CN114410617A - 一种提高产氢细菌生物氢合成的固定化方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高产氢细菌生物氢合成的固定化方法及应用，本发明涉及细菌菌剂固定化技术领域，主要包括：以原桃胶为原料合成纳米磁铁矿；将所述原桃胶制备成溶液，添加0.5倍质量的海藻酸钠，与一定浓度桃胶合成的纳米磁铁矿、产氢细菌菌悬液混匀，滴加至CaCl2溶液中，形成固定化凝胶珠。所述固定化凝胶珠应用于木质纤维素水解液发酵产氢***，能使该***活菌数增加，使发酵120h的累积产氢量提高约60％，水解液中葡萄糖和木糖利用率显著提高。本发明以原桃胶为原料制备的纳米磁铁矿作为添加剂、以原桃胶作为主要固定化载体制备了产氢细菌高效固定化菌剂，方法简便，条件温和，稳定性好，细菌存活率高，促产氢效果显著。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型耦合纳米材料固定化剂的制备方法及应用领域，特别是涉及由原桃胶作为原料合成纳米磁铁矿并耦合桃胶固定化剂的制备方法及其应用，尤其涉及该新型固定化剂在调控产氢细菌生物氢合成中的效果，应用于生物氢能源高效合成与调控领域。
背景技术
固定化产氢细菌细胞技术以其能增加***稳定性、扩大产氢细菌活性范围，提高***耐受pH变化能力等，已成为提高细菌产氢能力的重要技术。固定化细胞方法按照固定化载体与作用方式的不同，可分为包埋法、***截留法、吸附法和交联法。包埋法是细胞固定化最常用的方法，包埋载体主要利用天然高分子多糖类和合成高分子化合物。天然高分子多糖类的琼脂、海藻酸钙和卡拉胶应用最多，具有固定化成形方便，对微生物毒性小及固定化密度高等优点，但其抗微生物分解性能较差，机械强度较低。合成高分子化合物中主要利用聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光硬化树脂等，其突出优点是抗微生物分解性能好、机械强度高、化学性能稳定，但其聚合物网络的形成条件比较剧烈，对微生物细胞的损害较大，而且成形的多样性和可控性不好。为此，开发新型固定化剂对于有效提高产氢细菌的生物氢产量至关重要。
桃胶是蔷薇科植物桃或山桃等树皮中分泌出来的胶状物质。一般将未经过任何处理的桃胶称为原桃胶，原桃胶为桃红色或淡黄色至黄褐色半透明固体块状，外表平滑。原桃胶分子量大，有较好的吸附性能，在医学上，由于其不被胃液分解，通常作为一种天然囊材，制成水凝胶用于包埋药物；在食品工业中，其可制备为微胶囊用于包埋鱼油等保健品。可见，原桃胶具备作为包埋载体的基本特性，可望用作新型的固定化载体。
近年来，在发酵产氢***中添加一定浓度纳米颗粒可有效促进生物氢产率的提高，据报道，纳米颗粒的表面效应和量子尺寸效应可以通过加速电子从NADPH向氢酶的转移来提高其酶活性，从而促进生物氢的合成。为此，纳米颗粒的添加已成为促进生物氢合成的重要调控方式。尤其是以天然植物及其提取物为原料绿色合成的纳米颗粒添加至发酵产氢***，亦可起到较好的促产氢效果，并且，采用绿色法合成纳米颗粒具有条件温和、制备工艺简单、成本低廉等优点，目前已逐渐成为重要的纳米颗粒合成方式。原桃胶作为一种天然原料，其化学成分除主要包括原桃胶多糖外，还包括苏氨酸、组氨酸等常见氨基酸和K、Ca、Mg、Fe、Mn等微量元素。因此，以原桃胶为原料，亦可用于纳米颗粒的绿色合成，作为促产氢剂添加至发酵产氢***。
综上，固定化技术的采纳及纳米颗粒的添加均是促进产氢细菌生物氢合成的有效措施。基于原桃胶作为原材料的固定化耦合纳米颗粒添加可望开发一种低成本、高效促进生物氢合成的产氢细菌固定化方式，拟解决生物制氢效率低的关键技术问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题：本发明旨在提供一种用于固定化产氢细菌细胞的固定化方法，该方法具有固定化效率高、产氢细菌菌剂活性强、稳定性好、成形方便且可控等特点，可以提高产氢细菌的生物氢合成量、细菌存活率、木质纤维素水解液葡萄糖和木糖的利用率。
为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：
一种提高产氢细菌生物氢合成的固定化方法，具体步骤如下：
(A)称取4g桃胶粉加入100mL蒸馏水中，置于80℃水浴锅中恒温处理8h，使桃胶粉全部溶胀，形成桃胶液；获得的桃胶液适当冷却后，加入2g海藻酸钠，充分混匀后，灭菌得原桃胶/海藻酸钠溶液；
(B)取生长至对数期的产氢细菌，按照0.5g菌体/10mL原桃胶/海藻酸钠溶液比例添加至原桃胶/海藻酸钠溶液中，混匀，再添加一定浓度(0～50mg/L)无菌的绿色合成纳米磁铁矿，用灭菌医用注射器匀速滴入无菌氯化钙溶液中，待凝胶珠成形后钙化1～2h，弃去多余的氯化钙溶液，再用灭菌的生理盐水洗涤，即得固定化凝胶珠。
优选地，所述产氢细菌为阴沟肠杆菌、产氢克雷伯氏菌、产氢克雷伯氏菌工程菌中的一种或多种。
优选地，所述生长至对数期的产氢克雷伯氏菌菌体细胞的制备方法为：挑取活化的产氢克雷伯氏菌单菌落于液体培养基中过夜培养，进一步低速离心，弃上清液、收集菌体，用生理盐水洗涤2～3次，弃上清、收集菌体，用于固定化凝胶珠制备；所述液体培养基配方为：D-木糖10g，葡萄糖10g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，KH2PO4 0.5g，MgSO4·7H2O1g，pH7.5，水1000mL。
优选地，所述的无菌的绿色合成纳米磁铁矿为原桃胶合成的纳米磁铁矿于121℃灭菌20min制得；所述的无菌氯化钙溶液为10g/L的氯化钙水溶液于121℃灭菌20min制得。
优选地，所述原桃胶合成的纳米磁铁矿按如下方法制备：
(1)称取1g桃胶粉加入100mL蒸馏水中，置于80℃水浴锅中恒温处理8h，使桃胶粉全部溶胀，形成桃胶液；进一步调节pH值为10～11，置于恒温磁力搅拌器上，85℃加热搅拌3h后，再降温至50℃，向桃胶溶液中加入一定体积的0.5mol/L Fe3+及0.75mol/L Fe2+溶液，使混合液中Fe3+：Fe2+＝2：1，置于恒温磁力搅拌器上，于60℃下连续搅拌4h；
(2)上述反应液冷却至室温，边搅拌边缓慢加入新配制的2mol/L NaOH溶液至沉淀全部转变为黑色，再于80℃连续搅拌反应1h；
(3)反应完成后，将步骤(2)的反应液静置、冷却，用永磁体对获得的纳米颗粒进行分离，用无水乙醇和蒸馏水分别洗涤3次，离心，收集沉淀置于70℃恒温干燥箱中烘干至恒重；烘干物取出、研磨、过200目筛，即得桃胶绿色合成的纳米磁铁矿。
优选地，所述Fe3+盐为三氯化铁；所述Fe2+盐为硫酸亚铁。
一种上述固定化凝胶珠在发酵产氢中的应用，所述固定化凝胶珠按一定接种量(0.1g菌体/100mL培养基，按菌体量计)接种至稻草水解液发酵培养基中，定期检测氢气体积、葡萄糖和木糖浓度及产氢细菌活细胞数，共发酵120h；所述稻草水解液发酵培养基配方为：稻草水解液1000mL，牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，KH2PO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，糖浓度50g/L，pH 8.0。
本发明获得的有益效果：
1)本发明采用原桃胶为原材料合成纳米磁铁矿并作为主要固定化载体用于细菌发酵产氢***，原材料产量高、成本低廉，操作步骤简单，反应条件温和、易于控制、安全环保。
2)本发明所制得的以原桃胶作为主要固定化载体耦合绿色合成纳米磁铁矿添加的固定化凝胶珠，成形方便、稳定性好、固定化效率高、产氢细菌菌剂活性强、细菌存活率高、产氢效率高。
3)本发明所制得的固定化凝胶珠接种于产氢细菌发酵产氢***，具有显著的促进生物氢合成和稻草水解液中还原糖利用的效果，使得最佳固定化条件下获得的累积产氢量、葡萄糖利用率、木糖利用率较之对照处理分别显著提高。
附图说明
图1为本发明原桃胶合成纳米磁铁矿的表征结果图(a：XRD；b：FTIR；c：SEM；d：TEM)。
图2为本发明固定化凝胶珠的扫描电子显微镜(SEM)图。
图3为本发明单一添加纳米磁铁矿的累积产氢量曲线。
图4为本发明单一添加纳米磁铁矿的葡萄糖和木糖利用结果。
图5为本发明固定化耦合添加纳米磁铁矿的累积产氢量曲线。
图6为本发明固定化耦合添加纳米磁铁矿的葡萄糖和木糖利用结果。
图7为本发明固定化耦合添加纳米磁铁矿的活细胞数量监测结果(Im：固定化；NP：纳米颗粒)。
图8为本发明固定化耦合纳米磁铁矿添加***沟肠杆菌的累积产氢量曲线。
图9为本发明固定化耦合纳米磁铁矿添加下hycG-pET-28a-Klebsiella sp.(RT-H)工程菌的累积产氢量曲线。
具体实施方式
下面通过对实施例的描述，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1：原桃胶绿色合成纳米磁铁矿的制备：
称取1g桃胶粉加入100mL蒸馏水中，置于80℃水浴锅中恒温处理8h，使桃胶粉全部溶胀，形成桃胶液；进一步调节pH值为10～11，置于恒温磁力搅拌器上，85℃加热搅拌3h后，再降温至50℃，向桃胶溶液中加入一定体积的0.5mol/L Fe3+及0.75mol/L Fe2+溶液，使混合液中Fe3+：Fe2+＝2：1，置于恒温磁力搅拌器上，于60℃下连续搅拌4h。所述Fe3+盐为三氯化铁；所述Fe2+盐为硫酸亚铁。反应液冷却至室温，边搅拌边缓慢加入新配制的2mol/L NaOH溶液至沉淀全部转变为黑色，再于80℃连续搅拌反应1h。反应完成后，将反应液静置、冷却，用永磁体对获得的纳米颗粒进行分离，用无水乙醇和蒸馏水分别洗涤3次，离心，收集沉淀置于70℃恒温干燥箱中烘干至恒重；烘干物取出、研磨、过200目筛，即得原桃胶绿色合成的纳米磁铁矿。纳米磁铁矿表征结果如附图1所示，获得的纳米磁铁矿在2θ＝30.2，35.5，43.2,57.3和62.8处的衍射峰对应晶面(220)、(311)、(400)、(511)和(440)，与标准卡片JCPDSNO.19-0629相符合，为尖晶石结构(附图1(a))。样品中衍射峰较尖锐，且没有其它衍射峰，表明其较纯净。FTIR图(附图1(b))显示，637和472cm-1的峰表明Fe-O键的形成，证实了纳米磁铁矿的形成，而3408和1626cm-1的峰则表明OH的存在，可能为纳米磁铁矿表明的水残基；由SEM图(附图1(c))可知，纳米颗粒表面形貌较一致，形态较规则；TEM图(附图1(d))显示纳米颗粒呈球形结构，平均粒径约为22nm。
实施例2：原桃胶固定化凝胶珠的制备：
从桃树采集的原桃胶，除去树皮等杂物后风干，再采用中药粉碎机粉碎成桃胶粉备用。称取4g桃胶粉加入100mL蒸馏水中，置于80℃水浴锅中恒温处理8h，使桃胶粉全部溶胀，形成桃胶液；获得的桃胶液适当冷却后，加入2g海藻酸钠，充分混匀后，置于高压蒸汽灭菌器中121℃灭菌20min。同时挑取活化的产氢克雷伯氏菌单菌落于液体培养基(配方：D-木糖10g，葡萄糖10g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，KH2PO4 0.5g，MgSO4·7H2O 1g，pH7.5，水1000mL)中过夜培养，进一步低速离心(4000r/min离心10min)，弃上清液、收集菌体，用生理盐水洗涤2～3次，弃上清、收集菌体，用于固定化凝胶珠制备。生长至对数期的产氢克雷伯氏菌菌体细胞，按照0.5g菌体/10mL原桃胶/海藻酸钠溶液比例添加至原桃胶/海藻酸钠溶液中，混匀，将121℃灭菌20min的原桃胶绿色合成纳米磁铁矿按照0、10、20、30、40、50mg/L浓度添加至上述溶液中，充分混匀，用灭菌医用注射器匀速滴入无菌的10g/L氯化钙溶液中，待凝胶珠成形后钙化1～2h，弃去多余的氯化钙溶液，再用灭菌的生理盐水洗涤2～3次，洗涤好的固定化凝胶珠用于后续发酵产氢试验。获得的固定化凝胶珠切片后，用扫描电子显微镜(SEM)观察，发现固定化凝胶珠形成了1.0～2.0μm孔径(平均1.56μm)的网状结构，有利于产氢细菌包埋其中，如附图2所示，本实施例为杆状的克雷伯氏菌。
实施例3：绿色合成纳米磁铁矿调控克雷伯氏菌发酵稻草水解液产氢及还原糖利用：
原桃胶绿色合成的纳米磁铁矿按照浓度0、10、20、30、40、50mg/L添加至稻草水解液发酵产氢***，其中，0mg/L处理为对照处理(CK)。按不同的处理精确称量纳米磁铁矿，添加至发酵培养基(配方：稻草水解液1000mL，牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，KH2PO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，糖浓度50g/L，pH 8.0)中，采用充分搅拌结合超声波处理的方式使纳米颗粒有效地分散于发酵培养基中，灭菌冷却之后，按照10％接种量接种克雷伯氏菌种子液，定期采用排氢氧化钠溶液法检测产氢量，逐日累积，检测120h内的累积产氢量，同时监测葡萄糖和木糖的浓度变化，换算还原糖利用率，结果见附图3和附图4。从附图3可看出，当纳米磁铁矿添加浓度为20mg/L时，菌株在全发酵周期内的累积产氢量均显著高于对照处理(0mg/L)的，至120h，其累积产氢量可达4470.8±97.1mL/L，较对照组(0mg/L)处理的提高约20％，即该添加浓度处理能在一定程度上促进菌株生物氢的合成。而葡萄糖和木糖利用率亦分别提高11.9％、6.1％(附图4)。
实施例4：固定化耦合纳米磁铁矿添加调控克雷伯氏菌发酵稻草水解液产氢及还原糖利用：
实施例2制备的固定化凝胶珠接种至稻草水解液发酵产氢***(发酵产氢***同实施例3)，选取未添加纳米颗粒未固定化的处理为对照处理(CK)。定期采用排氢氧化钠溶液法检测产氢量，逐日累积，检测120h内的累积产氢量，同时监测葡萄糖和木糖的浓度变化，换算还原糖利用率，结果见附图5和附图6。从附图5可看出，固定化前提下，原桃胶绿色合成纳米磁铁矿除添加浓度为50mg/L外，其余添加浓度下的累积产氢量均高于对照处理(CK)的，尤以纳米磁铁矿添加浓度为10mg/L时，菌株发酵120h的累积产氢量可达5898.4±121.5mL/L，较对照组(CK)处理的提高约60％，即该处理能够显著促进菌株生物氢的合成，而该条件下葡萄糖和木糖利用率亦分别提高14.3％、7.4％(附图6)。本实施例亦表明，固定化是有效的促产氢措施，而固定化前提下，添加的纳米磁铁矿仅需较低的浓度(10mg/L)即可达到显著的促产氢效应，较之单一添加纳米磁铁矿最佳浓度(20mg/L，实施例3)下的促产氢潜力更高。至120h发酵结束时，稻草水解液发酵培养基中的葡萄糖和木糖几乎消化殆尽，葡萄糖和木糖利用率分别高达96.1％和96.9％。
实施例5：固定化耦合纳米磁铁矿添加可提高发酵过程中克雷伯氏菌的存活率：
选取未添加纳米颗粒未固定化的处理为对照处理(CK)，同时选取实施例3中纳米磁铁矿最佳添加浓度(20mg/L)处理为对比处理，选取实施例4中最佳处理(固定化+10mg/L纳米颗粒)和仅固定化处理(Im+0mg/L NP)，按照同实施例4的固定化凝胶珠接种方式接种稻草水解液发酵产氢***。监测全发酵过程中的细菌活细胞数量变化，结果如附图7所示。从附图7可看出，Im+10mg/L处理的活细胞数在全发酵周期内的累积产氢量均显著高于对照处理(CK)的，即使至发酵中后期(72～96)，活细胞数显著下降，但仍能维持在高于初始(0h)接种活细胞数的水平之上。而CK、20mg/L NP处理，自发酵96h起，活细胞数量已低于初始活细胞数，Im+0mg/L NP处理的在120h低于初始活细胞数。由此看来，固定化处理有利于保持产氢细菌细胞的活力，使其在厌氧发酵条件下亦可维持较高的活细胞数量水平，尤以添加适宜浓度(10mg/L)纳米颗粒的处理效果最佳。
实施例6(对比试验例)：固定化耦合纳米磁铁矿添加亦可促进阴沟肠杆菌发酵产氢：
采用与实施例2相同的方法制备固定化凝胶珠，选取与实施例5相同的处理方式，检测固定化耦合纳米磁铁矿添加对另一类产氢细菌——阴沟肠杆菌发酵产氢过程的调控作用，结果见附图8，结果显示，固定化耦合纳米磁铁矿添加亦可促进阴沟肠杆菌发酵产氢，仍以Im+10mg/L处理的累积产氢量最高，其发酵120h的累积产氢量较对照处理(CK)的提高约40％。本实施例中的产氢阴沟肠杆菌见报道于文献《分段调控pH值对阴沟肠杆菌WL1318发酵棉秆水解糖液产氢的影响》(屈晓伟等,2018)。
实施例7(对比试验例)：固定化耦合纳米磁铁矿添加亦可促进产氢工程菌的生物氢合成：
采用与实施例2相同的方法制备固定化凝胶珠，选取与实施例5相同的处理方式，检测固定化耦合纳米磁铁矿添加对一株产氢工程菌——hycG-pET-28a-Klebsiella sp.(RT-H)发酵产氢过程的调控作用，结果见附图8，从图中累积产氢量曲线变化可看出，固定化耦合纳米磁铁矿添加亦可促进产氢工程菌的生物氢合成，仍以Im+10mg/L处理的累积产氢量最高，其发酵120h的累积产氢量较对照处理(CK)的提高约52％。本实施例中的产氢工程菌hycG-pET-28a-Klebsiella sp.(RT-H)见报道于文献《Klebsiella sp.发酵木质纤维素水解液合成生物氢的代谢途径优化》(尤少林,2020)。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。
Claims (7)
1.一种提高产氢细菌生物氢合成的固定化方法，其特征在于，具体步骤如下：
(A)称取桃胶粉加入蒸馏水中，置于80℃水浴锅中恒温处理8h，使桃胶粉全部溶胀，形成桃胶液；获得的桃胶液适当冷却后，加入海藻酸钠，充分混匀后，灭菌得原桃胶/海藻酸钠溶液；
(B)取生长至对数期的产氢细菌，按照0.5g菌体/10mL原桃胶/海藻酸钠溶液比例添加至原桃胶/海藻酸钠溶液中，混匀，再添加一定浓度无菌的绿色合成纳米磁铁矿，用灭菌医用注射器匀速滴入无菌氯化钙溶液中，待凝胶珠成形后钙化1～2h，弃去多余的氯化钙溶液，再用灭菌的生理盐水洗涤，即得固定化凝胶珠。
2.根据权利要求1中所述的一种提高产氢细菌生物氢合成的固定化方法，其特征在于：所述产氢细菌为阴沟肠杆菌、产氢克雷伯氏菌、产氢克雷伯氏菌工程菌中的一种或多种。
3.根据权利要求2中所述的一种提高产氢细菌生物氢合成的固定化方法，其特征在于：所述生长至对数期的产氢克雷伯氏菌菌体细胞的制备方法为：挑取活化的产氢克雷伯氏菌单菌落于液体培养基中过夜培养，进一步低速离心，弃上清液、收集菌体，用生理盐水洗涤2～3次，弃上清、收集菌体，用于固定化凝胶珠制备；所述液体培养基配方为：D-木糖10g，葡萄糖10g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，KH2PO4 0.5g，MgSO4·7H2O 1g，pH7.5，水1000mL。
4.根据权利要求1中所述的一种提高产氢细菌生物氢合成的固定化方法，其特征在于：所述的无菌的绿色合成纳米磁铁矿为原桃胶合成的纳米磁铁矿于121℃灭菌20min制得；所述的无菌氯化钙溶液为10g/L的氯化钙水溶液于121℃灭菌20min制得。
5.根据权利要求4中所述的一种提高产氢细菌生物氢合成的固定化方法，其特征在于，所述原桃胶合成的纳米磁铁矿按如下方法制备：
(1)称取桃胶粉加入蒸馏水中，置于80℃水浴锅中恒温处理8h，使桃胶粉全部溶胀，形成桃胶液；进一步调节pH值为10～11，置于恒温磁力搅拌器上，85℃加热搅拌3h后，再降温至50℃，向桃胶溶液中加入一定体积的0.5mol/L Fe3+及0.75mol/L Fe2+溶液，使混合液中Fe3+：Fe2+＝2：1，置于恒温磁力搅拌器上，于60℃下连续搅拌4h；
(2)上述反应液冷却至室温，边搅拌边缓慢加入新配制的2mol/L NaOH溶液至沉淀全部转变为黑色，再于80℃连续搅拌反应1h；
(3)反应完成后，将步骤(2)的反应液静置、冷却，用永磁体对获得的纳米颗粒进行分离，用无水乙醇和蒸馏水分别洗涤3次，离心，收集沉淀置于70℃恒温干燥箱中烘干至恒重；烘干物取出、研磨、过200目筛，即得桃胶绿色合成的纳米磁铁矿。
6.根据权利要求5中所述的一种提高产氢细菌生物氢合成的固定化方法，其特征在于，所述Fe3+盐为三氯化铁；所述Fe2+盐为硫酸亚铁。
7.一种如权利要求1～6中任一项所述固定化凝胶珠在发酵产氢中的应用，其特征在于：所述固定化凝胶珠按一定接种量接种至稻草水解液发酵培养基中，定期检测氢气体积、葡萄糖和木糖浓度及产氢细菌活细胞数，共发酵120h；所述稻草水解液发酵培养基配方为：稻草水解液1000mL，牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，KH2PO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，糖浓度50g/L，pH 8.0。
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