CN113862333A

CN113862333A - 一种组合物及其氧化5-甲基胞嘧啶的方法

Info

Publication number: CN113862333A
Application number: CN202111145775.4A
Authority: CN
Inventors: 沈璐; 刘佳慧; 赵美茹; 钟文星; 易鑫; 伍佳豪
Original assignee: Shenzhen Guiinga Medical Laboratory
Current assignee: Shenzhen Guiinga Medical Laboratory
Priority date: 2021-09-28
Filing date: 2021-09-28
Publication date: 2021-12-31
Anticipated expiration: 2041-09-28
Also published as: CN113862333B

Abstract

本发明提供一种组合物及其氧化5‑甲基胞嘧啶的方法，所述组合物含有如下组分：缓冲剂、金属盐、α‑酮戊二酸盐、抗坏血酸、三磷酸腺苷、二硫苏糖醇，所述组合物的pH为4.3～7.5。本发明通过重新设计组合物的pH，使得5‑甲基胞嘧啶转化为T(胸腺嘧啶)的转化率提高，可用于氧化5‑甲基胞嘧啶，检测DNA样本中5‑甲基胞嘧啶残基的存在和位置。

Description

一种组合物及其氧化5-甲基胞嘧啶的方法

技术领域

本发明涉及测序文库构建技术领域，具体涉及一种组合物及其氧化5-甲基胞嘧啶的方法。

背景技术

早在1925年，DNA双螺旋结构鉴定之前，DNA甲基化修饰就已经被发现。DNA甲基化修饰，是DNA序列之外的遗传因素。由于受到机体-环境因素的双重调控，DNA甲基在基因调控、遗传印迹、衰老、炎症、肿瘤等生理病理过程中发挥着重要作用。

重亚硫酸盐可将胞嘧啶(C)脱氨基转化为尿嘧啶(U)，在随后的PCR过程中，采用U耐受的聚合酶，将U识别为胸腺嘧啶(T)，实现C到T的转化，从而达到将未修饰C和甲基化修饰C分开的目的。全基因组重亚硫酸盐(whole genome bisulfite sequencing，WGBS)，将未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶(约95％的C会被转化为T)，可覆盖全基因组70～99％的胞嘧啶，实现全基因组水平单碱基分辨率甲基化检测。全基因组重亚硫酸盐测序也是甲基化检测的一个“金标准”。但是重亚硫酸盐处理会使DNA大量降解，需要较高的DNA投入量，对于DNA含量较少的样本不友善，例如血浆游离DNA。另外重亚硫酸盐是将未甲基化的胞嘧啶转化成T，而未甲基化的胞嘧啶占基因组所有胞嘧啶的95％以上，因此，使用重亚硫酸盐处理后构建的二代测序文库，碱基平衡性差(A、T碱基总数占比>80％)，测序时需要添加 15％的噬菌体PhiX DNA平衡，造成测序数据大量浪费。最后WGBS产生的数据测序质量差，而且比对到基因组时需要使用特殊的软件(例如Bismark)，比对率较差，通常只有70％左右，进一步造成数据的浪费。

现有研究表明，在一定条件下，甲基化C可以被10-11转位酶转为羧基化C，通过吡啶硼烷可以将羧基化的C转化成二氢尿嘧啶，经过测序，可以识别为T，进而区分甲基化C与未甲基化C。鉴于此原理，通过自配试剂，开发全基因组甲基化非亚硫酸氢盐文库构建技术，该技术有效解决了文库复杂度低和测序数据深度低的缺陷，同时可实现在多种二代测序平台的甲基化检测。但是，甲基化C转化为T的转化率有待进一步提升。

发明内容

根据第一方面，一种实施例中提供一种组合物，所述组合物含有如下组分：缓冲剂、金属盐、α-酮戊二酸盐、抗坏血酸、三磷酸腺苷(ATP)、二硫苏糖醇(DTT)，所述组合物的pH为4.3～7.5。

根据第二方面，一种实施例中提供一种反应混合物，所述反应混合物含有第一方面所述组合物。

根据第三方面，一种实施例中提供一种试剂盒，所述试剂盒含有第一方面所述组合物。

根据第四方面，一种实施例中提供第一方面组合物，和/或第二方面所述试剂盒在氧化5- 甲基胞嘧啶中的应用。

根据第五方面，一种实施例中提供一种氧化5-甲基胞嘧啶的方法，包括使含有5-甲基胞嘧啶(5mC)的DNA样本与第一方面所述组合物和/或第二方面所述试剂盒的组分接触，使样本中5-甲基胞嘧啶残基氧化，得到含有氧化的5-甲基胞嘧啶残基的DNA。

根据第五方面，一种实施例中提供一种检测DNA样本中5-甲基胞嘧啶残基的存在和位置的方法，所述方法包括：

1)使用第五方面所述方法，使片段化的且连接有接头的DNA样本中5-甲基胞嘧啶残基氧化，得到含有氧化的5-甲基胞嘧啶残基的DNA；

2)使所述含有氧化的5-甲基胞嘧啶残基的DNA与有机硼烷接触，所述有机硼烷有效地使所述氧化的5-甲基胞嘧啶残基还原、脱氨基和脱羧基或脱醛基，从而得到含有二氢尿嘧啶 (DHU)残基代替所述氧化的5-甲基胞嘧啶残基的DNA；

3)对所述含有二氢尿嘧啶残基的DNA进行扩增和测序。

依据上述实施例的一种组合物及其氧化5-甲基胞嘧啶的方法，通过重新设计组合物的p H，使得5-甲基胞嘧啶转化为T(胸腺嘧啶)的转化率显著提高，可用于氧化5-甲基胞嘧啶，检测DNA样本中5-甲基胞嘧啶残基的存在和位置。

附图说明

图1为实施例1中氧化缓冲液不同pH条件下，TaqI-v2酶切鉴定140～160bp甲基化标准品中5mC转化为T的效率结果图。

图2为实施例1中氧化缓冲液不同pH条件下，Image J计算140～160bp甲基化标准品中 5mC转化为T的效率结果图。

图3为实施例1中NGS测序计算的转化率结果图。

图4为实施例1中的质控结果图。

图5为实施例2中的TaqI-v2酶切鉴定、Image J计算、NGS测序计算结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接，”如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。

如本文所用，“NGS”是指第二代测序，又称“下一代测序”，相比于传统的基于桑格尔(S anger)和毛细电泳法的方法具有增加的通量，例如能够一次产生数十万相对较小序列读段。二代测序技术的一些实例包括但不限于合成测序、连接测序以及杂交测序。在一实施例中，二代测序包括但不限于Illumina循环SBS法、华大DNA纳米球扩增技术等等，二代测序平台包括但不限于Geneseq 2000测序平台、MGISEQ-T7测序平台、Illumina测序平台等等。

现有技术中，通常使用TET酶及其氧化缓冲液将基因组胞嘧啶5位甲基化(5mC)修饰氧化成胞嘧啶5位羧基化(5caC)修饰，在有机硼烷(例如吡啶硼烷)和醋酸钠的进一步作用下，最终转化成二氢尿嘧啶(DHU)，而在PCR扩增和测序过程中，最终被识别成T。

根据第一方面，在一实施例中，提供一种组合物，所述组合物含有如下组分：缓冲剂、金属盐、α-酮戊二酸盐(英文名α-ketoglutarate，亦称α-KG)、抗坏血酸(英文名ascorbate)、三磷酸腺苷(ATP)、二硫苏糖醇(DTT)，所述组合物的pH为4.3～7.5。该组合物可作为TE T氧化胞嘧啶的缓冲体系，促进TET将核酸分子中的5-甲基胞嘧啶氧化，得到含有氧化的5- 甲基胞嘧啶的核酸分子，该组合物作为缓冲体系，采用不同于现有技术的pH，有效提高转化率。

现有技术中，对于需要进行NGS测序(亦称下一代测序、高通量测序)的样本，采用的氧化反应体系中使用的氧化缓冲液的pH为8.0，并且需要进行两次氧化，效率较低。经过实验探索，我们调节氧化缓冲液的pH，惊奇地发现，氧化缓冲液(buffer)pH从4.3到7.5的pH范围内，实验转化率均超过96％，并且，只需要一次氧化，有效提高氧化效率，简化操作流程。

在一实施例中，该组合物可作为十-十一易位酶氧化反应体系的缓冲液，使得5mC(5- 甲基胞嘧啶)通过十-十一易位酶催化氧化为5-羧甲基胞嘧啶(5caC)、5-醛基胞嘧啶(5fC)。该组合物可以存放于容器中，形成一种独立的产品进行售卖。TET氧化后，大部分的胞嘧啶修饰被氧化为5caC，小部分的胞嘧啶修饰被氧化为5fC。

十-十一易位(Ten-Eleven Translocation，TET)酶是生物体内存在的一种α-酮戊二酸(α-KG) 和Fe²⁺依赖的双加氧酶，TET酶家族有三个成员，分别为TET1、TET2和TET3，三种TET 酶均具有将5-mC转化为5caC、5fC、5-hmC等等的能力。所述TET酶任选为TET1、TET2、TET3中的至少一种。TET1、TET2、TET3可以从市场上购买得到，例如，可以购自NEB公司。

本文涉及的胞嘧啶、5mC(5-甲基胞嘧啶)、5caC(5-羧甲基胞嘧啶)、5hmC(5-羟甲基胞嘧啶)、5fC(5-醛基胞嘧啶)的化学结构式如下：

在一实施例中，TET氧化原理如下：

在一实施例中，采用上述组合物结合Fe²⁺(例如Fe(NH₄)₂(SO₄)₂)以及TET酶可以进行 DNA甲基化转化，将5mC氧化为5caC，上述氧化获得的5caC可以在还原剂作用下被还原为二氢尿嘧啶(DHU)，经过PCR测序识别为T，实现在非重亚硫酸氢盐条件下的DNA甲基化“C”到“T”转化，解决了现有技术中基于重亚硫酸氢盐转化构建的甲基化测序文库所存在的碱基不平衡，测序数据使用率低的缺陷，显著提高转化率。

在一实施例中，所述组合物亦称TET酶氧化缓冲液。

在一实施例中，组合物含有如下组分：167±20mM缓冲剂、333±20mM金属盐、3.3±0. 2mMα-酮戊二酸盐、6.67±1mM抗坏血酸、4±0.5mM三磷酸腺苷、8.33±1mM二硫苏糖醇。

在一实施例中，所述组合物含有如下浓度的组分：167mM缓冲剂、333mM金属盐、3.3mMα-酮戊二酸盐、6.67mM抗坏血酸、4mM三磷酸腺苷、8.33mM二硫苏糖醇。

在一实施例中，所述缓冲剂包括但不限于4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、三羟甲基氨基甲烷(别名Tris，CAS No.77-86-1)中的至少一种。

在一实施例中，所述金属盐包括但不限于氯化钠(NaCl)。

在一实施例中，所述组合物为用于氧化DNA分子中5-甲基胞嘧啶残基的组合物；

在一实施例中，所述组合物所氧化的待测样本为用于NGS测序的样本。该组合物作为氧化体系，与TET酶等其他组分混合形成反应混合物(亦称氧化反应体系)，对待测样本进行氧化，只需一次氧化，可有效提高待测样本NGS测序模式下5mC到T的转化率。

在一实施例中，所述组合物所氧化的待测样本还可以是用于三代测序或PCR检测的样本。

根据第二方面，在一实施例中，提供一种反应混合物，所述反应混合物含有第一方面所述组合物。

在一实施例中，所述反应混合物还含有TET酶。

在一实施例中，所述TET酶包括但不限于TET1、TET2、TET3中的至少一种。TET酶的来源不受限制，可以自行通过核酸表达纯化制备得到，也可以从市场上购买得到，TET酶的生产商包括但不限于NEB公司New England Biolabs(NEB)公司。

在一实施例中，所述反应混合物中TET酶的终浓度可以为2～10μM，包括但不限于2μM、 3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM。

在一实施例中，每50μL所述反应混合物中加有7～15μL第一方面所述组合物，优选为7. 5～15μL，更优选为15μL。

在一实施例中，每50μL所述反应混合物中加有4～8μL所述TET酶，优选为4μL。对于TET酶，如果是购买的，通常存在不知晓TET酶浓度的情况，因此，可以通过体积来定义酶的用量。

在一实施例中，所述反应混合物还含有Fe²⁺。

在一实施例中，含有Fe²⁺的化合物包括但不限于Fe(NH₄)₂(SO₄)₂、Fe₂SO₄。

在一实施例中，所述反应混合物中Fe²⁺的终浓度为50～100μM，优选为100μM。

在一实施例中，所述反应混合物还含有水，具体可以是无核酸酶的水等等，无核酸酶的水可以从市场上购买得到。

在一实施例中，第一方面所述组合物与TET酶、Fe²⁺组成的反应混合物可以使得DNA样本中的5-甲基胞嘧啶氧化，得到含有氧化的5-甲基胞嘧啶的DNA。该反应混合物具有高效的氧化效率，所得5-甲基胞嘧啶被充分氧化。

在一实施例中，所述反应混合物还包括有机硼烷，用于有效地使所述氧化的5-甲基胞嘧啶残基还原、脱氨基和脱羧基或脱醛基，从而得到含有二氢尿嘧啶(DHU)残基代替所述氧化的5-甲基胞嘧啶残基的DNA。

在一实施例中，所述有机硼烷包含硼烷与选自氮杂环和叔胺的含氮化合物的络合物。

在一实施例中，所述有机硼烷包含硼烷和氮杂环的络合物。

在一实施例中，所述氮杂环包含任选经1-4个低级烷基取代的吡啶。

在一实施例中，所述氮杂环包含吡啶、2-甲基吡啶或5-乙基-2-甲基吡啶。

在一实施例中，所述氮杂环包含2-甲基吡啶，并且所述有机硼烷是2-甲基吡啶硼烷。

在一实施例中，所述有机硼烷包含硼烷和叔胺的络合物。

在一实施例中，所述叔胺选自三乙胺和三(叔丁基)胺。

在一实施例中，所述有机硼烷包含吡啶硼烷。

在一实施例中，其中还原、脱氨基和脱羧基在不分离任何中间体的情况下进行。

在一实施例中，所述反应混合物不含亚硫酸氢盐。

在一实施例中，所述反应混合物所氧化的待测样本为用于NGS测序、三代测序或PCR 检测的样本。

根据第三方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，所述试剂盒含有第一方面所述组合物。配制得到第一方面所述组合物之后，可以存放于容器中，形成一种独立的产品进行售卖。

在一实施例中，第一方面的组合物可以包装于一独立容器中，配以说明书，制成试剂盒产品进行售卖。

在另一实施例中，TET酶可以包装于另一独立容器中，与装有第一方面组合物的容器成套包装，配以说明书，制成成套试剂盒产品进行售卖。

在一实施例中，所述试剂盒还包括用于存放第一方面所述组合物的容器。

在一实施例中，所述试剂盒还包括TET酶以及用于独立存放TET酶的容器。

在一实施例中，所述试剂盒还包括含有Fe²⁺的化合物以及用于独立存放所述含有Fe²⁺的化合物的容器。

在一实施例中，所述试剂盒还包括有机硼烷以及用于独立存放所述有机硼烷的容器。

在一实施例中，所述试剂盒还包括使用说明书，用于指导用户使用该试剂盒。

在一实施例中，使用时，从试剂盒的对应容器中取出第一方面所述混合物、TET酶以及含有Fe²⁺的化合物，混合，加入DNA样本，反应得到含有氧化的5-甲基胞嘧啶残基的DNA。

根据第四方面，在一实施例中，提供第一方面组合物，和/或第二方面所述试剂盒在氧化 5-甲基胞嘧啶中的应用。

在一实施例中，第一方面组合物，和/或第二方面所述试剂盒可用于测序，所述测序包括但不限于全基因组甲基化测序、甲基化靶向捕获测序等等。

根据第五方面，在一实施例中，提供一种氧化5-甲基胞嘧啶的方法，包括使含有5-甲基胞嘧啶(5mC)的DNA样本与第一方面所述组合物和/或第二方面所述试剂盒的组分接触，使样本中5-甲基胞嘧啶残基氧化，得到含有氧化的5-甲基胞嘧啶残基的DNA。

在一实施例中，将DNA样本中5-甲基胞嘧啶残基氧化时，具体是将样本与氧化反应体系混合，反应得到含有氧化的5-甲基胞嘧啶残基的DNA，所述氧化反应体系含有如下组分：第一方面所述组合物、TET酶、Fe²⁺。

在一实施例中，只对样本进行一次氧化。现有技术中需要两次氧化，操作繁琐，而且转化率不高。

在一实施例中，所述氧化反应体系的pH为4.3～7.5。

在一实施例中，每50μL所述氧化反应体系中，第一方面所述组合物的加入量为7～15μL，优选为7.5～15μL，更优选为15μL。

氧化反应体系的总体积不受限制，可以为25μL、100μL等等，可以根据需要进行配置，体系中各组分的用量等比例缩小或放大。

在一实施例中，所述氧化反应体系中，TET酶的终浓度2～10μM，包括但不限于2μM、3 μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM。

在一实施例中，每50μL所述氧化反应体系中，TET酶的加入量为4～8μL，优选为4μL。

在一实施例中，所述氧化反应体系中，Fe²⁺的终浓度为100μM。

在一实施例中，所述Fe²⁺以Fe(NH₄)₂(SO₄)₂和/或FeSO₄的形式加入所述氧化反应体系中。

在一实施例中，所述DNA样本包括但不限于全基因组样本、细胞游离DNA样本中的至少一种。

在一实施例中，所述DNA样本包含待测生物体的基因组DNA、细胞游离DNA中的至少一种。

在一实施例中，所述DNA样本还包含以及外源性内参DNA。外源性内参DNA是指与待测生物体的基因组不同源的DNA。

在一实施例中，所述外源性内参DNA为来源于与待测生物体不同物种的其他物种的DN A。

在一实施例中，所述待测生物体包括但不限于人。所述待测生物体可以为动物、植物、微生物等等中的任意一种。

在一实施例中，所述外源性内参DNA包括但不限于阳性内参、阴性内参中的至少一种。

在一实施例中，所述外源性内参DNA包括阳性内参、阴性内参。

在一实施例中，所述阳性内参包括甲基化的DNA。

在一实施例中，所述阴性内参包括未甲基化的DNA。

在一实施例中，所述阴性内参包括但不限于未甲基化的lambda DNA。

在一实施例中，所述氧化的5-甲基胞嘧啶包括但不限于5-羧甲基胞嘧啶(5caC)、5-醛基胞嘧啶(5fC)中的至少一种。也即是说，所述含有氧化的5-甲基胞嘧啶残基的DNA中含有 5-羧甲基胞嘧啶(5caC)残基、5-醛基胞嘧啶(5fC)残基中的至少一种。

在一实施例中，所述含有5-甲基胞嘧啶(5mC)的DNA样本为片段化的且连接有接头的DNA样本。

在一实施例中，所述方法在不存在亚硫酸氢盐的情况下进行。

根据第六方面，在一实施例中，提供一种检测DNA样本中5-甲基胞嘧啶残基的存在和位置的方法，所述方法包括：

3)对所述含有二氢尿嘧啶残基的DNA进行扩增和测序或检测。

在一实施例中，步骤2)中，所述测序包括但不限于NGS测序、三代测序或PCR检测。

在一实施例中，所述步骤1)、步骤2)在不存在亚硫酸氢盐的情况下进行。

在一实施例中，所述步骤1)、步骤2)在不分离任何中间体的情况下进行。

在一实施例中，所述接头连接的DNA片段包含含有选自样品标识符序列、片段标识符序列和链标识符序列的至少一种分子条形码的接头。

在一实施例中，所述步骤3)中，将包含过程标识符序列的分子条形码固定至所述含有D HU的DNA。

在一实施例中，所述DNA样本中含有双链DNA。

在一实施例中，所述接头连接的DNA片段包含片段标识符序列(亦称分子标签)和链标识符(亦称样本标签)序列二者。

在一实施例中，还包括分析经加工的链中的所述片段标识符序列和所述链标识符序列，以确定模板DNA片段中甲基化碱基(主要是甲基化胞嘧啶)的占比。

在一实施例中，还包括4)从测序结果确定5-甲基化模式和/或5-羟基化模式。

在一实施例中，提供一种提升全基因组甲基化非重亚硫酸氢盐测序转化率的方法，包括如下步骤：

步骤A：将100ng～1000ng人基因组gDNA片段化，然后加入140～160bp标准品，得到片段化的DNA；

步骤B：对片段化DNA进行末端修复和加A；

步骤C：使用连接酶连接修复-加A产物和接头以及分子条形码，得到加接头的dsDNA；

步骤D：对上述加接头DNA片段进行TET酶促氧化，得到TET酶氧化后的DNA片段；

步骤E：将所述TET酶处理的DNA，再进行吡啶硼烷还原处理，得吡啶硼烷还原产物；

步骤F：以吡啶硼烷处理后的DNA为模板，进行PCR扩增，完成文库构建；

步骤G：构建好的文库进行Taq酶PCR扩增外源性甲基化内参，对PCR扩增产物进行TaqI-v2酶切，并使用凝胶电泳验证转化效率，满足转化要求的文库进行上机检测。

在一实施例中，gDNA(genomic DNA，基因组DNA)：是指有机体在单倍体状态下的DNA全部含量。在一实施例中，广义的基因组也指某一体系(如核或细胞器)中的DNA，它包括编码或细胞中固有的核糖体DNA(rDNA)、线粒体DNA(mtDNA)、tRNA基因及其它RNA 编码基因。在一实施例中，基因组脱氧核糖核酸是染色体DNA，这一概念与染色体外DNA (如质粒)相对，常简写为gDNA(genomic DNA)。

在一实施例中，步骤A中，外源性内参DNA包括与人类不同物种的甲基化内参和未甲基化内参DNA。甲基化可采用140～160bp甲基化标准品和140～160bp非甲基化标准品。

在一实施例中，步骤B和C中的反应条件可按照传统的方法进行dsDNA末端修复和加 A，以及接头连接反应进行，例如，可采用NEB

Ultra^TM II DNA Library PrepKit中的试剂进行。

在一实施例中，步骤D中使用的TET酶氧化反应体系组成如下：50mM HEPES、100 mMNaCl、1mMα-酮戊二酸盐(α-KG)、2mM抗坏血酸、1.2mM ATP、1mM DTT(二硫苏糖醇)、100μM Fe(NH₄)₂(SO₄)₂。反应体系的pH为4.3～7.5。α-酮戊二酸盐和Fe(NH₄)₂(S O₄)₂盐为TET酶的辅酶。HEPES为缓冲剂。

在一实施例中，步骤E中，吡啶硼烷处理的混合物组成如下：35μL DNA、600mM醋酸钠(pH＝4.3)缓冲液和1M吡啶硼烷(CAS：110-51-0，分子式：C₅H₈BN，分子量：92.93)。

在一实施例中，步骤F中的PCR反应，需要特定的扩增酶，例如使用KAPA HIFIUrail +聚合酶。

在一实施例中，步骤F所述文库的二代测序，依据步骤C和F中使用的接头和扩增引物，可采用相应的Illumina平台或者MGI、Gene+Seq平台进行。

在一实施例中，步骤G中，Taq酶PCR扩增反应体系包含：Taq酶、外源性甲基化内参的引物、步骤F中的文库DNA、Taq酶反应缓冲液。TaqI-V2酶切反应体系包含：甲基化内参的PCR产物、TaqI-V2酶、TaqI-V2缓冲液。所述凝胶电泳按照常规的dsDNA电泳条件进行。

在一实施例中，步骤A、B、C、D、E、F完成后，还包括纯化步骤。

在一实施例中，纯化步骤可以采用磁珠(例如Axygen磁珠)，或者Zymo IC SpinCol umn离心柱进行。

实施例1

本实施例的技术路线如下：

预先制备标准品。

合成10条长度为140～160bp DNA序列(sequence1、sequence2、sequence3、sequenc e4、sequence5、sequence6、sequence7、sequence8、sequence9、sequence10)，每条序列包含7～13个CpG位点。设计扩增上述10条序列的引物对(sequence1-F/R、sequence2-F/R、 sequence3-F/R、sequence4-F/R、sequence5-F/R、sequence6-F/R、sequence7-F/R、sequence8- F/R、sequence9-F/R、sequence10-F/R)。

sequence1：

ATATCTGATGATGCAAATTCCCTACCGGATCATTGACTTATGACATAGGCGGGAATT TTGCATCGCATCTGTTCAAGGGACGAGCATATGTACACTGCTGCATGCCCAACCTGGA CGTTCGAGACATCATGCGGCACGAAGGCCAGAAAGACAGTATTGAAC(SEQ ID NO.1)。

sequence2：

GTGATGTACAATGCACTTTCAGAGTTATCCGGTGTTAAGGGAGTCTGACAAATTCGATGTTGATGTTTTTTCCCAGATGTGCCAATCTTTGGAAGTTGACCCAATGACGGCAGCGAAGGTTATAGTCGCGGTCATGAGCAATGAGAGCGGTCTGACTCTCACATTTGAAC(S EQ ID NO.2)。

sequence3：

TAGCTGGTCTTGCTGGAGATCATCCGGTCGATCGTCCGTACGAACGAACGAGCGA ACGAACGAACGTTCGTTAGAGTTTCATATGGCAAGGCAGATTGTTAATTGTAAGCAGA TGAGCTTGTGTACAGGGTCGGATTAAAGTTCAGCAAATGAAAAAC(SEQ ID NO.3)。

sequence4：

GAGTAGCTGTCAGCTCTGAGTCTGTTGTTATGTAACTCAGAACTCATTCCGAACGA TGCGCTTCGAACGGACCGCAGCGCAACGAAACGTCACGTTACGACTGCAGGTTGTTC TTGTCCCGGAGAGTTCGGCTGTGGGAAAACCAAAG(SEQ ID NO.4)。

Sequence5：

GACCCTGAGGAACTCATCAAGGAAGTCGAGGAAGTCCGGACAGCAAAAGAAAT TGACCGCGCGTAACTAAGGCCAGAACGCGCGCGCAGAAGGGGTTCAAACGCGCGTC ACAACCTTCATAGAGGCAAGGCACGTAAAGCACACAAAGCTAAGC(SEQ ID NO.5)。

Sequence6：

TTGCATCTGGTATCAAAGAAAGAGCGGGGACCGGTCACGACGTTCATTGGAAAC ACTGTGATCATTGCTGCATGTTTGGCCTCGATGCTTCCGATGGAGAAAATAATCAAAGG AGCCTTTTGCGGTGACGATAGTCTGCTGTACTTTCCAAAGG(SEQ ID NO.6)。

Sequence7：

TTATATGCCCAATGGCACACTATACGCTGCAAATCCGGCGAATAGTGAGAACTTGG CGAGAGAACAACCTCGAACGCCGCAAGGACAAGAGAGGGCGGCGTGGCATAGACGA AAGGAAAAGGTTAAAGCCAAGAAACTCGCC GCACTTGAACAGGCACTAGCCAACA(S EQ ID NO.7)。

sequence8：

ACTGGAAGAGGCACTAAATGAACACGATTAACATCCGGCTAAGAACGACTTCTCT GACATCGAACTGGCTGCTATCCCGTTCAACACTCTGGCTGACCATTACGGTGAGCGTTT AGCTCGCGAACAGTTGGCCCTTGAGCATGAGT(SEQ ID NO.8)。

sequence9：

TGACCTTGAAGCTAAGCACTTCAAGAAAAACGTTGAGGAACAACTCAACAAGCCGGCGTAGGGCACGTCTACAAGAAAGCATTTATGCAAGTTGTCGAGGCTGACATGCTCT CTAAGGGTCTACTCGGTGGCGAGGCGTGGTCTTCGTGGCATAAGGAAGACTCTATTCA T(SEQ ID NO.9)。

sequence10：

GTAAGGAAGGTTACTACTGGCTGAAAATCCACGGTGCAAACTGTGCCGGGGTGT CGATAAGGTTCCGTTCCCTGAGCGCATCAAGTTCATTGAGGAAAACCACGAGAACATC ATGGCTTGCGCTAAGTCTCCACTGGAGAACACTTGGTGGGCTGAGC(SEQ ID NO.10)。

下划线标记的碱基为CpG位点。

引物序列如下：

表1

sequence1-F	ATATCTGATGATGCAAATTCCCTA	SEQ ID NO.11
			sequence1-R	GTTCAATACTGTCTTTCTGGCCTT	SEQ ID NO.12
sequence2-F	GTGATGTACAATGCACTTTCAGAGT	SEQ ID NO.13
			sequence2-R	GTTCAAATGTGAGAGTCAGACCG	SEQ ID NO.14
sequence3-F	TAGCTGGTCTTGCTGGAGATC	SEQ ID NO.15
			sequence3-R	GTTTTTCATTTGCTGAACTTTAATC	SEQ ID NO.16
sequence4-F	GAGTAGCTGTCAGCTCTGAGTCTG	SEQ ID NO.17
			sequence4-R	CTTTGGTTTTCCCACAGCC	SEQ ID NO.18
sequence5-F	GACCCTGAGGAACTCATCAAGG	SEQ ID NO.19
			sequence5-R	GCTTAGCTTTGTGTGCTTTACGT	SEQ ID NO.20
sequence6-F	TTGCATCTGGTATCAAAGAAAGAG	SEQ ID NO.21
			sequence6-R	CCTTTGGAAAGTACAGCAGACTAT	SEQ ID NO.22
sequence7-F	TTATATGCCCAATGGCACACT	SEQ ID NO.23
			sequence7-R	TGTTGGCTAGTGCCTGTTCA	SEQ ID NO.24
sequence8-F	ACTGGAAGAGGCACTAAATGAAC	SEQ ID NO.25
			sequence8-R	ACTCATGCTCAAGGGCCAA	SEQ ID NO.26
sequence9-F	TGACCTTGAAGCTAAGCACTTCA	SEQ ID NO.27
			sequence9-R	ATGAATAGAGTCTTCCTTATGCCA	SEQ ID NO.28
sequence10-F	GTAAGGAAGGTTACTACTGGCTGA	SEQ ID NO.29
			sequence10-R	GCTCAGCCCACCAAGTGTT	SEQ ID NO.30

2、合成上述10条标准品序列，并且克隆到pUC57质粒中，获得质粒干粉。合成扩增10条序列的引物对。合成工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

3、质粒和引物干粉用TE缓冲液溶解后，置于-20℃环境中保存。

4、140～160bp DNA扩增。

配制如下扩增反应体系：

表2

KAPA HiFi HotStart ReadyMix购自Roche，货号：07958927001。体系中F-引物、R-引物的浓度各自为15μM，模板浓度为1ng/μl。

NF水是指无核酸酶水(Nuclease-Free Water，生产商：Promega，货号P1197)。

每种质粒和对应引物为一个扩增反应体系，总共10个扩增反应体系。

PCR上机程序见下表：

表3

5、使用预制琼脂糖凝胶电泳***(Thermo Fisher，型号E-Gel)回收140～160bpDN A。分别取22.5μL扩增产物，加入2.5μL 10×DNA Loading Buffer，使用E-gel回收140～1 60bp目标片段，并使用Qubit^TM dsDNA HS Assay Kit(货号：Q32854)，用Qubit 4Fluorometer(货号：Q33238)进行定量检测，检测得到产物浓度约50ng/μL。

6、取等质量的sequnce1、sequnce2、sequnce3、sequnce4、sequnce5混合，标记为seq uence-(1/2/3/4/5)。随后取1μg DNA，进行后续甲基化实验。

7、甲基化反应

配制如下甲基化反应体系：

表4

组分	体积或质量
		NEBuffer<sup>TM</sup> 2(10x)	5μL
Diluted SAM	5μL
		M.SssI	2μL
H<sub>2</sub>O	补足至50μL
		sequence-(1/2/3/4/5)DNA	1μg
总体积	50μL

NEBuffer^TM 2为M.SssI自带的缓冲液。

Diluted SAM购自NEB公司，货号：B9003S。

M.SssI购自NEB公司，货号：M0226S。

反应条件：37℃反应1h。产物即为甲基化sequence-(1/2/3/4/5)DNA，标记为“140～16 0bp甲基化DNA”。-20℃保存。

8、HpaII酶切鉴定

表5

HpaII购自NEB公司，货号：R0171L。自带CutSmart缓冲液。

9、电泳检测HapII酶切产物

取适当体积反应液进行琼脂糖凝胶电泳，甲基化sequence(1/2/3/4/5)不能被HpaII切割，在150bp左右只有1条带；非甲基化sequence(1/2/3/4/5)能被HpaII切割，在150bp 左右存在2条带。

10、140～160bp非甲基化DNA标准品制备

取等量sequence6、sequence7、sequence8、Sequence9、sequence10 DNA混匀，混合DN A样品标记为“140～160bp非甲基化DNA，”按照使用量分装，-20℃保存。

本实施例的TET氧化、硼烷还原操作步骤如下：

(1)取500ng细胞gDNA打断，使用covris打断仪打断，打断后产物主峰在300bp左右。对于打断后的gDNA，采用1X磁珠进行纯化，无酶水洗脱，洗脱体积67μL。取100ng 打断后DNA加入0.5％140～160bp甲基化标准品和0.5％140～160bp非甲基化标准品。

(2)末端修复和加A

21)末端修复和加A反应体系如下：

表6

混合物组分	体积
		片段化的双链DNA	50μL
末端修复&加A-缓冲液*	7μL
		末端修复&加A-酶混合物*	3μL
总体积	60μL

末端修复&加A-缓冲液、末端修复&加A-酶混合物均为购自NEB的NEBNext末端修复/加dA尾模块中的试剂，货号E7442L。

修复反应条件如下：

表7

步骤	温度	时间
			末端修复	20℃	30min
加A	65℃	30min
			HOLD	4℃	∞

热盖温度为85℃。

22)连接反应

将步骤(21)中末端修复和加A的产物使用连接酶连接加接头，得到加接头的dsDNA，所述连接反应体系如下表3；

表8

组分	体积
		末端修复&加A产物	60μL
接头储液(15μM)	3μL
		PCR级水	16μL
连接增强液	1μL
		DNA连接酶预混液	30μL
总体积	110μL

连接增强液、DNA连接酶预混液均为购自NEB的NEBNext末端修复/加dA尾模块中自带的组分。

接头(带Index)购自华大智造，MGIEasy DNA Adapters-96(Plate)kit，货号：100000 5282。

孵育条件：20℃，时间30min。

23)连接后纯化

纯化体系如下：

表9

具体操作步骤如下：

231)震荡混匀，离心。

232)室温孵育5-10min，使DNA与磁珠结合。

233)将EP管置于磁力架2min，溶液澄清。

234)吸去上清。

235)加入200μL 80％乙醇。

236)静置30s。

237)吸掉乙醇，重复漂洗一次。

238)室温下或37℃挥干乙醇，磁珠没有明显的发亮或干裂。

239)加入22μL无酶水洗脱DNA。

(3)TET酶氧化反应

31)冰上配置TET酶氧化反应体系：

表10

反应混合物	体积	终浓度
			接头连接的DNA	20μL	100ng
TET氧化缓冲液(pH4.3-7.5)	15μL	1X
			1.5mM Fe(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>(SO<sub>4</sub>)<sub>2</sub>	3.33μL	100μM
TET酶	4μL	约8μM
			无酶水	补足至50μL	-
总体积	50μL	-

本实施例的TET酶购自NEB，为NEB EM conversion module中的试剂，生产商提供的说明书中未公开酶浓度，上表中的酶浓度为估算浓度。

TET氧化缓冲液具体组分如下：

167mM HEPES、333mM NaCl、3.3mMα-酮戊二酸盐(α-KG)、6.67mM抗坏血酸、4 mMATP、8.33mM DTT。此处各组分的浓度为TET氧化缓冲液与DNA、TET酶、Fe(NH₄) ₂(SO₄)₂、无酶水等其他组分混合前的浓度，即初始浓度，而非终浓度。

使用氢氧化钠水溶液、盐酸调节pH，分别配制pH为4.3、6、7、7.5、8的TET氧化缓冲液，按照表10分别配制相应的TET酶氧化反应体系，分别进行后续的步骤。

32)反应条件：37℃，80min。

33)加入1μL蛋白酶K(0.8U)到氧化反应体系中，50℃孵育1h。

34)向产物中加入1.8X磁珠。

35)震荡混匀，离心。

36)室温孵育5～10min，使DNA与磁珠结合。

37)将EP管置于磁力架2min，溶液澄清。

38)吸去上清。

39)加入200μL的80％乙醇。

310)静置30s。

311)吸掉乙醇。

312)室温下挥发乙醇，磁珠没有明显的发亮或干裂。

313)使用37μL的无酶水洗脱。

(4)吡啶硼烷还原反应

41)还原反应体系配置

按下表配制还原反应体系。

表11

反应混合物	体积
		3M醋酸钠pH＝4.3	10μL
10M吡啶硼烷	5μL
		DNA	35μL

DNA即为TET酶氧化产物。

42)反应条件：37℃，1200rpm孵育16h。

43)采用离心柱(如Zymo-IC spin column)纯化DNA。洗脱体积25μL。

(5)文库扩增

51)PCR扩增反应配置，反应体系如下表：

表12

组分	体积
		KAPA HiFi HotStart Uracil+ReadyMix(2X)	25μL
MGI的引物	2.5μL
		吡啶硼烷处理的DNA	22.5μL
总体积	50μL

所用的引物依据所用平台和使用的接头而确定。推荐体系中的引物最终浓度为0.5～2μ M，本实施例中具体为0.75μM。

52)反应条件如下：

表13

53)上述PCR反应的产物，用0.9X磁珠清洗一次，洗脱体积22μL。

(6)外源性内参DNA转化率验证

61)外源性内参Taq酶扩增反应

将步骤(5)得到的纯化后PCR产物，取0.5μL，进行PCR扩增。配制1ng/μL 140～160bp非甲基化标准品sequence(1/2/3/4/5)，取0.5μL作为对照组。

表14

62)PCR扩增条件如表10所示：

表15

63)取>100ng PCR扩增产物(本实施例具体是取15μL)，进行TaqαI酶切反应，反应体系如下：

表16

试剂	体积	终浓度
			162bp PCR产物	15μL	-
10X CutSmart缓冲液	2.5μL	1X
			TaqI-V2	0.5μL	10U
无酶水	补足至25μL	NA
			总体积	25μL	-

反应条件：65℃孵育0.5～1h(本实施例具体为1h)。

64)取步骤63)的10μL酶切产物和步骤62)的PCR产物，加入6X荧光黄、3％琼脂糖凝胶进行电泳。图1为电泳结果图。

使用Image J软件计算最终5mC到T的转化效率。

140～160bp转化率计算方法如下：162bp峰面积/(162bp峰面积+119bp峰面积)。

图1的电泳结果显示，转化成功的酶切文库能且仅能看到一条带(162bp)，未转化成功的酶切文库，可见清晰的两条带(43bp和119bp)，未经酶切的PCR产物，仅可见一条带。

最后经过Image J软件计算最终5mC(不区分无法区分5hmC与5mC，标准品中只有5mC)到T的转化效率，结果如图2所示，可见，缓冲液pH为4.3、6、7、7.5时，5mC到T 的转化率(两个样本的转化率平均值)高达96％以上，且在pH为6时达到99％以上，而缓冲液pH为8时，5mC到T的转化率只有约82％，可见，本实施例可以显著提高5mC到T。

(7)构建的文库经Qsep100(光鼎)生物分析仪质控，质控结果如图4所示。

测序和生信分析鉴定转化率：

每个样品使用MGI T7平台PE150模式测序90G，参照公开号为CN111755072A的中国专利《一种同时检测甲基化水平、基因组变异和***片段的方法及装置》(具体参照该专利说明书第56～61段，即步骤S2、S3、S4)的方法计算140～160bp甲基化DNA转化率。

图3为NGS测序计算的转化率结果图，可见，pH为4.3、6、7、7.5时，5mC到T的转化率分别高达95.81％、98.55％、97.17％、96.25％，而pH为8时，仅有76.45％。可见，氧化体系的pH为4.3～7时，可显著提高转化率，而且只需要一步氧化。

实施例2

本实施例提供cfDNA非重亚硫酸盐测序

取5例人源cfDNA样本，每例样本50ng，每例样本分别添加0.5％(甲基化DNA标准品的质量为样本质量的0.5％)140～160bp甲基化DNA标准品以及0.5％(非甲基化DNA标准品的质量为样本质量的0.5％)的140～160bp非甲基化DNA标准品。氧化体系的pH为6，其他操作步骤参照实施例1进行(鉴于实施例1的结果已经表明氧化体系pH最佳值为6，因此，本实施例的氧化体系pH设置为6)。

图5为cfDNA中标准品的电泳结果图以及转化率结果图，可见，转化成功的酶切文库能且仅能看到一条带(162bp)，未转化成功的酶切文库，可见清晰的两条带(43bp和119bp)，未经酶切的PCR产物，仅可见一条带。经过Image J软件计算最终5mC(不区分无法区分5h mC与5mC，标准品中只有5mC)到T的转化效率，结果为99.01％，基于NGS测序计算，结果为98.02％，可见，只需一次氧化，而且有效提高转化率。

在一实施例中，本发明通过重新设计氧化缓冲液的pH，使得TET酶氧化5-甲基胞嘧啶 (5mC)生成5-羧甲基胞嘧啶(5caC)的效率显著提升，最终通过PCR-酶切鉴定，甲基化阳性内参的转化率显著提升，基于NGS测序计算得到的转化率达到了98％以上的水平。

在一实施例中，本发明显著提升全基因组甲基化非重亚硫酸氢盐测序转化率。

在一实施例中，本发明能全面检测全基因组单碱基5mC修饰，也可用于甲基化靶向捕获测序等等其他用途。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳吉因加医学检验实验室

<120> 一种组合物及其氧化5-甲基胞嘧啶的方法

<130> 21I31626

<160> 30

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 162

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atatctgatg atgcaaattc cctaccggat cattgactta tgacataggc gggaattttg 60

catcgcatct gttcaaggga cgagcatatg tacactgctg catgcccaac ctggacgttc 120

gagacatcat gcggcacgaa ggccagaaag acagtattga ac 162

<210> 2

<211> 158

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tagctggtct tgctggagat catccggtcg atcgtccgta cgaacgaacg agcgaacgaa 60

cgaacgttcg ttagagtttc atatggcaag gcagattgtt aattgtaagc agatgagctt 120

gtgtacaggg tcggattaaa gttcagcaaa tgaaaaac 158

<210> 3

<211> 158

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tagctggtct tgctggagat catccggtcg atcgtccgta cgaacgaacg agcgaacgaa 60

cgaacgttcg ttagagtttc atatggcaag gcagattgtt aattgtaagc agatgagctt 120

gtgtacaggg tcggattaaa gttcagcaaa tgaaaaac 158

<210> 4

<211> 148

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gagtagctgt cagctctgag tctgttgtta tgtaactcag aactcattcc gaacgatgcg 60

cttcgaacgg accgcagcgc aacgaaacgt cacgttacga ctgcaggttg ttcttgtccc 120

ggagagttcg gctgtgggaa aaccaaag 148

<210> 5

<211> 154

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaccctgagg aactcatcaa ggaagtcgag gaagtccgga cagcaaaaga aattgaccgc 60

gcgtaactaa ggccagaacg cgcgcgcaga aggggttcaa acgcgcgtca caaccttcat 120

agaggcaagg cacgtaaagc acacaaagct aagc 154

<210> 6

<211> 154

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttgcatctgg tatcaaagaa agagcgggga ccggtcacga cgttcattgg aaacactgtg 60

atcattgctg catgtttggc ctcgatgctt ccgatggaga aaataatcaa aggagccttt 120

tgcggtgacg atagtctgct gtactttcca aagg 154

<210> 7

<211> 167

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttatatgccc aatggcacac tatacgctgc aaatccggcg aatagtgaga acttggcgag 60

agaacaacct cgaacgccgc aaggacaaga gagggcggcg tggcatagac gaaaggaaaa 120

ggttaaagcc aagaaactcg ccgcacttga acaggcacta gccaaca 167

<210> 8

<211> 146

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

actggaagag gcactaaatg aacacgatta acatccggct aagaacgact tctctgacat 60

cgaactggct gctatcccgt tcaacactct ggctgaccat tacggtgagc gtttagctcg 120

cgaacagttg gcccttgagc atgagt 146

<210> 9

<211> 171

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgaccttgaa gctaagcact tcaagaaaaa cgttgaggaa caactcaaca agccggcgta 60

gggcacgtct acaagaaagc atttatgcaa gttgtcgagg ctgacatgct ctctaagggt 120

ctactcggtg gcgaggcgtg gtcttcgtgg cataaggaag actctattca t 171

<210> 10

<211> 158

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtaaggaagg ttactactgg ctgaaaatcc acggtgcaaa ctgtgccggg gtgtcgataa 60

ggttccgttc cctgagcgca tcaagttcat tgaggaaaac cacgagaaca tcatggcttg 120

cgctaagtct ccactggaga acacttggtg ggctgagc 158

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atatctgatg atgcaaattc ccta 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gttcaatact gtctttctgg cctt 24

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtgatgtaca atgcactttc agagt 25

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gttcaaatgt gagagtcaga ccg 23

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tagctggtct tgctggagat c 21

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gtttttcatt tgctgaactt taatc 25

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gagtagctgt cagctctgag tctg 24

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ctttggtttt cccacagcc 19

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gaccctgagg aactcatcaa gg 22

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gcttagcttt gtgtgcttta cgt 23

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ttgcatctgg tatcaaagaa agag 24

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cctttggaaa gtacagcaga ctat 24

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ttatatgccc aatggcacac t 21

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tgttggctag tgcctgttca 20

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

actggaagag gcactaaatg aac 23

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

actcatgctc aagggccaa 19

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tgaccttgaa gctaagcact tca 23

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

atgaatagag tcttccttat gcca 24

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gtaaggaagg ttactactgg ctga 24

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

gctcagccca ccaagtgtt 19

Claims

1.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有如下组分：缓冲剂、金属盐、α-酮戊二酸盐、抗坏血酸、三磷酸腺苷、二硫苏糖醇，所述组合物的pH为4.3～7.5。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有如下浓度的组分：167±20mM缓冲剂、333±20mM金属盐、3.3±0.2mMα-酮戊二酸盐、6.67±1mM抗坏血酸、4±0.5mM三磷酸腺苷、8.33±1mM二硫苏糖醇；

和/或，所述组合物含有如下浓度的组分：167mM缓冲剂、333mM金属盐、3.3mMα-酮戊二酸盐、6.67mM抗坏血酸、4mM三磷酸腺苷、8.33mM二硫苏糖醇。

3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述缓冲剂包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三羟甲基氨基甲烷中的至少一种；

和/或，所述金属盐包含氯化钠；

和/或，所述组合物为用于氧化DNA分子中5-甲基胞嘧啶残基的组合物；

和/或，所述组合物所氧化的待测样本为用于NGS测序、三代测序或PCR检测的样本。

4.一种反应混合物，其特征在于，所述反应混合物含有权利要求1～3任意一项所述组合物。

5.如权利要求4所述的反应混合物，其特征在于，所述反应混合物还含有TET酶，所述TET酶包含TET1、TET2、TET3中的至少一种。

6.如权利要求5所述的反应混合物，其特征在于，所述反应混合物中TET酶的终浓度为2～10μM；

和/或，每50μL所述反应混合物中加有7～15μL权利要求1～3任意一项所述组合物，优选为15μL；

和/或，每50μL所述反应混合物中加有4～8μL所述TET酶，优选为4μL。

7.如权利要求4所述的反应混合物，其特征在于，所述反应混合物还含有Fe²⁺；

和/或，所述反应混合物中Fe²⁺的终浓度为50～100μM，优选为100μM；

和/或，所述反应混合物还包括有机硼烷，用于有效地使所述氧化的5-甲基胞嘧啶残基还原、脱氨基和脱羧基或脱醛基，从而得到含有二氢尿嘧啶(DHU)残基代替所述氧化的5-甲基胞嘧啶残基的DNA；

和/或，所述反应混合物不含亚硫酸氢盐；

和/或，所述反应混合物所氧化的待测样本为用于NGS测序、三代测序或PCR检测的样本。

8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1～3任意一项所述组合物。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于存放权利要求1～3任意一项所述组合物的容器；

和/或，所述试剂盒还包括TET酶以及用于独立存放TET酶的容器；

和/或，所述试剂盒还包括含有Fe²⁺的化合物以及用于独立存放所述含有Fe²⁺的化合物的容器；

和/或，所述试剂盒还包括有机硼烷以及用于独立存放所述有机硼烷的容器；

和/或，所述试剂盒还包括使用说明书，用于指导用户使用所述试剂盒。

10.一种氧化5-甲基胞嘧啶的方法，其特征在于，包括使含有5-甲基胞嘧啶(5mC)的DNA样本与权利要求1～3任意一项所述组合物、TET酶、含有Fe²⁺的化合物接触，使样本中5-甲基胞嘧啶残基氧化，得到含有氧化的5-甲基胞嘧啶残基的DNA。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，将DNA样本中5-甲基胞嘧啶残基氧化时，具体是将样本与氧化反应体系混合，反应得到含有氧化的5-甲基胞嘧啶残基的DNA，所述氧化反应体系含有如下组分：权利要求1～3任意一项所述组合物、TET酶、Fe²⁺；

和/或，只对样本进行一次氧化；

和/或，所述氧化反应体系的pH为4.3～7.5；

和/或，每50μL所述氧化反应体系中，权利要求1～3任意一项所述组合物的加入量为7～15μL，优选为15μL；

和/或，所述氧化反应体系中，TET酶的终浓度2～10μM；

和/或，每50μL所述氧化反应体系中，TET酶的加入量为4～8μL，优选为4μL；

和/或，所述氧化反应体系中，Fe²⁺的终浓度为100μM；

和/或，所述Fe²⁺以Fe(NH₄)₂(SO₄)₂和/或FeSO₄的形式加入所述氧化反应体系中；

和/或，所述DNA样本为全基因组样本、细胞游离DNA样本中的至少一种；

和/或，所述DNA样本包含待测生物体的基因组DNA和/或细胞游离DNA；

和/或，所述DNA样本为用于NGS测序、三代测序或PCR检测的样本；

和/或，所述DNA样本还包含外源性内参DNA；

和/或，所述外源性内参DNA为来源于与待测生物体不同物种的其他物种的DNA；

和/或，所述待测生物体为动物、植物、微生物中的任意一种；

和/或，所述待测生物体包括人。

12.一种检测DNA样本中5-甲基胞嘧啶残基的存在和位置的方法，其特征在于，所述方法包括：

1)使用权利要求10～11任意一项所述方法，使片段化的且连接有接头的DNA样本中5-甲基胞嘧啶残基氧化，得到含有氧化的5-甲基胞嘧啶残基的DNA；

2)使所述含有氧化的5-甲基胞嘧啶残基的DNA与有机硼烷接触，所述有机硼烷有效地使所述氧化的5-甲基胞嘧啶残基还原、脱氨基和脱羧基或脱醛基，从而得到含有二氢尿嘧啶(DHU)残基代替所述氧化的5-甲基胞嘧啶残基的DNA；

3)对所述含有二氢尿嘧啶残基的DNA进行扩增和测序或检测。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法包括：步骤3)中，所述测序或检测包括NGS测序、三代测序或PCR检测；

所述步骤1)、步骤2)在不存在亚硫酸氢盐的情况下进行。