CN114410511A - 一种抑制烟草黑胫病的菌粉、制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制烟草黑胫病的菌粉、制备方法和应用，涉及微生物菌剂技术领域，解决了现有技术中采用化学药剂防治黑胫病，存在病原菌的抗药性逐年增加、农药残留和环境污染的技术问题。本发明抑制烟草黑胫病的菌粉的制备方法，包括如下步骤：以巨大芽孢杆菌CRP‑4为菌种，将菌种进行活化；将巨大芽孢杆菌CRP‑4菌种进行培养，得种子液；将巨大芽孢杆菌CRP‑4种子液进行培养，得发酵液；将巨大芽孢杆菌CRP‑4发酵液进行离心，得离心菌体；将巨大芽孢杆菌CRP‑4的离心菌体进行喷雾干燥，制得巨大芽孢杆菌CRP‑4菌粉。本发明制得的的巨大芽孢杆菌CRP‑4菌粉，对烟草黑胫病病原菌有明显抑制作用，为开发相关生物制剂及大田推广应用奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及微生物菌剂技术领域，尤其涉及一种抑制烟草黑胫病的菌粉、制备方法和应用。
背景技术
微生物菌剂是一类能共生的、有互补作用的、人工培植的、可制成水剂、粉剂或固体剂的活性物质。微生物菌剂含有大量有益活菌物质及多种天然发酵活性物质，能够在根区土壤繁殖形成有利于作物生长的微生物优势菌群，调节根际环境，协助作物吸收营养，改善和恢复土壤微生态平衡。
根茎类病害已成为烤烟的主要病害之一，其中以黑胫病、青枯病危害最为严重，且呈蔓延趋势。据记载，青枯病危害区域，轻则造成烟株大面积萎蔫，防治难度大，烟农防治成本增加；重灾田块，发病率高达30％～50％，导致烟株整株枯死，重则绝收，严重影响烟叶产量和质量，打击烟农种烟的积极性。
目前烟草种植过程中，对黑胫病和青枯病的防治方法主要有：种植抗(耐)病烤烟品种、清洁田园及轮作为主的农业防治措施，化学药剂防治等综合防治措施。但实际生产中尚无合适的抗(耐)优良品种；由于耕地有限，有些烟地不得不连作。因此，生产上大多采用化学药剂防治控制病害。目前药剂防治由于可供选择药剂品种少，主用药剂的使用年限长，病原菌的抗药性逐年增加，农药残留及环境污染等负面效应也逐步增加。因此，生物防治近年来已发展成为烟草病害防治研究的热点领域。
发明内容
本发明的目的是提出一种抑制烟草黑胫病的菌粉、制备方法和应用，解决了现有技术中在烟草种植过程中，采用化学药剂防治黑胫病，存在病原菌的抗药性逐年增加、农药残留和环境污染的技术问题。本发明优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明抑制烟草黑胫病的菌粉的制备方法，包括如下步骤：
以巨大芽孢杆菌CRP-4为菌种，将菌种进行活化；
将巨大芽孢杆菌CRP-4菌种进行培养，得巨大芽孢杆菌CRP-4种子液；
将巨大芽孢杆菌CRP-4种子液进行培养，得巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液；
将巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液进行离心，得巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体；
将巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体进行喷雾干燥，制得巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉，巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉即为抑制烟草黑胫病的菌粉。
本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，其编号为CRP-4，保藏登记号为CGMCC No.18458，保藏日期2019年09月02日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的巨大芽孢杆菌编号为CRP-4是从云南省微生物发酵工程研究中心有限公司温室大棚内分离出的菌株。从16SrDNA序列相似性比对分析结果和***发育树可知，CRP-4与巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)亲缘关系最近，同源性最高，相似度均达99％，根据***发育树相似性和同源性分析，菌株CRP-4和Bacillus megaterium位于同一分支，两者进化关系和距离最近，相似度达100％，结合形态特征、培养特征和生理生化特征，鉴定此菌株为巨大芽胞杆菌。
根据一个优选实施方式，以巨大芽孢杆菌CRP-4为菌种，将菌种进行活化包括如下步骤：将﹣80℃下保存的巨大芽孢杆菌CRP-4在LB固体培养基上活化12h～16h，挑取单菌落接种到LB固体培养基上，在35℃培养1天-2天，得活化的巨大芽孢杆菌CRP-4。
根据一个优选实施方式，将巨大芽孢杆菌CRP-4菌种进行培养，得巨大芽孢杆菌CRP-4种子液包括如下步骤：用无菌接种环刮取一环活化的巨大芽孢杆菌CRP-4接种到50mlLB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm条件下培养24h，得巨大芽孢杆菌CRP-4种子液。
根据一个优选实施方式，将巨大芽孢杆菌CRP-4种子液进行培养，得巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液包括如下步骤：按照菌种、培养液体积比为1∶120的比例将巨大芽孢杆菌CRP-4种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为37℃，转速为120rpm/min条件下培养18h-24h，得巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液。
根据一个优选实施方式，将巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液进行离心，得巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体包括如下步骤：将巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液经设备倒料进入离心机，在离心机转速为4000rpm/min条件下制备巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体。
根据一个优选实施方式，将巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体进行喷雾干燥，制得巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉包括如下步骤：在巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体中添加保护剂，再将添加保护剂的巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体转入喷雾干燥设备得巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉。
根据一个优选实施方式，保护剂包括如下重量份的组分：2％-5％的硅藻土、1％-3％的麦芽糊精、5％-10％的碳酸钙，余量为水。
根据一个优选实施方式，喷雾干燥条件为：进风口温度120℃-160℃，出风口温度40℃-60℃，进料速度为15ml/min-20ml/min。
本发明抑制烟草黑胫病的菌粉，是采用本发明中任一项技术方案所述的抑制烟草黑胫病的菌粉的制备方法制得的。
本发明的抑制烟草黑胫病的菌粉，可用在烟草种植中。
本发明提供的抑制烟草黑胫病的菌粉、制备方法和应用至少具有如下有益技术效果：
本发明以巨大芽孢杆菌CRP-4为菌种，经过菌种活化、菌种培养和离心干燥后制得巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉，将巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉用于烟草种植过程中，通过巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉的作用，对烟草黑胫病病原菌有明显抑制作用，为开发相关生物制剂及大田推广应用奠定了基础。即本发明抑制烟草黑胫病的菌粉、制备方法和应用，解决了现有技术中在烟草种植过程中，采用化学药剂防治黑胫病，存在病原菌的抗药性逐年增加、农药残留和环境污染的技术问题。本发明的巨大芽孢杆菌CRP-4还具有来源可靠，易于培养的优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明巨大芽孢杆菌CRP-4对烟草黑胫病的抑制效果图；
图2是对照实验对烟草黑胫病的抑制效果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
本实施例抑制烟草黑胫病的菌粉的制备方法，包括如下步骤：
S1：以巨大芽孢杆菌CRP-4为菌种，将菌种进行活化；
S2：将巨大芽孢杆菌CRP-4菌种进行培养，得巨大芽孢杆菌CRP-4种子液；
S3：将巨大芽孢杆菌CRP-4种子液进行培养，得巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液；
S4：将巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液进行离心，得巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体；
S5：将巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体进行喷雾干燥，制得巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉，巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉即为抑制烟草黑胫病的菌粉。
本实施例以巨大芽孢杆菌CRP-4为菌种，经过菌种活化、菌种培养和离心干燥后制得巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉，将巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉用于烟草种植过程中，通过巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉的作用，对烟草黑胫病病原菌有明显抑制作用，为开发相关生物制剂及大田推广应用奠定了基础。即本实施例抑制烟草黑胫病的菌粉、制备方法和应用，解决了现有技术中在烟草种植过程中，采用化学药剂防治黑胫病，存在病原菌的抗药性逐年增加、农药残留和环境污染的问题。本实施例的巨大芽孢杆菌CRP-4还具有来源可靠，易于培养的优势。
根据一个优选实施方式，以巨大芽孢杆菌CRP-4为菌种，将菌种进行活化包括如下步骤：将﹣80℃下保存的巨大芽孢杆菌CRP-4在LB固体培养基上活化12h～16h，挑取单菌落接种到LB固体培养基上，在35℃培养1天-2天，得活化的巨大芽孢杆菌CRP-4。优选的，可将﹣80℃下保存的巨大芽孢杆菌CRP-4在LB固体培养基上活化12h、14h或16h。优选的，可将挑取的单菌落在LB固体培养基上培养1天、1.5天或2天。
根据一个优选实施方式，将巨大芽孢杆菌CRP-4菌种进行培养，得巨大芽孢杆菌CRP-4种子液包括如下步骤：用无菌接种环刮取一环活化的巨大芽孢杆菌CRP-4接种到50mlLB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm条件下培养24h，得巨大芽孢杆菌CRP-4种子液。
根据一个优选实施方式，将巨大芽孢杆菌CRP-4种子液进行培养，得巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液包括如下步骤：按照菌种、培养液体积比为1∶120的比例将巨大芽孢杆菌CRP-4种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为37℃，转速为120rpm/min条件下培养18h-24h，得巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液。优选的，将巨大芽孢杆菌CRP-4种子液接入到车间发酵料培养基中，培养温度不限于37℃，也可是36.5℃或37.5℃。
根据一个优选实施方式，将巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液进行离心，得巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体包括如下步骤：将巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液经设备倒料进入离心机，在离心机转速为4000rpm/min条件下制备巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体。
根据一个优选实施方式，将巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体进行喷雾干燥，制得巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉包括如下步骤：在巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体中添加保护剂，再将添加保护剂的巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体转入喷雾干燥设备得巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉。优选的，保护剂包括如下重量份的组分：2％-5％的硅藻土、1％-3％的麦芽糊精、5％-10％的碳酸钙，余量为水。优选的，进风口温度120℃-160℃，出风口温度40℃-60℃，进料速度为15ml/min-20ml/min。更优选的，硅藻土的重量例如是2％、3％、4％或5％，麦芽糊精的重量例如是1％、2％或3％，碳酸钙的重量例如是5％、7％或10％。更优选的，进风口温度例如是120℃、140℃或160℃，出风口温度例如是40℃、50℃或60℃，进料速度例如是15ml/min、17ml/min或20ml/min。
本实施例还提供一种抑制烟草黑胫病的菌粉，改菌粉是采用本实施例中任一项技术方案的抑制烟草黑胫病的菌粉的制备方法制得的。
本实施例抑制烟草黑胫病的菌粉，可用在烟草种植中。
下面对巨大芽孢杆菌CRP-4对烟草黑胫病的抑制效果进行详细说明。
将活化的巨大芽孢杆菌CRP-4(Bacillus megaterium)从平板上挑取一环接入LB液体培养基中，于160rpm，35℃培养24h，作为拮抗效果测定的发酵液；
采用平板抑制法，倒好PDA(马铃薯200g切块，用水煮沸30min，双层纱布过滤取汁，加入葡萄糖20g，琼脂15g，纯净水补足1L，自然pH，121℃，灭菌30min)平板，用5mm打孔器打取烟草黑胫病病原菌菌丝块置于平板中央，再起周围距离2.5cm处对称放置3个浸泡过巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液的滤纸片，以不接发酵液为对照，重复三次，在28℃培养箱中培养3天，巨大芽孢杆菌CRP-4对烟草黑胫病的抑制效果如图1和图2所示。从图1测量可知：巨大芽孢杆菌CRP-4对烟草黑胫病的抑菌圈直径达到15mm。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种抑制烟草黑胫病的菌粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
以巨大芽孢杆菌CRP-4为菌种，将菌种进行活化；
将巨大芽孢杆菌CRP-4菌种进行培养，得巨大芽孢杆菌CRP-4种子液；
将巨大芽孢杆菌CRP-4种子液进行培养，得巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液；
将巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液进行离心，得巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体；
将巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体进行喷雾干燥，制得巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉，巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉即为抑制烟草黑胫病的菌粉。
2.根据权利要求1所述的抑制烟草黑胫病的菌粉的制备方法，其特征在于，以巨大芽孢杆菌CRP-4为菌种，将菌种进行活化包括如下步骤：将﹣80℃下保存的巨大芽孢杆菌CRP-4在LB固体培养基上活化12h～16h，挑取单菌落接种到LB固体培养基上，在35℃培养1天-2天，得活化的巨大芽孢杆菌CRP-4。
3.根据权利要求1所述的抑制烟草黑胫病的菌粉的制备方法，其特征在于，将巨大芽孢杆菌CRP-4菌种进行培养，得巨大芽孢杆菌CRP-4种子液包括如下步骤：用无菌接种环刮取一环活化的巨大芽孢杆菌CRP-4接种到50ml LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm条件下培养24h，得巨大芽孢杆菌CRP-4种子液。
4.根据权利要求1所述的抑制烟草黑胫病的菌粉的制备方法，其特征在于，将巨大芽孢杆菌CRP-4种子液进行培养，得巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液包括如下步骤：按照菌种、培养液体积比为1∶120的比例将巨大芽孢杆菌CRP-4种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为37℃，转速为120rpm/min条件下培养18h-24h，得巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液。
5.根据权利要求1所述的抑制烟草黑胫病的菌粉的制备方法，其特征在于，将巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液进行离心，得巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体包括如下步骤：将巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液经设备倒料进入离心机，在离心机转速为4000rpm/min条件下制备巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体。
6.根据权利要求1所述的抑制烟草黑胫病的菌粉的制备方法，其特征在于，将巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体进行喷雾干燥，制得巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉包括如下步骤：在巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体中添加保护剂，再将添加保护剂的巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体转入喷雾干燥设备得巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉。
7.根据权利要求6所述的抑制烟草黑胫病的菌粉的制备方法，其特征在于，保护剂包括如下重量份的组分：2％-5％的硅藻土、1％-3％的麦芽糊精、5％-10％的碳酸钙，余量为水。
8.根据权利要求6所述的抑制烟草黑胫病的菌粉的制备方法，其特征在于，喷雾干燥条件为：进风口温度120℃-160℃，出风口温度40℃-60℃，进料速度为15ml/min-20ml/min。
9.一种抑制烟草黑胫病的菌粉，其特征在于，是采用权利要求1至8中任一项所述的抑制烟草黑胫病的菌粉的制备方法制得的。
10.权利要求9所述的抑制烟草黑胫病的菌粉在烟草种植中的应用。
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