CN105002111A - 一种防治黄瓜霜霉病的菌株tdjn1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种防治黄瓜霜霉病的菌株TDJN1，其分类命名为嗜麦芽寡养单胞菌（<i>Stenotrophomonas？maltophilia</i>），保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期2015年5月19日，保藏编号为CGMCC？No.10827。本发明还公开了一种生防菌剂，该生防菌剂是由防治黄瓜霜霉病的菌株TDJN1制备而成。本发明还公开了上述生防菌剂在防治黄瓜霜霉病方面的应用。本发明在温室中使用生防菌剂TDJN1对黄瓜霜霉病有一定程度的防治效果，温室防效达到69.04%，田间防效达到42.38%，TDJN1菌株制剂可以提高黄瓜维生素C、可溶性蛋白、可溶性糖等的含量，其增产效果达到34.73%。

Description

一种防治黄瓜霜霉病的菌株TDJN1及其应用
技术领域
本发明属于农作物防治技术领域，具体涉及一种防治黄瓜霜霉病的菌株TDJN1及其应用，专用于黄瓜霜霉病的有机绿色防治。
背景技术
黄瓜霜霉病是由古巴假霜霉菌[Pseudoperonospora cubensis]引起的一种气传病害，是世界黄瓜生产区的重要叶部病害之一，也是保护地黄瓜上的一种毁灭性病害，有70多个国家先后发生过这种病害。近年来,随着保护地黄瓜种植面积的不断增加，黄瓜霜霉病的危害逐年加重，现已成为制约温室大棚黄瓜产量的重要因子。
目前，防治黄瓜霜霉病主要依靠选育抗性品种，其次是选用化学药剂防治，如百菌清、乙磷铝、甲霜灵、代森锰锌、霜霉威·甲霜灵等；但是，抗病育种工作周期长，化学农药的反复使用易产生抗药性且污染环境。该病害一旦流行，使用化学药剂的间隔期会缩短至3-4天，农药残留问题异常突出。因此，利用生物防治策略防治黄瓜霜霉病日益受到关注，生物防治策略成为这种病害防治研究的新方向。
近几年，用于防治黄瓜霜霉病的生防产品也日益兴盛，主要有：植物提取物、微生物类、生物蛋白类、挥发性有机物等，它们的生防机理主要是通过竞争、抗生及诱导抗病性等方面进行病害的防治；已有大量研究报道了将生防菌引入植物可提高植物的抗病、抗逆性。由于生防菌在抑制植物病害方面的广谱性、高效性以及安全性，目前成为农药市场发展的趋势，被称为是最有潜力的发展方向。
因为迄今为止尚缺乏理想的高抗丰产产品种和有效药剂，且化学防治对环境污染的问题日益突出，所以在注重发展无公害生产技术的今天，生物防治作为防治黄瓜霜霉病的一种新思路，将得到进一步的重视与发展。因此，开发新的、更为高效和安全的微生物制剂控制黄瓜霜霉病的发生是提高社会生产总量的需要，同时更是农业安全及可持续发展的需要。
发明内容
发明目的：针对黄瓜霜霉病没有较高防效的生防菌株制剂现状，本发明的第一个目的是提供开发一种防治黄瓜霜霉病的单一菌株。
本发明的第二个目的是提供防治黄瓜霜霉病的菌株TDJN1在防治温室黄瓜霜霉病方面的应用。
本发明的第三个目的是提供生防菌剂，专用于防治黄瓜霜霉病，菌株的防效高，并且有较好的增产功能。
本发明的第四个目的是提供上述生防菌剂的制备方法。
本发明的第五个目的是提供上述的生防菌剂在防治黄瓜霜霉病方面的应用。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种防治黄瓜霜霉病的菌株TDJN1，其分类命名为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，该菌株已于2015年5月19号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.10827。
上述的防治黄瓜霜霉病的菌株TDJN1在防治温室黄瓜霜霉病方面的应用。
一种生防菌剂，上述的生防菌剂是由防治黄瓜霜霉病的菌株TDJN1制备而成。
上述的生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：将菌株TDJN1在LB平板上划线，28℃生化培养箱中培养14-16h，待长出单菌落后，挑取单菌落接入含有5mL的LB培养液的试管中，置于28℃、200r/min的摇床中培养，制成种子液；以1％的接种量将种子液接种于装有500mL的LB培养液的三角瓶里，置于28℃、200r/min的摇床中培养48h，待菌液浓度达到109CFU/mL时稀释待用，即为所制备的TDJN1生防菌剂。
上述的生防菌剂在防治黄瓜霜霉病方面的应用。
其应用方法为，菌株制剂在作物移栽前喷雾使用，也可以做成堆肥使用，或稀释后在移栽时灌根使用。
有益效果：本发明与现有黄瓜霜霉病防治技术相比，其优点和积极效果表现在：本发明是专门针对黄瓜霜霉病开发的生防菌株，因而在防治黄瓜霜霉病方面与目前其他广谱生物杀菌剂相比防治效果显著提高。由于是生防微生物制剂，完全没有因化学农药的使用而带来一系列问题，因而有利于作物的无公害生产，农民可以不用或减少其他防治黄瓜霜霉病化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于作物的出口。同时，生防菌株制剂还有增产功能，可为农民增加收入。
TDJN1菌株制剂可以在温室移栽前，喷在肥料中或叶片上，然后随肥料在整地过程中埋到土里，也可以在栽苗时灌根使用。栽苗后，菌株通过多种生防机制起作用，从而达到防治黄瓜霜霉病的效果。试验表明，在温室中使用TDJN1菌株制剂对黄瓜霜霉病有一定程度的防治效果，温室防效达到69.04％，田间防效达到42.38％，TDJN1菌株制剂可以提高黄瓜维生素C、可溶性蛋白、可溶性糖等的含量，还有一定程度的增产效果，其增产效果达到34.73％。
附图说明
图1为大田试验中生防菌剂TDJN1在播种55天后对黄瓜霜霉病的防治效果；
注：左—CK，右—TDJN1。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
实施例1菌株的筛选与鉴定
于2012年11月，在江苏省太仓市温室大棚发病严重的地块采集样品。采用五点采样法，每点间隔至少10m。每点三株健康植株与发病重的植株连同根围土一并收集。采集后的样品迅速装入写好编号的塑料袋中带回实验室进行分离。
菌株TDJN1是从发病的植株茎内分离得到。其分离方法为：分别剪去根茎叶各3g，用1％的次氯酸钠1mL浸5min，70％酒精浸2min，无菌水清洗3次。(取最后一次清洗的溶液0.1mL涂R2A平板，或取0.1mL最后一次清洗液加入R2A培养液，30℃振荡培养，若48h后无菌生长则认为表面消毒干净)。用灭菌的研砵分别研碎表面消毒好的根茎叶，加3mL无菌水，无菌棉布过滤，用无菌水稀释10倍，取0.1mL涂LB平板，每个点重复3次，28℃培养48h，计数，挑取平板上所有的菌落分离纯化，-70℃、40％甘油保存备用。
通过形态特征，生理生化实验和16SrDNA基因序列分析对该菌株进行鉴定。
16SrDNA基因扩增和序列分析:
菌株TDJN1在R2A培养基中28℃培养至对数期，以12000r/min离心5min收集菌体，采用上海赛百盛基因技术有限公司的基因组DNA快速提取试剂盒，提取细菌的基因组DNA，以提取的DNA产物为模板，用细菌16SrDNA基因扩增通用引物U8-27(5’-AGAGTTTGATC(AC)TGGCTCAG-3’)、L1494-1514(5’-CTACGG(AG)TACCTTGTTACGAC-3’)
从基因组DNA中扩增出16S rDNA基因片段。PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序。通过BLAST软件对测定16S rDNA基因序列进行同源性比较，结果将该菌株鉴定为寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)。
将该菌株TDJN1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10827。
实施例2：生防菌剂的制备
将菌株TDJN1在LB平板上划线，28℃生化培养箱中培养14-16h，待长出单菌落后，挑取单菌落接入含有5mL的LB培养液的试管中，置于28℃、200r/min的摇床中培养，制成种子液；以1％的接种量将种子液接种于装有500mL的LB培养液的三角瓶里，置于28℃、200r/min的摇床中培养48h，待菌液浓度达到109CFU/mL时稀释待用，即为所制备的TDJN1生防菌剂。
实施例3：温室防效实验和温室促生试验
1、温室防效实验：
待温室黄瓜苗长出4片真叶时用生防菌进行灌根和喷雾处理。灌根处理菌液浓度为1×108CFU/ml，每株苗用量为25ml，缓慢浇灌于黄瓜根部。喷雾处理菌液浓度为5×107CFU/ml，按照0.01％的终浓度加入表面活性剂吐温20，均匀喷雾于黄瓜叶片。喷雾的标准是：每片叶子上有雾状液滴分布，以不掉下为准，黄瓜叶片正反面都要喷施到，对照处理采用清水处理。生防菌处理5d后喷雾接种病原菌，接种病原菌20d后调查病害严重度并计算生防效果。病害严重度分级标准：0级，无病症；1级，接种点有轻微病斑，其直径小于0.5cm；3级，病斑直径0.5～1.3cm；5级，接种点黄化面积占子叶面积1/2以下，坏死面积占1/3以下；7级，坏死斑面积占叶面积1/3～2/3；9级，坏死斑面积占叶面积2/3以上或全株枯死。
病害严重度＝∑(各级病株数×级值)/(调查总株数×最高级值)×100％；
防治效果＝(对照组病害严重度－处理组病害严重度)/对照组病害严重度×100％。
在生防菌剂TDJN1处理25天后的调查结果显示，生防菌剂TDJN1对黄瓜霜霉病的生物防治效果(以下简称防效)达到53.76％(69.04％)(表1)。
表1生防菌剂TDJN1使用20天后对黄瓜霜霉病的温室防效
注：此结果为生防菌处理25天(病原菌接种20天)后的防效统计结果。
2、温室促生试验
在促生试验中，采用灌根处理和喷雾处理，灌根处理菌液浓度为1×108CFU/ml，每株苗用量为25ml，缓慢浇灌于黄瓜根部。喷雾处理菌液浓度为5×107CFU/ml，按照0.01％的终浓度加入表面活性剂吐温20，均匀喷雾于黄瓜叶片。生防菌处理30d后，测量黄瓜株高、叶面积以及测定鲜重、干重和生物量增加等指标。
生物量的增加计算公式如下：
温室条件下，生防菌剂TDJN1处理30d后，多个处理的黄瓜苗在株高、叶面积、鲜重和干重等指标上与对照之间具有显著性差异，生物量的增加达到27.94％(表2)。
表2生防菌剂TDJN1处理后30天对黄瓜霜霉病的温室促生效果
注：数值为平均值±标准误，不同字母表示处理间在P＝0.05的显著水平下，差异性显著。
实施例3大田防效实验
2013年下半年在江苏省太仓市现代农业园内日光大棚开展大田防效试验。种植方式为直播，种在大型盆钵中，使用的营养土为进口基质。试验采用随机区组设计，小区与小区之间均设有保护行。在黄瓜长出5～6片真叶时进行第1次处理。喷施生防菌剂TDJN130mL/株，对照组用等量清水以相同方法喷雾，喷施时均加入终浓度为0.01％的表面活性剂Tween-20。大田试验采用标准的田间管理模式，并且不再使用其他杀菌剂。生防菌剂TDJN1间隔10d施药1次，在黄瓜的整个生长期间共施药3次；初次喷雾后的7、17和27d调查病害并记录。
大田病害调查中黄瓜霜霉病分级标准(GB/T17980.26-2000.)：0级，无病斑；1级，病斑面积占整个叶面积的5％以下；3级，病斑面积占整个叶面积的6％～10％；5级，病斑面积占整个叶面积的11％～25％；7级，病斑面积占整个叶面积的26％～50％；9级，病斑面积占整个叶面积的50％以上。喷雾的植株每张叶片均调查。
病害严重度＝∑(各级病株数×级值)/(调查总株数×最高级值)×100％；
防治效果＝(对照组病害严重度－处理组病害严重度)/对照组病害严重度×100％；
单株产量＝单果重×挂果数；
增产率＝(∑处理组单株产量-∑对照组单株产量)/∑对照组单株产量×100％。
在生防菌剂TDJN1初次喷雾后第7、17和27d，生防菌剂TDJN1处理的病害严重度均低于清水对照。生防菌剂TDJN1的防效分别达到29.39％、53.03％、42.38％，并且显著高于对照组及化学药剂处理组(表3)。
表3生防菌剂TDJN1对黄瓜霜霉病的大田防效
注：数值为平均值±标准误，不同字母表示处理间在P＝0.05的显著水平下，差异性显著。
生防菌剂TDJN1处理黄瓜植株60d后，测定黄瓜单株产量和营养成分，发现生防菌剂TDJN1处理的黄瓜，单果重与清水对照组相比均有一定的提高(表4)，增产效果达到34.73％。其中，生防菌剂TDJN1处理后的单果重达到266.15g，显著高于清水对照组。
表4黄瓜果实营养成分测定
注：数值为平均值±标准误，不同字母表示处理间在P＝0.05的显著水平下，差异性显著。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (5)

1.一种防治黄瓜霜霉病的菌株TDJN1，其特征在于，其分类命名为嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia），该菌株已于2015年5月19号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10827。
2.权利要求1所述的防治黄瓜霜霉病的菌株TDJN1在防治温室黄瓜霜霉病方面的应用。
3.一种生防菌剂，其特征在于，所述的生防菌剂是由防治黄瓜霜霉病的菌株TDJN1制备而成。
4.权利要求3所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将菌株TDJN1在LB平板上划线，28℃生化培养箱中培养14-16h，待长出单菌落后，挑取单菌落接入含有5mL的LB 培养液的试管中，置于 28℃、200r/min的摇床中培养，制成种子液；以 1% 的接种量将种子液接种于装有 500mL的LB 培养液的三角瓶里，置于28℃、200r/min的摇床中培养48 h，待菌液浓度达到109CFU/mL时稀释待用，即为所制备的TDJN1生防菌剂。
5.权利要求3所述的生防菌剂在防治黄瓜霜霉病方面的应用。
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