筛选差异表达基因
一、高通量测序数据处理
Trizol法收集实施例1中的空白对照和Notch1基因敲低组胃癌细胞，各3个重复，进行高通量测序，并对原始测序数据进行过滤：
1.去除reads中的adapter序列；
2.剪切前去除5’端含有非AGCT的碱基；
3.修剪测序质量较低的reads末端(测序质量值小于Q20)；
4.去除含N的比例达到10％的reads；
5.舍弃去adapter及质量修剪后长度小于25bp的小片段。
对质量剪切后的序列进行数据量统计，结果如表4所示。
表4测序数据统计表
Figure BDA0003122785910000131
二、参考序列比对分析
将质控后得到的高质量测序序列与指定的参考基因组比对，研究物种为人，参考基因组来自于Ensembl数据库，基因组版本GRCh38.p13。
分析软件：hisat2，版本为v 2.1.0，与参考基因组比对结果统计表如表5所示。
表5 Clean Mapping比率统计
Figure BDA0003122785910000132
三、mRNA表达量分析
在RNA-seq分析中，通过比对到参考基因组区域的序列(clean reads)的数量来计算基因的表达水平。根据所有样本与参考基因组的比对结果，计算每个基因/转录本在样本中的count值，以该值作为基因/转录本在样本中的表达量。最后对所有基因/转录本在各组样本中的表达进行差异显著性分析，找出相对差异表达的基因/转录本，并对其进行可视化分析。
采用软件DESeq2从RNA-Seq数据中识别差异基因，其基于二项分布模型集成了Fisher检验和似然比检验进行差异表达检验，显著差异mRNA筛选条件：P_value<0.05，|logFC|>0.585。
四、数据分析结果
用上述标准筛选得到差异基因145个，其中表达上调基因102个，表达下调的基因有43个。本发明中所述的基因LINC01895在Notch1基因敲低组胃癌细胞中表达上调，如表6所示，该结果表明，Notch1抑制剂可能通过促进LINC01895表达来抑制胃癌细胞株的增殖与侵袭。
表6 LINC01895的差异表达情况
基因 baseMean log2 FoldChange P.Value updown
LINC01895 11.689 2.412 0.022 Up
实施例3 qPCR检测胃癌组织样本中LINC01895表达量的变化
一、实验材料
1、样本：46份胃组织样本，其中23份胃癌组织样本，23份癌旁对照组织。
2、实验试剂：如表7所示。
表7使用试剂清单
Figure BDA0003122785910000142
3、实验主要仪器：如表8所示。
表8使用仪器清单
Figure BDA0003122785910000141
二、实验方法
1.引物设计
Real Time PCR检测目的基因引物。引物在博迈德公司合成，引物序列如表9所示。
表9引物序列
引物名称 引物序列(5'to3')
GAPDH-F(内参) CTGGGCTACACTGAGCACC(SEQ ID NO.1)
GAPDH-R(内参) AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG(SEQ ID NO.2)
ACTB-F(内参) GATCAAGATCATTGCTCCTCCT(SEQ ID NO.3)
ACTB-R(内参) TACTCCTGCTTGCTGATCCA(SEQ ID NO.4)
LINC01895-F TAAACAAGCAGCCCCTGTCT(SEQ ID NO.5)
LINC01895-R CGCAGGTAATAGGTGGCAGT(SEQ ID NO.6)
2、提取样本总RNA
(1)将1mL TRIzol在超净台里加入至玻璃匀浆瓶中(提前将匀浆瓶用烘箱180度烘4个小时)，将匀浆瓶按到仪器上，称取50—100mg的组织放入玻璃匀浆瓶内，将转速调至1500转左右，开始在冰水浴中进行匀浆，每研磨30s，停止30s，反复3-4次即可。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
(2)将加入TRIzol的样品在室温(15-30℃)放置10min，使核酸蛋白复合物完全分离。
(3)1mL TRIzol加入200μL氯仿，剧烈振荡2min，每隔1分钟再晃动两下，5—6次后，再静止7min。
(4)4℃，12000rpm，离心15min。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol的60℅。
(5)把上层水相转移到新的EP管中(约400μL，尽量不要吸取到中间层以免污染)。加入500μL异丙醇，室温放置10min。
(6)制备75％乙醇，置于冰盒中预冷。
(7)4℃，12000rpm，离心15min，离心后在管底出现白色沉淀。用移液器小心移去上清。
(8)加入1mL 75℅冷乙醇，震荡洗涤沉淀。4℃，7500rpm，离心5min，小心弃掉上清。
(9)将EP管倒扣于滤纸上吸去多余的水分，并用10μL枪头小心吸取管内的液体(枪头不要接触RNA)，将EP管室温放置5min(时间太久，过于干燥会使RNA活性降低)，RNA变透明；
(10)加入40μL无RNase的水(DEPC水),用naodrop检测OD值与浓度，在管上做好标记；
(11)置于-80℃冰箱保存。
3、逆转录合成mRNA cDNA
采用FastKing cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR116)进行mRNA反转录，首先去除基因组DNA反应，在试管中加入5×gDNA Buffer 2.0μL，TotalRNA 1μg，加Rnase FreeddH2O使总体积至10μL，水浴锅中42℃加热3min，再将10×King RT Buffer 2.0μL，FastKing RT Enzyme Mix 1.0μL，FQ-RT Primer Mix 2.0μL，RNase Free ddH2O 5.0μL，混合后加入上述试管中一起混合共20μL，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min，合成的cDNA需要长期保存时，请于-20℃或更低温度保存。
4、Real-TimePCR
用ABI 7300型荧光定量PCR仪，采用
Figure BDA0003122785910000161
法进行数据的相对定量分析：(1)用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。Real-Time反应体系如表10所示：
表10 Real-Time PCR反应体系
试剂 使用量
2×SuperReal PreMix Plus 10μL
上游引物(10μM) 0.6μL
下游引物(10μM) 0.6μL
50×ROX Reference Dye<sup>△</sup> 2μL
DNA模板 2μL
灭菌蒸馏水 4.8μL
(2)扩增程序为：95℃ 15min，(95℃ 10sec，55℃ 30sec，72℃ 32sec)×40个循环，95℃ 15sec，60℃ 60sec，95℃ 15sec)。
(3)引物筛选
将各样本cDNA混合后，以此为模板进行10倍梯度稀释，稀释后样品各取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增(见表11)，同时在60-95℃进行溶解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。
表11引物筛选标准曲线Real-TimePCR设计
Figure BDA0003122785910000171
(4)样品Real-TimePCR检测
将各样品cDNA20倍稀释后取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增(见表12)。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。
表12样品Real-TimePCR检测设计
模板 样品cDNA 样品cDNA
重复检测孔道数 3 3
引物 目的基因引物 内参基因引物
5、数据统计
将运行程序下机所导出的原始结果ct值按照上样顺序进行整理，得到各个样本每个基因的三个复孔原始ct值，在excel中分别求出目的基因与内参基因的三个复孔ct值的平均值，分别计算对照组(癌旁组织)和试验组(胃癌组织)中目的基因相对于内参基因的表达，采用GraphPad软件进行统计分析，两者之间的差异采用t检验。
二、实验结果
统计结果如图2所示，与癌旁组织相比，胃癌组织样本中LINC01895表达量下调。
实施例4 LINC01895的诊断效能验证
采用SPSS软件绘制受试者工作曲线(ROC)，分析AUC值、敏感性和特异性，判断指标单独的诊断效能。
如表13、图3所示，LINC01895具有较高的诊断效能，提示LINC01895可用于诊断胃癌。
表13 LINC01895诊断效能数据
基因 AUC 敏感性 特异性
LINC01895 0.767 0.783 0.696
以上结合附图详细描述了本申请的优选实施方式，但是，本申请并不限于上述实施方式中的具体细节，在本申请的技术构思范围内，可以对本申请的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本申请的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本申请对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本申请的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本申请的思想，其同样应当视为本申请所公开的内容。
序列表
<110> 福建医科大学附属第一医院
<120> 胃癌相关生物标志物及其应用
<141> 2021-06-18
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgggctaca ctgagcacc 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagtggtcgt tgagggcaat g 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatcaagatc attgctcctc ct 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tactcctgct tgctgatcca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taaacaagca gcccctgtct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgcaggtaat aggtggcagt 20

Claims (6)

1.检测样本中LINC01895表达水平的试剂在制备诊断胃癌或预测胃癌患者使用Notch1抑制剂预后的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测样本中LINC01895表达水平的试剂。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的试剂包括特异性扩增LINC01895的引物，所述的特异性扩增LINC01895的引物序列如SEQ ID NO.5～6所示。
4.一种诊断胃癌或预测胃癌患者使用Notch1抑制剂预后的产品，其特征在于，所述的产品包括检测样本中LINC01895表达水平的试剂。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述的产品包括芯片、试剂盒、核酸膜条。
6.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述的产品还包括处理样本的试剂。
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