CN117752633B - 一种高生物活性的益生菌微胶囊制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高生物活性的益生菌微胶囊制剂，属于益生菌微胶囊技术领域。所述益生菌微胶囊制剂的制备方法包括以下步骤：羧甲基壳聚糖溶液与柠檬酸溶液混合后形成纳米颗粒分散液，所述纳米颗粒分散液与所述益生菌的菌悬液混合，得到混合液A，混合液A再与含有壳聚糖和甘露醇的混合液B混合后，经油相基质包裹制备成益生菌微胶囊悬浮液，所述益生菌微胶囊悬浮液经喷雾干燥后，获得所述益生菌微胶囊制剂。本发明在制备益生菌微胶囊时添加了甘露醇和柠檬酸，既缓解了喷雾干燥时高温胁迫、氧化胁迫以及脱水胁迫导致的菌体活菌数和发酵活力下降的情况，又有效延长了产品货架期，同时又具有良好的抗逆缓释效果，适合工业化推广应用。

Description

一种高生物活性的益生菌微胶囊制剂

技术领域

本发明涉及益生菌微胶囊技术领域，特别是涉及一种高生物活性的益生菌微胶囊制剂。

背景技术

益生菌主要是指乳酸菌，是能产乳酸的一大类细菌的总称，乳酸菌通过粘附定植在宿主肠道，分泌乳酸等有机酸，拮抗竞争有害菌发挥功效。乳酸菌是活的微生物，不耐热，在加工储藏过程中应避免高温，减少损失，乳酸菌的生产工艺中多采用冷冻干燥的方式，冷冻干燥设备昂贵，处理量较小，过程历时久，耗费大量能源，周期长也易造成一定活菌损耗。

在现有益生菌产品中，有的是通过采用先制备微胶囊，再将微胶囊进行喷雾干燥的方式来制备含有益生菌的微胶囊制剂。喷雾干燥技术生产效率高且成本较低，但与真空冷冻干燥相比，喷雾干燥需要在较高温度下进行，其对益生菌造成的损伤较严重，主要表现为高温胁迫、氧化胁迫以及脱水胁迫导致的益生菌活菌数和发酵活力下降，及其在后期贮藏过程中菌体细胞稳定性较差等问题。

近年来，为确保益生菌产品的健康益处，研究学者提出多种方法来提升喷雾干燥益生菌的活性，主要有：加强对细胞结构的保护、提升益生菌自身对不利环境因素的抗性；优化喷雾干燥条件；采用保护性载体等。但上述方法大多不能同时兼顾喷雾干燥对菌体造成的损伤与后期贮藏稳定性的问题，并且对体内胃液酸性环境的抗逆缓释效果也有待提高。

因此，对喷雾干燥获得的益生菌制剂进行深入研究，以获得一种生物活性高、产品性质稳定并且具有良好的抗逆缓释效果，适合工业化生产的益生菌微胶囊制剂，是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种高生物活性的益生菌微胶囊制剂，以解决上述现有技术存在的问题，本发明在制备益生菌微胶囊时添加了甘露醇和柠檬酸，既缓解了喷雾干燥时高温胁迫、氧化胁迫以及脱水胁迫导致的菌体活菌数和发酵活力下降的情况，又有效延长了产品货架期，同时又具有良好的抗逆缓释效果。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种高生物活性的益生菌微胶囊制剂，制备方法包括以下步骤：

羧甲基壳聚糖溶液与柠檬酸溶液混合后形成纳米颗粒分散液，所述纳米颗粒分散液与所述益生菌的菌悬液混合，得到混合液A，混合液A再与含有壳聚糖和甘露醇的混合液B混合后，经油相基质包裹制备成益生菌微胶囊悬浮液，所述益生菌微胶囊悬浮液经喷雾干燥后，获得所述益生菌微胶囊制剂。

进一步地，所述羧甲基壳聚糖溶液与所述柠檬酸溶液按体积比(1-2)：5混合。

进一步地，在所述混合液A中，纳米颗粒分散液与益生菌的菌悬液体积比为5：(2-3)。

进一步地，所述混合液A与所述混合液B按体积比(1-2)：(3-5)混合。

进一步地，所述混合液B中，壳聚糖的浓度为50-80g/L，甘露醇的浓度为10-12g/L。

本发明还提供一种益生菌微胶囊制剂的制备方法，包括以下步骤：

羧甲基壳聚糖溶液与柠檬酸溶液混合后形成纳米颗粒分散液，所述纳米颗粒分散液与所述益生菌的菌悬液混合，得到混合液A，混合液A再与含有壳聚糖和甘露醇的混合液B混合后，经油相基质包裹制备成益生菌微胶囊悬浮液，所述益生菌微胶囊悬浮液经喷雾干燥后，获得所述益生菌微胶囊制剂。

进一步地，所述羧甲基壳聚糖溶液与所述柠檬酸溶液按体积比(1-2)：5混合。

进一步地，在所述混合液A中，纳米颗粒分散液与益生菌的菌悬液体积比为5：(2-3)。

进一步地，所述混合液A与所述混合液B按体积比(1-2)：(3-5)混合。

进一步地，所述混合液B中，壳聚糖的浓度为50-80g/L，甘露醇的浓度为10-12g/L。

本发明公开了以下技术效果：

本发明在制备益生菌微胶囊时添加了甘露醇和柠檬酸，甘露醇作为填充剂，具有调节渗透压的功能，同时能够防止在高温喷雾干燥时有效成分随水蒸气一起挥发，缓解了喷雾干燥时高温胁迫、氧化胁迫以及脱水胁迫导致的菌体活菌数和发酵活力下降的情况；甘露醇与柠檬酸联用，一方面提高了菌体经喷雾干燥后的存活率，另一方面充分发挥了柠檬酸的抗氧化作用，使益生菌产品更加稳定，有效延长了产品货架期。

本发明首先使羧甲基壳聚糖乙醇溶液与柠檬酸溶液混合后形成纳米颗粒分散液，使其能够更好地附着在菌体表面；壳聚糖作为天然的阳离子高分子多糖可与带有负电荷的羧甲基壳聚糖通过分子间氢键、静电作用形成一层组装膜，更好的保护菌体的稳定性，使益生菌产品对人工胃液具有更好的抗逆性。

本发明提供的益生菌微胶囊制剂生物活性高、产品性质稳定并且具有良好的抗逆缓释效果，适合工业化推广应用。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明选择的植物乳杆菌为植物乳杆菌CQPC02，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.14491，公开在专利文献CN110699271B中；嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌LA-10A，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019012，公开在专利文献CN111118106B中；鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌NJ551，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016157，公开在专利文献CN112029676B中。

本发明实施例中用到的材料与试剂：

壳聚糖，脱乙酰度90％(CAS NO：9012-76-4，货号：C916461)；低聚果糖(CAS NO：308066-66-2，货号：F861451)；菊糖(CAS NO：9005-80-5，货号：I793399)；羧甲基壳聚糖，分子量240Kda，脱乙酰度大于90％，取代度90％(CAS NO：83512-85-0，货号：C914893)；柠檬酸，≥99.5％(T)(CAS NO：77-92-9，货号：C805019)；甘露醇，AR，98％(CAS NO：69-65-8，货号：M813423)，以上材料均购自上海麦克林生化科技股份有限公司。

实施例1

一种高生物活性的益生菌微胶囊制剂，制备方法如下：

(1)制备菌悬液

将植物乳杆菌CQPC02经MRS固体斜面培养基传代活化恢复活力后，接入灭菌后的MRS液体培养基中，置于37℃恒温培养箱培养12h，以此作为植物乳杆菌CQPC02的种子液。以4％(v/v)的量再次接种入灭菌后MRS液体培养基中，37℃恒温培养箱培养，使植物乳杆菌CQPC02处于对数生长期后期，然后分装于50mL无菌离心管中，置于高速冷冻离心机(10000r/min)，4℃离心10min，弃去上清液，将菌泥称重后按照1：1的比例加入灭菌生理盐水(0.9％的浓度)，快速混合均匀后，调节pH至6.5，制成植物乳杆菌CQPC02的菌悬液(2.97×10¹⁰cfu/g)。

(2)制备微胶囊

分别配制20g/L柠檬酸溶液和10g/L的羧甲基壳聚糖溶液，将柠檬酸溶液以1:5的体积比例加入羧甲基壳聚糖溶液中，通过自下而上反溶剂沉淀法形成纳米颗粒分散液；

将纳米颗粒分散液与步骤(1)制备的菌悬液按照体积比5:2混合，得到混合液A；

配制酪蛋白酸钠90g/L、壳聚糖60g/L和甘露醇10g/L的混合液B，将混合液A以1:3的体积比加入混合液B中，得到混合液C；

在混合液C中添加3倍体积的大豆油，500rpm搅拌15min，调节pH至4.6，再加入等量生理盐水，搅拌均匀，冷却后离心，收集沉淀；将沉淀用生理盐水重悬后，得到益生菌微胶囊悬浮液。经喷雾干燥后制成成品。

实施例2

一种高生物活性的益生菌微胶囊制剂，制备方法如下：

(1)制备菌悬液

将嗜酸乳杆菌LA-10A经MRS固体斜面培养基传代活化恢复活力后，接入灭菌后的MRS液体培养基中，置于37℃恒温培养箱培养12h，以此作为嗜酸乳杆菌LA-10A的种子液。以4％(v/v)的量再次接种入灭菌后MRS液体培养基中，37℃恒温培养箱培养，使嗜酸乳杆菌LA-10A处于对数生长期后期，然后分装于50mL无菌离心管中，置于高速冷冻离心机(10000r/min)，4℃离心10min，弃去上清液，将菌泥称重后按照1：1的比例加入灭菌生理盐水(0.9％的浓度)，快速混合均匀后，调节pH至6.5，制成嗜酸乳杆菌LA-10A的菌悬液(2.97×10¹⁰cfu/g)。

(2)制备微胶囊

分别配制15g/L柠檬酸溶液和12g/L的羧甲基壳聚糖溶液，将柠檬酸溶液以2:5的体积比例加入羧甲基壳聚糖溶液中，通过自下而上反溶剂沉淀法形成纳米颗粒分散液；

将纳米颗粒分散液与步骤(1)制备的菌悬液按照体积比5:3混合，得到混合液A；

配制酪蛋白酸钠100g/L、壳聚糖50g/L和甘露醇12g/L的混合液B，将混合液A以1:4的体积比加入混合液B中，得到混合液C；

在混合液C中添加3倍体积的大豆油，500rpm搅拌15min，调节pH至4.6，再加入等量生理盐水，搅拌均匀，冷却后离心，收集沉淀；将沉淀用生理盐水重悬后，得到益生菌微胶囊悬浮液。经喷雾干燥后制成成品。

实施例3

一种高生物活性的益生菌微胶囊制剂，制备方法如下：

(1)制备菌悬液

将鼠李糖乳杆菌NJ551经MRS固体斜面培养基传代活化恢复活力后，接入灭菌后的MRS液体培养基中，置于37℃恒温培养箱培养12h，以此作为鼠李糖乳杆菌NJ551的种子液。以4％(v/v)的量再次接种入灭菌后MRS液体培养基中，37℃恒温培养箱培养，使鼠李糖乳杆菌NJ551处于对数生长期后期，然后分装于50mL无菌离心管中，置于高速冷冻离心机(10000r/min)，4℃离心10min，弃去上清液，将菌泥称重后按照1：1的比例加入灭菌生理盐水(0.9％的浓度)，快速混合均匀后，调节pH至6.5，制成鼠李糖乳杆菌NJ551的菌悬液(2.97×10¹⁰cfu/g)。

(2)制备微胶囊

分别配制25g/L柠檬酸溶液和11g/L的羧甲基壳聚糖溶液，将柠檬酸溶液以1.5:5的体积比例加入羧甲基壳聚糖溶液中，通过自下而上反溶剂沉淀法形成纳米颗粒分散液；

将纳米颗粒分散液与步骤(1)制备的菌悬液按照体积比5:2.5混合，得到混合液A；

配制酪蛋白酸钠95g/L、壳聚糖80g/L和甘露醇11g/L的混合液B，将混合液A以2:5的体积比加入混合液B中，得到混合液C；

在混合液C中添加3倍体积的大豆油，500rpm搅拌15min，调节pH至4.6，再加入等量生理盐水，搅拌均匀，冷却后离心，收集沉淀；将沉淀用生理盐水重悬后，得到益生菌微胶囊悬浮液。经喷雾干燥后制成成品。

对比例1

与实施例1相同，区别仅在于，在步骤(2)中，省略混合液B中的甘露醇。

对比例2

与实施例1相同，区别仅在于，在步骤(2)中，将混合液B中的甘露醇替换为等量的羟甲基纤维素钠。

对比例3

(1)制备菌悬液

与实施例1相同。

(2)制备微胶囊

配制10g/L的羧甲基壳聚糖溶液，将羧甲基壳聚糖溶液与步骤(1)制备的菌悬液按照体积比5:2混合，得到混合液A；

配制酪蛋白酸钠90g/L、壳聚糖60g/L和甘露醇10g/L的混合液B，将混合液A以1:3的体积比加入混合液B中，得到混合液C；

在混合液C中添加3倍体积的大豆油，500rpm搅拌15min，调节pH至4.6，再加入等量生理盐水，搅拌均匀，冷却后离心，收集沉淀；将沉淀用生理盐水重悬后，得到益生菌微胶囊悬浮液。经喷雾干燥后制成成品。

对比例4

(1)制备菌悬液

与实施例1相同。

(2)制备微胶囊

分别配制20g/L柠檬酸溶液、10g/L的羧甲基壳聚糖溶液，以及酪蛋白酸钠90g/L、壳聚糖60g/L和甘露醇10g/L的混合液B，直接将柠檬酸溶液、羧甲基壳聚糖溶液、步骤(1)制备的菌悬液以及混合液B按照体积比1:5:2.4:25混合，得到混合液C在混合液C中添加3倍体积的大豆油，500rpm搅拌15min，调节pH至4.6，再加入等量生理盐水，搅拌均匀，冷却后离心，收集沉淀；将沉淀用生理盐水重悬后，得到益生菌微胶囊悬浮液。经喷雾干燥后制成成品。

效果验证

1.参照国家标准GB 4789.35-2016乳酸菌检测方法，分别测定实施例1-3、对比例1-4的益生菌干燥前和干燥后的菌落总数。存活率计算公式为：

存活率(％)＝(干燥后活菌浓度/干燥前活菌浓度)×100％。

结果如表1所示。

表1各组益生菌在喷雾干燥前后的活菌数及存活率

从表1中可以看出，实施例1-3经过喷雾干燥制备的益生菌产品，相比于对比例1-4均取得更高的菌体干燥后存活率，并且效果显著。

2.分别将实施例1-3、对比例1-4的益生菌产品在常温下存放1个月、3个月、6个月，测定各个时期的活菌数，结果如表2所示。

表2各组益生菌产品在常温保存的稳定性

从表2的结果中可以看出，实施例1-3制备的益生菌产品在常温下存放的稳定性显著高于对比例1-4，在常温存放6个月后仍能保证70％以上的菌体存活率，可有效延长菌体产品货架期，利于益生菌产品的推广应用。

3.为验证本发明实施例制备的益生菌产品的抗逆性，配置人工胃液，对益生菌产品在体外模拟环境中的消化数据进行检测。

人工胃液配置：

称取胃蛋白酶10g、质量分数为10％的盐酸16.4mL、氯化钠粉末2g加入至1L纯净水中，混合均匀后，等量分成4份，并使用1mol/L的盐酸将4份溶液滴定至pH分别为1.5，2.5，3.5，4.5，过0.22μm滤膜后，即完成配置。

取1g本发明实施例1-3以及对照例1-4制得的益生菌产品，其分散于9mL的人工胃液中，于37℃恒温贮藏，分别于0、1和2h后取出1管，用0.9％生理盐水冲洗，加入配制好的崩解液(柠檬酸三钠)中进行崩解，并加玻璃珠摇床振摇30min，其中崩解液的体积为9mL，崩解完成后从中移取1mL进行梯度稀释，采用MRS琼脂培养基进行活菌计数。结果如表3所示。

表3各组益生菌产品经人工胃液测试后的活菌存活情况

由表3可以看出，经人工胃液消化后，实施例1-3的益生菌产品存活率与对比例1-2相比，有所提高，与对比例3-4相比明显提高，说明实施例1-3的益生菌产品对人工胃液具有较好的抗逆性，经人工胃液消化后，仍具有较好的生物活性。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种高生物活性的益生菌微胶囊制剂，其特征在于，制备方法包括以下步骤：

羧甲基壳聚糖溶液与柠檬酸溶液混合后形成纳米颗粒分散液，所述纳米颗粒分散液与所述益生菌的菌悬液混合，得到混合液A，混合液A再与含有壳聚糖、甘露醇和酪蛋白酸钠的混合液B混合后，经油相基质包裹制备成益生菌微胶囊悬浮液，所述益生菌微胶囊悬浮液经喷雾干燥后，获得所述益生菌微胶囊制剂。

2.根据权利要求1所述的益生菌微胶囊制剂，其特征在于，所述羧甲基壳聚糖溶液与所述柠檬酸溶液按体积比(1-2)：5混合。

3.根据权利要求1所述的益生菌微胶囊制剂，其特征在于，在所述混合液A中，纳米颗粒分散液与益生菌的菌悬液体积比为5：(2-3)。

4.根据权利要求1所述的益生菌微胶囊制剂，其特征在于，所述混合液A与所述混合液B按体积比(1-2)：(3-5)混合。

5.根据权利要求1所述的益生菌微胶囊制剂，其特征在于，所述混合液B中，壳聚糖的浓度为50-80g/L，甘露醇的浓度为10-12g/L。

6.一种益生菌微胶囊制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

羧甲基壳聚糖溶液与柠檬酸溶液混合后形成纳米颗粒分散液，所述纳米颗粒分散液与所述益生菌的菌悬液混合，得到混合液A，混合液A再与含有壳聚糖、甘露醇和酪蛋白酸钠的混合液B混合后，经油相基质包裹制备成益生菌微胶囊悬浮液，所述益生菌微胶囊悬浮液经喷雾干燥后，获得所述益生菌微胶囊制剂。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述羧甲基壳聚糖溶液与所述柠檬酸溶液按体积比(1-2)：5混合。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在所述混合液A中，纳米颗粒分散液与益生菌的菌悬液体积比为5：(2-3)。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述混合液A与所述混合液B按体积比(1-2)：(3-5)混合。

10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述混合液B中，壳聚糖的浓度为50-80g/L，甘露醇的浓度为10-12g/L。