CN114404505B

CN114404505B - 一种以南药为主的防控非洲猪瘟中药制剂及制备方法

Info

Publication number: CN114404505B
Application number: CN202210180475.8A
Authority: CN
Inventors: 雍燕; 颜振炽; 方炳虎; 刘国昌
Original assignee: Guangdong Wens Dahuanong Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangdong Wens Dahuanong Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-02-25
Filing date: 2022-02-25
Publication date: 2023-01-17
Anticipated expiration: 2042-02-25
Also published as: CN114404505A

Abstract

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种以南药为主的防控非洲猪瘟中药制剂及制备方法。本发明提供的以南药为主的中药制剂包括如下重量份数的组分：槟榔5～8份，桂枝3～7份，牛大力3～7份，黄连3～7份，黄芩3～7份，鱼腥草3～5份，南板蓝根3～5份，紫锥菊3～5份，甘草1～2份。本发明提供的中药制剂，以南药为主，为纯中药制剂，天然安全，毒副作用低，且各组分协同，可在体外有效抑制非洲猪瘟病毒的复制，提高猪的免疫力，增强对非洲猪瘟等病毒的抵抗力，降低疾病的发病率，助力非洲猪瘟常态化的情况下养猪业的发展。

Description

一种以南药为主的防控非洲猪瘟中药制剂及制备方法

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种以南药为主的防控非洲猪瘟中药制剂及制备方法。

背景技术

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染引起的急性、烈性、高致病性传染病，世界动物卫生组织(OIE)已将其列为法定报告的动物疫病，我国则将其列为一类动物疫病。1921年，ASF首次发现于肯尼亚，而后传播至西非、欧洲、亚洲的60多个国家，给全球的农牧业造成严重的损失。2018年8月1月，我国辽宁沈阳发现首例非洲猪瘟后，由于“西猪东运，北猪南运”的生猪空间流通模式，使得非洲猪瘟疫情迅速蔓延至全国多地，从而对我国的生猪养殖业构成了巨大的威胁。

中医中药是我国医学独有的优势，历史悠久，数千年来为广大人民群众的医疗保健作出了重要的贡献。中药抗病毒已成为现代医药学研究的热点，现代研究表明，部分中药对病毒具有抑制杀灭作用。在现代医学防控非洲猪瘟还缺乏有效产品的情况下，采用传统中医药结合现代制剂技术防控非洲猪瘟具有明显的优势。但是药材资源分布具有明显的区域特点，兽用中药的成本控制要求比较高，因此，采用特定区域的药材就近生产和使用，更加符合兽用中药的发展趋势。南药，是指长江以南，岭南以北所产的中药材，南药资源丰富，多项研究表明肉桂、槟榔、辣蓼、鱼腥草、穿心莲、藿香、南板蓝根等南药具有杀菌、抗炎、解毒、增强免疫力等功效，具有极大的开发应用价值。

目前，非洲猪瘟没有有效的疫苗和药物。严格的生物防控和提高猪群免疫力，仍是当下最主要的防控措施。本发明结合传统中医理论，探究ASF的中医发病机制，通过体外及体内试验，研发防控ASF的中药制剂及其应用方法，为防控ASF提供新的手段，为生猪养殖提供坚实的保障。

发明内容

针对现有技术普遍存在的缺陷，本发明提供了以南药为主的防控非洲猪瘟中药制剂及制备方法。本发明提供的中药制剂，以南药为主，为纯中药制剂，天然安全，毒副作用低，可在体外有效抑制非洲猪瘟病毒的复制，提高猪的免疫力，增强对非洲猪瘟等病毒的抵抗力，降低疾病的发病率。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种中药制剂，包含如下重量份数的组分：槟榔5～8份，桂枝3～7份，牛大力3～7份，黄连3～7份，黄芩3～7份，鱼腥草3～5份，南板蓝根3～5份，紫锥菊3～5份，甘草1～2份。

优选地，由如下重量份数的组分组成：槟榔7份，桂枝5份，牛大力5份，黄连5份，黄芩5份，鱼腥草4份，南板蓝根4份，紫锥菊4份，甘草1.5份。

本发明还提供了一种所述的中药制剂的制备方法，制备过程如下：分别称取所述重量份数的槟榔、桂枝、牛大力、黄连、黄芩、鱼腥草、南板蓝根、紫雏菊及甘草，用高效万能粉碎机粉碎，过40～120目筛，然后混合搅拌均匀，即得。

优选地，所述混合搅拌均匀的条件为于500～800rpm下搅拌10～20min。

本发明还提供了一种所述中药制剂在制备非洲猪瘟饲料中的应用。

优选地，所述中药制剂与饲料的添加量按6～10g/公斤计。

本发明在实验过程中，根据2020年进行的临床辩证(卫气营血辩证)，确定了防治原则为：益气健脾、行气降逆、清热解毒、凉血消斑，设置了多个不同的组方，制备样品，分别在广西、湖南等猪场进行应用评估。根据不同地区的应用情况，进行了分析，确定了基础方向的正确性，结合应用中的不足，逐步完善配方，并经样品试制，质量研究，确定制备工艺和质量标准(内控)，最终成功获得本发明所述的中药方剂。

本发明中的药剂在制备预防非洲猪瘟饲料饲喂猪的过程中，可以采用如下饲喂方式：(1)将组方中的药材，经高效粉碎机粉碎成40目至120目的粉末，混合均匀后制成中药散剂。将该中药散剂，以每公斤饲料添加6～10g的剂量，加入饲料中，搅拌混合均匀后，饲喂；(2)将组方中的药材，经高效粉碎机粉碎成40目至120目的粉末，混合均匀后制成中药散剂。将该中药散剂使用微生态制剂发酵后使用，具体方法为：1吨清洁水(35～40℃)添加该发明中的中药散剂6.5kg、以酵母菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌等制成的微生态制剂5kg、红糖5kg、猪饲料100kg。将以上物料混匀好装入发酵桶用薄膜密封好，使用橡皮筋捆扎严实，待发酵24～72小时(夏季高温天气24～48h；冬春季在约28℃环境温度中发酵48～72h)。发酵结束后开封的发酵水可闻到一股浓郁的酸香味，检测pH到3.8以下。将发酵后的含药饲料，直接饲喂；(3)组方中的药材，粉碎成10目～20目的粗粉，加入药材总重量12倍水，煎煮1小时后，过滤药液，药液进一步浓缩成稠膏后，将该稠膏、药渣与饲料混合均匀，饲喂。上述饲喂方式根据养猪场的规模、季节及饲喂习惯等进行选择。

与现有技术相比，本发明提供的中药制剂具有如下优势：

(1)本发明为纯中药制剂，天然安全，毒副作用低，且各组分协同，可在体外有效抑制非洲猪瘟病毒的复制，提高猪的免疫力，增强对非洲猪瘟等病毒的抵抗力，降低疾病的发病率，助力非洲猪瘟常态化的情况下养猪业的发展。

(2)本发明选用来源广泛的南药材进行组方，具有独特的地域优势，更顺应畜禽养殖中兽药的应用实际，而且本发明提供了该组方防控非洲猪瘟的多种应用方案，可适应不同规模养殖场、不同用药习惯、不同季节疾病的防控。

附图说明

图1为体外病毒抑制预实验结果图；

图2为间接免疫荧光试验结果图；

图3为病毒吸附试验结果图；

图4为病毒穿入试验结果图；

图5为病毒复制试验结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。本实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域常规技术方法和仪器说明书内容进行操作；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1一种中药制剂

所述中药制剂，包含如下重量份数的组分：槟榔5份，桂枝3份，牛大力3份，黄连3份，黄芩3份，鱼腥草3份，南板蓝根3份，紫锥菊3份，甘草1份。

所述的中药制剂的制备过程如下：分别称取所述重量份数的槟榔、桂枝、牛大力、黄连、黄芩、鱼腥草、南板蓝根、紫雏菊及甘草，用高效万能粉碎机粉碎，过40目筛，然后于500rpm下搅拌20min，混合搅拌均匀，即得。

实施例2一种中药制剂

所述中药组制剂，包含如下重量份数的组分：槟榔8份，桂枝7份，牛大力7份，黄连7份，黄芩7份，鱼腥草5份，南板蓝根5份，紫锥菊5份，甘草2份。

所述的中药制剂的制备过程如下：分别称取所述重量份数的槟榔、桂枝、牛大力、黄连、黄芩、鱼腥草、南板蓝根、紫雏菊及甘草，用高效万能粉碎机粉碎，过120目筛，然后于800rpm下搅拌10min，混合搅拌均匀，即得。

实施例3一种中药制剂

所述中药制剂，包含如下重量份数的组分：槟榔7份，桂枝5份，牛大力5份，黄连5份，黄芩5份，鱼腥草4份，南板蓝根4份，紫锥菊4份，甘草1.5份。

所述的中药制剂的制备过程如下：分别称取所述重量份数的槟榔、桂枝、牛大力、黄连、黄芩、鱼腥草、南板蓝根、紫雏菊及甘草，用高效万能粉碎机粉碎，过80目筛，然后于600rpm下搅拌15min混合搅拌均匀，即得。

试验例1体外病毒抑制试验

1.试验材料：实施例3制得的中药制剂，测试用细胞为原代猪肺泡巨噬细胞(PAMs)，非洲猪瘟病毒毒株：ASFV/China/GZ201801由国家非洲猪瘟区域实验室(广州)分离鉴定，病毒浓度为10⁶HAD₅₀/mL；

2.试验方法：

2.1预实验部分：将PAMs铺96孔板，分别加入1:20、1:50、1:100、1:200、1:500稀释度的受试中药制剂，并且设置细胞对照组和无细胞对照组，作用2h后，弃去化合物，加入10％FBS的RPMI Medium 1640培养基，在37℃、5％CO₂培养箱培养48h。培养2d后进行CCK8测定。

2.2正式试验：为了避免消毒剂对细胞生长产生影响，根据预试验结果将正式试验做出以下调整，即消毒剂与病毒悬液反应后再稀释到安全浓度后再上细胞孵育。

2.2.1间接免疫荧光试验

将PAM细胞接种于48孔板中，待细胞贴壁，用100倍稀释的ASFV病毒液接种细胞，250μL/孔，在37℃、5％CO₂培养箱培养2h后，用10％FBS的RPMI Medium 1640培养基将中药制剂稀释为1:500、1:1000、1:2500，与病毒液1:1等体积加入细胞板中，在37℃、5％CO₂培养箱中培养48h后，做间接免疫荧光试验。

2.2.2病毒吸附实验

将PAM细胞接种于24孔板中，待细胞贴壁，弃去培养液，用100倍稀释的ASFV病毒液将中药制剂稀释为1:1000、1:2000、1:5000，同时设置细胞阴性对照组、病毒组和利巴韦林阳性药物组，500μL/孔，将24孔板放到4℃冰箱中培养2h，用无血清RPMI Medium 1640培养基洗3次，重新加入无血清培养基，在37℃、5％CO₂培养箱培养48h后收样，做QPCR试验。

2.2.3病毒穿入试验

将PAM细胞接种于24孔板中，待细胞贴壁，弃去培养液，用100倍稀释的ASFV病毒液接种细胞，500μL/孔，在4℃冰箱中孵育1h后，用无血清RPMI Medium 1640培养基洗3次，将受试化合物用10％FBS的RPMI Medium 1640培养基稀释为1:1000、1:2000、1:5000，同时设置细胞阴性对照组、病毒组和利巴韦林阳性药物组，在37℃、5％CO₂培养箱培养1h，再用无血清RPMI Medium1640培养基洗3次，重新加入10％FBS的RPMI Medium 1640培养基，在37℃、5％CO₂培养箱培养48h后收样，做QPCR试验。

2.2.4病毒复制试验

将PAM细胞接种于24孔板中，待细胞贴壁，弃去培养液，用50倍稀释的ASFV病毒液接种细胞，500μL/孔，在37℃、5％CO₂培养箱培养2h，用10％FBS的RPMI Medium 1640培养基将受试化合物稀释为1:500、1:1000、1:2500，与病毒液1:1等体积加入细胞板中，在37℃、5％CO₂培养箱中培养48h后，收集病毒上清液进行HAD50测定以及QPCR试验。

3.实验结果：预实验结果如图1所示，由图1可知，该中药稀释500倍时对PAMs没有毒性，CC50值为0.01741(大概57倍稀释时)，即可以使CC50为0.01741的药物浓度大概是将药物稀释57倍时，几乎没有影响；间接免疫荧光试验结果如图2所示，从图中显示出，该中药以剂量依赖方式抑制病毒的复制，并且该中药稀释1000倍时可以抑制90％以上病毒的复制；病毒吸附试验如图3所示，结果显示，该中药在1:1000的稀释度下，能够抑制ASFV的吸附；病毒穿入试验结果如图4所示，结果显示，该中药在1:1000的稀释度下，能够抑制ASFV的内化，病毒复制试验结果如图5所示，结果显示通过HAD50实验和QPCR实验表明该中药以剂量依赖的方式抑制病毒的复制。

由上述各结果可知，本发明提供的中药制剂以剂量依赖关系抑制ASFV在PAMs细胞中的增殖，EC50值为0.0001195，稀释倍数大概是8368倍，在500倍稀释时对PAMs细胞没有毒性作用，CC50为0.01741，稀释倍数大概是57倍，选择指数(SI＝CC50/EC50)为145，可以阻断ASFV在PAMs细胞上的吸附和内化阶段。

试验例2防控非洲猪瘟试验

1.试验样品：实施例1-3制得的中药制剂；

2.试验对象：100天龄肉猪120头，随机分成4组，每组30头；对照组不给任何药物，试验组分别给予本发明实施例1-3组的中药制剂。

3.试验方法：于2020年12月1日-2021年2月28日连续三个月，以每头猪每天20g的剂量，分别将实施例1-3制得的中药制剂加水煎煮10～15分钟，放凉后连汤带渣拌料使用，所用饲料为温氏肉猪配合饲料(由玉米、豆粕、鱼粉等组成，经检测不含任何化学药物和中药)。每天观察并记录每组猪的健康状况和死亡率，并于试验中期采集血液进行非洲猪瘟抗体检测。

4.试验结果：具体试验结果如表1、表2所示。

表1-1实施例1-2组的猪只临床症状记录表

表1-2实施例3组及对照组的猪只临床症状记录表

表2饲喂2个月后非洲猪瘟抗体检测结果

试验样品	X％	判定
			实施例1组	102.6	+
实施例2组	102.7	+
			实施例3组	102.9	+
对照组	96.6	+

判定标准：X％≥50％为阳性，X％≤40％为阴性，介于两者之间为可疑

试验3个月后，饲喂本发明实施例组制得的中药制剂的猪群，未出现明显症状，动物群体生长良好，动物增重比较平均；而对照组有15头猪死亡，死亡率为25％，且存活的猪只生长状况差异较大，体重偏差较大。试验组的猪在采食量、精神状态、临床症状、死亡率、增重等方面，试验组均优于对照组。从非洲猪瘟抗体检测结果来看，在饲喂中药制剂2个月后，试验组非洲猪瘟抗体水平较高，且猪只之间的抗体水平无明显差异，证明本发明中药制剂具有增强免疫力，提高对病毒的抵抗力，有助于抗体产生的功效。

试验例3临床验证试验

1.试验样品：实施例3制得的中药制剂；

2.试验过程：于湖北孝昌猪场进行试验，在多个养户猪场同时使用，以10g/kg饲料的剂量，将该中药制剂直接加到饲料中使用，连用8～15天，观察猪群整体状态，统计死淘率。

3.试验结果：具体试验结果如表3所示。

由上述表3可知，在使用期间，猪群的死淘率均明显低于使用前的死淘率，且有一半的养户猪死淘率在1％以内，同时有养户反应使用后猪群的整体状态明显改善；这正好证明了本发明中药制剂的重要作用。

需要说明的是，尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims

1.一种防控非洲猪瘟的中药制剂，其特征在于，由如下重量份数的组分制成：槟榔5～8份，桂枝3～7份，牛大力3～7份，黄连3～7份，黄芩3～7份，鱼腥草3～5份，南板蓝根3～5份，紫锥菊3～5份，甘草1～2份。

2.如权利要求1所述的中药制剂，其特征在于，由如下重量份数的组分制成：槟榔7份，桂枝5份，牛大力5份，黄连5份，黄芩5份，鱼腥草4份，南板蓝根4份，紫锥菊4份，甘草1.5份。

3.一种如权利要求1所述的中药制剂的制备方法，其特征在于，制备过程如下：分别称取所述重量份数的槟榔、桂枝、牛大力、黄连、黄芩、鱼腥草、南板蓝根、紫雏菊及甘草，用高效万能粉碎机粉碎，过40～120目筛，然后混合搅拌均匀，即得。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述混合搅拌均匀的条件为于500～800rpm下搅拌10～20min。

5.一种如权利要求1所述的中药制剂在制备非洲猪瘟防控饲料中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述中药制剂与饲料的添加量按6～10g/公斤计。