CN111518909A - Mettl2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物治疗敏感性的试剂盒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域,公开了METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物治疗敏感性的试剂盒中的应用。该应用是基于本发明发明人发现,METTL2蛋白表达能增强结直肠癌细胞对5‑FU的敏感性,结直肠癌患者肿瘤组织高表达METTL2与5‑FU化疗的良好预后呈正相关。从而,临床医生可以通过结直肠癌患者METTL2基因的表达情况,确定结直肠癌患者是否适用氟尿嘧啶类药物治疗,制定个性化治疗方案。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,特别涉及METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物治疗敏感性的试剂盒中的应用。
背景技术
结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)在世界范围内的发病率和死亡率均居全球所有类型肿瘤的第三位。近几十年随着我国经济和科学技术发展,大幅度提高人们的生活水平同时伴随西式饮食模式的普及,结直肠癌的发病率逐年攀升。自20世纪50年代,5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)作为结直肠癌治疗的基本药物应用于临床以来,5-FU和Capecitabine(口服药)等氟尿嘧啶类药物(FU)至今仍是不同分期结直肠癌患者的一线化疗方案(例如,CAPEOX,FOLFOX,FOLFIRI,XELOX等)的重要组分。然而5-FU的单药有效率只有10-15%,联合亚叶酸钙(Leucovorin,LV)有效率可从11%提高到25%,但总体有效率仍然偏低,肿瘤对FU的敏感性成为制约患者化疗疗效及预后最重要的因素之一。因此我们亟需深入研究如何有效评估结直肠癌患者对FU的敏感性,以便提高药物有效性、控制FU耐药的产生。寻找特异性调控FU代谢及敏感或耐药相关基因,以便临床医生根据不同结直肠癌患者制定更合理的个性化治疗方案,对于优化医疗资源结构具有极为重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物治疗敏感性的试剂盒中的应用。
本发明的上述目的通过以下技术方案予以实现:
METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物治疗敏感性的试剂盒中的应用。是基于本发明发明人发现,METTL2能增强结直肠癌细胞对5-FU的敏感性,结直肠癌患者肿瘤组织中高表达METTL2与5-FU化疗的良好预后呈正相关。从而,临床医生可以通过结直肠癌患者肿瘤组织中METTL2基因的表达情况,确定结直肠癌患者是否适用氟尿嘧啶类药物治疗,制定个性化治疗方案。
所述的氟尿嘧啶类药物优选为5-FU和Capecitabine中的至少一种;更优选为5-FU。
所述的试剂盒包括检测METTL2 mRNA量的试剂和检测METTL2蛋白量的试剂中的一种或两种。
所述的检测METTL2 mRNA量的试剂优选为能进行反转录-实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的试剂。
所述的能进行反转录-实时荧光定量PCR的试剂包括依据METTL2 mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引物;优选为包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1~40所示的20对引物对中的任一对;核苷酸序列如SEQ ID NO.1~40所示的引物名称中第一个数字相同为同一对引物。
所述的能进行反转录-实时荧光定量PCR的试剂还包括依据内参基因mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引物;优选为包括依据内参基因mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引物;更优选为包括核苷酸序列如SEQ ID NO.41~42所示的引物对。
所述的能进行反转录-实时荧光定量PCR的试剂优选为组合试剂A和组合试剂B中的至少一种;其中,组合试剂A为依据探针法得到的组合试剂,包括但不限于:依据METTL2mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引物、依据METTL2 mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的探针、依据内参基因mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引物、依据内参基因mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的探针;
组合试剂B为依据染料法得到的组合试剂,包括但不限于:依据METTL2 mRNA设计的用于实时荧光定量PCR的引物、依据内参基因mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引物和染料。
所述的探针优选为Taqman探针。
所述的染料优选为SYBR Green。
所述的检测METTL2蛋白量的试剂优选为能进行WESTERN BLOT(WB)的试剂和能进行免疫组化染色(IHC)的试剂。
所述的能进行WESTERN BLOT(WB)的试剂包括但不限于:抗METTL2抗体、抗内参蛋白抗体、通用二抗及显色或发光试剂。
所述的内参蛋白优选为GAPDH。
所述的能进行免疫组化染色(IHC)的试剂包括但不限于:抗METTL2抗体、通用二抗及显色试剂。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
本发明人发现METTL2不影响结直肠癌细胞的增殖能力,但通过体内外实验发现:METTL2在体外细胞水平和动物体内均能增强结直肠癌细胞对5-FU的敏感性。本发明基于人类全基因组RNAi技术筛选出结直肠癌的5-FU敏感基因METTL2,分析其表达与接受含氟尿嘧啶化疗的肠癌患者预后的相关性,为临床医生根据不同个体遗传差异制定更为合理的化疗方案提供参考证据,对于优化医疗资源结构具有极为重要意义。
附图说明
图1为全基因组RNAi技术筛选5-FU敏感相关基因流程图。
图2为稳定敲降不同候选基因后HCT116细胞株的5-FU量效曲线及5-FU耐药性变化结果图。
图3是Western blot(WB)和反转录-定量PCR(RT-qPCR)法检测HCT116细胞经5-FU处理前后METTL2的表达情况图。
图4是WB和RT-qPCR法检测HCT-8及其耐药株HCT-8-FU中METTL2表达情况图。
图5为METTL2对结直肠癌细胞增殖能力的影响结果图;其中,图A为CCK-8实验结果图;图B为平板克隆形成实验结果图。
图6为METTL2增强结直肠癌细胞的5-FU敏感性结果图;其中,图A为CCK8实验结果图;图B为平板克隆形成实验结果图。
图7为裸鼠移植瘤模型实验中,METTL2增强结直肠癌细胞的5-FU敏感性结果图;其中,图A为敲降METTL2的HCT116移植瘤结果图;图B为过表达METTL2的HT-29移植瘤结果图。
图8为接受含5-FU化疗的结直肠癌患者METTL2表达与预后的关系结果图;其中,图A为结直肠癌组织METTL2表达的四种强度图;图B为生存分析结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
结直肠癌细胞株HCT116、SW620、HT-29、DLD1、HCT-15、SW480、HCT-8以及正常人肠粘膜上皮细胞NCM460以及人胚肾上皮细胞株293T均购买于美国菌种保藏中心(ATCC),HCT-8的5-FU耐药株(即:HCT-8-FU人结肠癌氟尿嘧啶耐药株)购于上海奥陆生物科技有限公司。本研究所用细胞株均经过中国典型培养物保藏中心细胞进行短串联重复列检测鉴定正确,并经过支原体检测无污染。细胞均用含10%胎牛血清的培养基培养,各细胞的培养基分别为:HCT116细胞:McCoy’5A培养基;DLD-1细胞,HCT-15细胞,HCT-8细胞和HCT-8-FU细胞:RPMI-1640培养基;SW480细胞和SW620细胞:L-15培养基;NCM460细胞和293T细胞:DMEM培养基。
Western Blot(WB)实验试剂:快速凝胶制备试剂盒(弗德生物,中国);一抗二抗稀释液、一抗二抗去除液-弱碱性(碧云天,中国);M2 anti-Flag agarose(Sigma,美国);超敏ECL化学发光试剂盒(北京四正柏,中国);BCA蛋白定量检测试剂盒(凯基生物,中国);anti-mouse IgG HRP-linked Antibody(Promega,美国);#9803S-IP裂解液和anti-rabbit IgGHRP-linked Antibody(Cell Signaling Technology,美国)。
所用抗体:抗METTL2(#SAB1407697,Sigma,美国;用于WB稀释度1:250),抗METTL2(#TA324450,Origene,美国;用于免疫组化染色稀释度1:50),抗GAPDH(#D16H11,北京四正柏,中国;用于WB稀释度1:2000);抗裂解的PARP-1(#D64E10,CST,美国;用于WB稀释度1:1000;用于免疫组化染色稀释度1:50)、抗裂解的Caspase-3(#9661,CST,美国;用于WB稀释度1:1000;用于免疫组化染色稀释度1:200)、抗裂解的Caspase-7(#D2Q3L,CST,美国,用于WB稀释度1:1000)。
实施例1:全基因组RNAi技术筛选5-FU敏感基因
本研究利用全基因组shRNA文库LentiPlexTM PooledshRNA libraries(Sigma,美国)结合二代测序分析技术构建高通量筛选结直肠癌中与5-FU敏感相关基因的筛选***(筛选流程详见图1)。该文库基于慢病毒载体pLKO.1,对人基因组约15000个基因设计了序列,平均每个基因设计了3-5条shRNA序列,总文库分成10个小库(pool1-10),每个小库中含有约1500个基因的靶向序列。实验中,我们用RNAi文库以0.5MOI(Multiplicityof infection)去感染HCT116细胞和HT-29细胞,目的是保证绝大多数细胞感染的病毒颗粒不超过一个,即每个成功感染病毒的细胞只接收靶向一个基因的shRNA,从而确保细胞没有发生多个基因的同时敲降。接着将混合的感染细胞经过嘌呤霉素筛选,将存活下来的稳定感染的HCT116和HT-29细胞分别各自分成两组,一组是实验组,另一组是对照组。往实验组细胞的培养基添加终浓度为5μM5-FU,对照组的培养基添加5-FU的相同剂量的溶解剂(DMSO)。隔天换液培养,并把漂浮的细胞去掉,继续添加含相同剂量的5-FU(或DMSO)的培养基继续培养。5-FU处理一周后,收集各组细胞并提取基因组DNA,然后用带有标签的通用引物(详见下述的具体过程)扩增特异性shRNA序列片段并进行高通量测序分析。筛选***的原理是,与对照组相比,5-FU处理组的某个基因的shRNA拷贝数明显升高,证明在该基因敲降后,结直肠癌细胞产生抵抗5-FU的能力,从而说明该基因可能是结直肠癌细胞与5-FU敏感相关。
具体过程如下(流程见图1):
1、构建细胞RNAi文库筛选***
(1)细胞铺板:取状态良好的对数生长期HCT116和HT-29细胞(均购于美国菌种保藏中心ATCC)通过消化、计数,铺种到10cm细胞培养皿,HCT116铺种细胞1.5×106个/皿,HT-29铺种细胞2.5×106个/皿;铺板次日随机在两种细胞中各自选取一个10cm培养皿的细胞进行消化和计数,目的是确定两株细胞每块皿的总细胞数;
(2)病毒感染:根据每个皿的细胞数计算需要添加的病毒液体积。将全基因组shRNA文库LentiPlexTM Pooled shRNA libraries以MOI为0.5的浓度进行病毒感染,并加入聚凝胺使其终浓度为8μg/ml;同时以无病毒感染组细胞作为对照(用等体积的培养基替代病毒液);
(3)嘌呤筛选:病毒感染24h后用含嘌呤霉素的完全培养基进行筛选,其中,HCT116细胞培养基中嘌呤霉素的筛选浓度为1μg/ml;HT-29细胞培养基中嘌呤霉素的筛选浓度为2μg/ml。嘌呤霉素筛选时间根据无病毒感染组细胞全部被嘌呤霉素杀死为止,期间需要每2~3天。换液,清除死亡的细胞和漂浮的细胞碎片;
(4)5-FU筛选:把经过嘌呤霉素筛选的稳定感染病毒的结直肠癌细胞各自分成两组;实验组给予5μM5-FU处理,对照组给予同等体积的溶剂(DMSO)处理。隔天替换含相同剂量5-FU或DMSO的培养液,同时弃掉漂浮的细胞。在给药1周后收集细胞待用;
(5)收集各组细胞并提取基因组DNA:A)将步骤(4)筛选得到的贴壁细胞(细胞总数约1×106个)用胰酶消化、离心、PBS洗涤2遍后离心(转速为1500rpm,5min)收集细胞沉淀置于1.5ml EP管;B)加入300μl细胞裂解液重悬,在涡旋仪涡旋15s充***解;C)加入1.5μlRNase A,上下颠倒混匀8-10次,随后放入37℃水浴锅孵育5-10min去除RNA,然后将把样品置于冰水中快速降温;D)加入100μl蛋白沉淀液,涡旋仪30-60s混匀,16000-18000×g离心1min;E)取上清液置于新的EP管内,加入300μl异丙醇,轻柔颠倒混匀,16000-18000×g离心1min(管底有少量白色沉淀即细胞DNA);F)小心弃去上清后,用100μl枪头尽量小心吸走残余液体,室温晾干2-5min;G)根据DNA量加入30-50μl DNA洗脱缓冲液,轻轻涡旋数秒后,置于65℃水浴锅1h使DNA充分溶解;H)在nanodrop 2000测定DNA浓度和纯度后,置于-20℃保存。
2、扩增目标shRNA序列并进行二代测序
(1)同一个小库的HCT116细胞或HT-29细胞取80ng DNA为模板,对其进行巢式PCR扩增:
A)第一轮PCR:
正向引物:5'-TACAAAATACGTGACGTAGAAA-3';
反向引物:5'-TTTGTTTTTGTAATTCTTTA-3'。
反应体系:基因组DNA 80ng、10倍浓度缓冲液2.5μl、2mM dNTPs 2.5μl、25mMMgSO41.5μl、10μM正向引物0.75μl、10μM反向引物0.75μl、KOD Plus-Neo酶0.5μl,用双蒸水补足25μl。
反应条件:98℃预变性30s;98℃变性15s、68℃退火及延伸30s,20个循环;72℃终末延伸2min。
B)第二轮PCR:
DNA模板:第一轮PCR产物,加入ddH2O稀释10倍待用。
各实验组引物分别见下表1:
表1
反应体系:DNA模板1μl、10倍浓度缓冲液5μl、2mM dNTPs 5μl、25mM MgSO4 3μl、10μM正向引物1.5μl、10μM反向引物各1.5μl、KOD Plus-Neo酶1μl,用双蒸水补足50μl。
反应条件:98℃预变性30s;98℃变性10s、60℃退火30s、68℃延伸20s,35个循环;72℃终末延伸1min。
(2)PCR产物纯化和定量:第二轮PCR产物常规电泳跑胶、切胶回收纯化,用nanodrop 2000测定DNA浓度和纯度。
(3)二代测序及数据分析:将纯化回收的PCR产物等比例混合,委托生物公司进行高通量测序并分析。测序结果根据下述筛选条件进行筛选候选基因:①正向筛选敏感基因(FU处理组vs.对照组),Log2(Fold Change)>2.0,FDR<0.05;②FU处理组至少2条shRNA的拷贝数升高4倍以上,且Count数>300。
3、数据分析结果:分析测序结果后,根据上面的筛选条件进行筛选5-FU敏感性相关基因,得到5个候选基因,分别是:METTL2、ZNF365、CEP68、IFT122和BEST2。结果显示,HCT116细胞和HT-29细胞经过5-FU处理前后,单个靶基因在两组遗传背景不同的结直肠癌细胞中,至少有2条shRNA拷贝数明显升高,提示该基因可能是5-FU敏感相关的候选基因。
4、细胞水平验证:
(1)构建这五个基因稳定敲降的HCT116细胞株:将表达下述shRNA(见下表2)的慢病毒分别转染HCT116细胞后,用嘌呤霉素筛选,得到五个基因稳定敲降的HCT116细胞株和对照HCT116细胞株。
表2
(2)细胞5-FU敏感性检测:用CCK-8试剂盒检测上述稳定细胞株5-FU在不同浓度范围内(0μM、0.04μM、0.2μM、1μM、5μM、25μM、125μM、1250μM)对上述稳定细胞株的杀伤作用(细胞活力检测)。
(A)细胞铺板:取生长状态良好的对数期细胞接种于96孔板,细胞数为3×103个/孔,每组设置3-5个复孔,37℃、含5%CO2和饱和水蒸气的条件下培养24h;(B)加药:铺板24h后,弃去原来的培养基,分别加入含有不同浓度的5-FU(0μM、0.04μM、0.2μM、1μM、5μM、25μM、125μM、1250μM)的完全培养基,继续培养72h;(C)测量:每孔加入1/10体积CCK8溶液,同上述条件培养2-4h。通过酶标仪在波长为458nm读取OD值(在测量过程需要注意测量值不能大于2,否则使曲线产生偏差);(D)计算IC50:利用Graphpad Prism8.0绘制随着5-FU浓度变化的量效曲线,计算5-FU的IC50和细胞的相对耐药系数。
结果见图2。结果提示敲低METTL2、CEP68和IFT122基因均能增加HCT116细胞对5-FU的IC50值和耐药指数,其中敲低METTL2的影响最为显著。
实施例2:在结直肠癌中METTL2与5-FU敏感性的关系
1、METTL2在结直肠癌细胞接受5-FU处理前后的表达变化
(1)以不同浓度(0、0.5μM、1μM、2μM、4μM、8μM)5-FU处理结直肠癌细胞株HCT116细胞24h;收集细胞提取RNA和蛋白质,测定METTL2的mRNA和蛋白水平。
(2)mRNA水平检测(RT-qPCR法):
(A)用TRIzol法提取细胞总RNA(按试剂盒操作指南执行),在nanodrop 2000测定DNA浓度和纯度;
(B)将上述RNA按照常规方法进行反转录合成相应的cDNA;
(C)定量PCR(qPCR)方法检测mRNA相对含量(以GAPDH作为内对照):
METTL2的qPCR引物可以是下表(表3)中任何一对:
表3
反应体系:cDNA2μl、2×SYBR Green PCR Mastermix 8μl、10μM上游引物1μl、10μM下游引物1μl、ddH2O 4μl。
反应条件:95℃预变性5min;98℃变性15s、60℃退火30s、72℃延伸40s,40个循环。
(D)以GAPDH为内参,计算各组细胞的ΔCt(METTL2的Ct值减去GAPDH的Ct值)得到METTL2 mRNA相对含量2-ΔCt,然后以shNC组METTL2 mRNA相对含量为基准值1,计算METTL2的相对mRAN水平。
(3)蛋白质水平检测(Western blot法):(A)按照常规方法用Cocktail蛋白酶抑制剂混合的RIPA细胞裂解液裂解细胞,提取细胞总蛋白;(B)制备10%聚丙烯酰胺凝胶,细胞总蛋白经常规SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、5%脱脂牛奶封闭液封闭;(C)抗体孵育,再利用超敏ECL化学发光试剂盒(购自北京四正柏生物科技有限公司)进行蛋白条带显色(发光)。
(4)结果:RT-qPCR法检测发现,5-FU处理前后及不同浓度5-FU处理的HCT116细胞中METTL2的mRNA水平无明显变化;而Western blot法检测发现,5-FU处理后METTL2蛋白水平明显下降,且随着5-FU浓度增加,METTL2蛋白水平呈现不断下降趋势(图3)。
2、METTL2在结直肠癌5-FU耐药细胞株及其母株中表达差异
(1)收集指数生长期的结直肠癌细胞株HCT-8及其5-FU耐受株(HCT-8-FU人结肠癌氟尿嘧啶耐药株,购于上海奥陆生物科技有限公司)细胞,按照上述RT-qPCR法和Westernblot法检测METTL2表达情况。
(2)结果:在5-FU耐受株(HCT-8-FU)中,METTL2不管是mRNA还是蛋白水平均明显低于母本细胞株(见图4)。
上述实验结果提示,结直肠癌细胞株接受5-FU刺激后可能会导致METTL2含量下降,以适应5-FU这种不良刺激,反映METTL2的生物学功能可能与5-FU的敏感性有密切关系。
实施例3:稳定敲降或过表达METTL2的结直肠癌细胞株构建,及其对增殖能力的影响。
(1)根据pLKO.1载体(Sigma-Aldrich,美国)操作指南设计合成针对下表(表4)靶序列的shRNA,***pLKO.1质粒的Age I和EcoR I位点,在293T细胞中包装成获得表达相应shRNA的慢病毒。
表4
(2)将上述慢病毒液常规感染HCT116和SW620细胞,用嘌呤霉素筛选得到稳定敲降METTL2细胞株(HCT116/sh1和HCT116/sh2、SW620/sh1和SW620/sh2)或阴性对照细胞株(HCT116/shNC、SW620/shNC)。
(3)将METTL2 cDNA(购自山东维真生物科技公司)***pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro(System Bioscience,美国)载体的XbaI和NheI位点,构建得到慢病毒METTL2表达载体;在293T细胞中包装慢病毒,然后感染HT-29细胞,构建稳定过表达METTL2的HT-29/METTL2细胞和空载体对照的HT-29/Vec细胞。
(4)METTL2对肠癌细胞的增殖能力的影响检测:通过CCK8实验(操作过程参照见实施例1)和平板克隆形成实验(见下述)在无5-FU条件下检测上述稳定细胞株的增殖能力。
(5)平板克隆形成实验:(A)将对数生长期的大肠癌细胞(HCT116细胞500个/孔,HT-29细胞1500个/孔)分别铺种在6孔板中,设置3个复孔;(B)细胞用各自的完全培养基培养,每3天换液一次;(C)细胞培养10~14天后,弃去培养基,用PBS洗涤,加入1ml/孔新鲜配制的0.5%结晶紫甲醇溶液室温固定、染色30min;(D)弃去结晶紫甲醇液染色液,用PBS轻柔洗涤残存染色液,室温晾干;(E)通过九宫格方法计算细胞数大于50个的细胞克隆群。
(6)结果:如图5,CCK8法实验结果显示,敲降METTL2后HCT116细胞的增殖能力与对照组相比没有明显改变,过表达METTL2对HT-29细胞的增殖能力也没有明显影响。平板克隆形成实验结果与CCK8法结果一致。结论:METTL2不影响结直肠癌细胞的增殖能力。
实施例4:在体外培养细胞中METTL2对5-FU敏感性的影响
(1)通过CCK8法(见实施例1)和平板克隆形成实验(见实施例3)检测稳定敲降METTL2的细胞(HCT116/sh1和HCT116/sh2、SW620/sh1和SW620/sh2)或阴性对照细胞株(HCT116/shNC、SW620/shNC)、稳定过表达细胞株(HT-29/METTL2)和空载体对照细胞株(HT-29/Vec)对5-FU的敏感性。
(2)结果:如图6所示,CCK8法实验结果显示,敲降METTL2细胞株5-FU的IC50值和相对耐药指数明显高于对照细胞株,过表达METTL2细胞株IC50值和相对耐药指数明显低于对照细胞株(图6A);克隆形成实验结果显示,5-FU处理后敲降METTL2细胞株克隆数比对照细胞株克隆数多,过表达细胞株克隆数显著少于载体对照细胞(图6B)。这些结果证明METTL2能增强结直肠癌细胞对5-FU的敏感性。
实施例5:在裸鼠移植瘤模型中METTL2对5-FU敏感性的影响
将BALB/c裸鼠(4-5周龄,14-18g,购自上海斯莱克实验动物中心)分成五组,分别在皮下移植稳定敲降METTL2的HCT116/sh1、HCT116/sh2(HCT116/shNC为阴性对照)、以及稳定过表达METTL2的HT-29/METTL2细胞(HT-29/Vec为空载体对照)进行皮下成瘤。在瘤块长成后,取出瘤块并均分成1-2mm3,将这些小瘤块分别移植到各组裸鼠体内。一周后,按照每天0.025mg/g的5-FU剂量进行治疗(以等体积的生理盐水为对照组),连续给药5天、停药2天,再重复2周。在给予5-FU治疗期间,每3天测量肿瘤体积一次,共3周的治疗后处死小鼠,剥离肿瘤组织并称重,计算各组的抑瘤率。
结果如图7所示。5-FU治疗对敲降METTL2的HCT116移植瘤的抑瘤率(9%和2%)远远低于对照组(55%),而5-FU对过表达METTL2的HT-29移植瘤的抑瘤率(78%)显著高于空载体对照组(32%)。而对于没有5-FU处理的稳定敲降以及稳定过表达实验组,两组与各自的对照组相比,肿瘤的重量均没有明显差异。上述研究结果说明,METTL2可以明显增强结直肠癌移植瘤的5-FU敏感性,但不影响结直肠癌移植瘤的生长,可见,METTL2在动物体内能增强结直肠癌细胞对5-FU的敏感性。
实施例6:METTL2表达水平在评估接受5-FU治疗的结直肠癌患者预后的临床价值
本研究通过中山大学肿瘤防治中心伦理审查委员会的伦理审查批准,并获取患者的书面知情同意。我们收集了中山大学肿瘤防治中心2007年至2011年入院的结直肠癌患者。通过以下条件进行筛选研究的病例117例。筛选条件具体为:①患者在我院首次确诊为II期或III期结直肠癌患者,术前没有接受新辅助治疗;②术后均进行含5-FU药物的辅助化疗,没有并行放疗处理;③患者拥有完整的临床病理资料。患者的病例随访资料均来源于我院的随访科。我们调取了患者的临床信息包括,年龄、性别、病理类型、临床分期、肿瘤指标(CEA,CA19-9)以及化疗方案。其中评估患者的临床分期根据第八版AJCC(American JointCommittee on Cancer)的TNM分期。治疗后患者接受常规随访。通过免疫组化检测118例结直肠癌患者的手术肿瘤标本中METTL2表达情况。
免疫组化实验:(A)4-5μM石蜡切片常规脱蜡和水化,用0.3%H2O2的甲醇溶液除去过氧化物酶,即用型羊血清封闭液封闭,用微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH=6.0)修复抗原;(B)采用Dako DAB免疫组化试剂盒进行METTL2蛋白染色,苏木素复染;(C)采用1%盐酸酒精分化,浓度递增的乙醇脱水,中性树脂封片,于通风橱中自然风干24小时后在显微镜下观察。
免疫组化完成后,两位病理医生对组织切片染色结果进行双盲阅片评分。采用半定量的方法判断结果,确定5个视野(100×)的染色比例和染色强度。染色强度分为无色(阴性,0分)、浅黄色(弱阳性,1分)、黄色(阳性,2分)和棕黄色(强阳性,3分)(如图8A所示)。染色比例分为<5%(0分)、5%-25%(1分)、26%-50%(2分)、51%-75%(3分)、76%-100%(4分)。染色总分为5个视野染色强度分值与染色面积分值乘积的平均数。
对上述117例患者进行单因素Kaplan-Meier生存分析检测METTL2表达是否影响接受含5-FU化疗的结直肠癌患者的总生存期(Overall Survival,OS)和无病生存期(Disease-free survival,DFS)。结果如图8B所示,高表达METTL2与接受含氟尿嘧啶辅助化疗的结直肠癌患者的良好预后呈正相关(总体生存OS,p=0.0056;无病生存DFS,p=0.0222)。多因素COX回归相分析结果如下表5所示,其中:n=117,METTL2表达高低是这类患者的独立预后因素。
表5:
表5的多因素COX回归相分析结果提示,METTL2表达高低是接受含氟尿嘧啶辅助化疗的结直肠癌患者的独立预后因素。
上述实施例为本发明代表性的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中山大学肿瘤防治中心(中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所)
<120> METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物治疗敏感性的试剂盒中的应用
<160> 65
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> 引物1-F
<400> 1
gcagtcctcg ccgataagag 20
<210> 2
<223> 引物1-R
cttccgacca ctccacattg t 21
<210> 3
<223> 引物2-F
atgcctggga caatgtggag 20
<210> 4
<223> 引物2-R
cacacccgct ggatactgtt 20
<210> 5
<223> 引物3-F
ccgaatactg gaggttggct 20
<210> 6
<223> 引物3-R
cttgggcact gggtaactct 20
<210> 7
<223> 引物4-F
cgtcttccac cacaatgcct 20
<210> 8
<223> 引物4-R
cctggacttt tctctccgcc 20
<210> 9
<223> 引物5-F
gctggcacct agccaaaatc 20
<210> 10
<223> 引物5-R
attcggtagg tggctgagga 20
<210> 11
<223> 引物6-F
ctgggacaat gtggagtggt 20
<210> 12
<223> 引物6-R
cttgtttctc ctggcacacc 20
<210> 13
<223> 引物7-F
ctggacacgc ttttcaccac 20
<210> 14
<223> 引物7-R
acagaagggg cttgcagtat 20
<210> 15
<223> 引物8-F
gacatggctc agcttcggtt 20
<210> 16
<223> 引物8-R
gtggtgaaaa gcgtgtccag 20
<210> 17
<223> 引物9-F
gccgataaga ggcagcagtt 20
<210> 18
<223> 引物9-R
attgtcccag gcattgtggt 20
<210> 19
<223> 引物10-F
caagaggaac tggacacgct 20
<210> 20
<223> 引物10-R
ggggcttgca gtatttgcac 20
<210> 21
<223> 引物11-F
accgaatact ggaggttggc 20
<210> 22
<223> 引物11-R
acaggtcgtg aacaaaggca 20
<210> 23
<223> 引物12-F
tggacacgct tttcaccact 20
<210> 24
<223> 引物12-R
gacagaaggg gcttgcagta 20
<210> 25
<223> 引物13-F
cctgggacaa tgtggagtgg 20
<210> 26
<223> 引物13-R
cacccgctgg atactgttct 20
<210> 27
<223> 引物14-F
tcctcagcca cctaccgaat 20
<210> 28
<223> 引物14-R
cacaggtcgt gaacaaaggc 20
<210> 29
<223> 引物15-F
atcctcagcc acctaccgaa 20
<210> 30
<223> 引物15-R
ccttgggcac tgggtaactc 20
<210> 31
<223> 引物16-F
tgggacaatg tggagtggtc 20
<210> 32
<223> 引物16-R
acccgctgga tactgttctc 20
<210> 33
<223> 引物17-F
acaagaggaa ctggacacgc 20
<210> 34
<223> 引物17-R
gggcttgcag tatttgcact 20
<210> 35
<223> 引物18-F
caccactgct ggactggaaa 20
<210> 36
<223> 引物18-R
aaggggcttg cagtatttgc 20
<210> 37
<223> 引物19-F
gcagaaggct atcaacaggc 20
<210> 38
<223> 引物19-R
cagcagtggt gaaaagcgtg 20
<210> 39
<223> 引物20-F
gacacgcttt tcaccactgc 20
<210> 40
<223> 引物20-R
gacagaaggg gcttgcagta t 21
<210> 41
<223> 引物F
agaaggctgg ggctcatttg 20
<210> 42
<223> 引物R
aggggccatc cacagtcttc 20
<210> 43
<223> 正向引物
tacaaaatac gtgacgtaga aa 22
<210> 44
<223> 反向引物
tttgtttttg taattcttta 20
<210> 45
<223> Barcode-1-F
tgaccaaatg gactatcata tgcttaccgt 30
<210> 46
<223> Barcode-1-R
tgaccaacta ttctttcccc tgcactgt 28
<210> 47
<223> Barcode-2-F
gccaataatg gactatcata tgcttaccgt 30
<210> 48
<223> Barcode-2-R
gccaatacta ttctttcccc tgcactgt 28
<210> 49
<223> Barcode-3-F
cttgtaaatg gactatcata tgcttaccgt 30
<210> 50
<223> Barcode-3-R
cttgtaacta ttctttcccc tgcactgt 28
<210> 51
<223> Barcode-4-F
acagtgaatg gactatcata tgcttaccgt 30
<210> 52
<223> Barcode-4-R
acagtgacta ttctttcccc tgcactgt 28
<210> 53
<223> Barcode-5-F
cgatgtaatg gactatcata tgcttaccgt 30
<210> 54
<223> Barcode-5-R
cgatgtacta ttctttcccc tgcactgt 28
<210> 55
<223> Barcode-6-F
cagatcaatg gactatcata tgcttaccgt 30
<210> 56
<223> Barcode-6-R
cagatcacta ttctttcccc tgcactgt 28
<210> 57
<223> shNC的靶向序列
gcgacgatct gcctaagat 19
<210> 58
<223> shMETTL2-1的靶向序列
gtccagacaa attcagaata t 21
<210> 59
<223> shZNF365的靶向序列
ctacgaagaa agaaccctct t 21
<210> 60
<223> shCEP68的靶向序列
gcagctttac cggcaattta a 21
<210> 61
<223> shIFT122的靶向序列
ctactttact aaaggcgagt a 21
<210> 62
<223> shBEST2的靶向序列
ctctttcact atgactggat t 21
<210> 63
<223> shNC的靶序列
gcgacgatct gcctaagat 19
<210> 64
<223> shMETTL2-1的靶序列
gtccagacaa attcagaata t 21
<210> 65
<223> shMETTL2-2的靶序列
gtcagtgtct atctggaaat t 21
Claims (10)
1.METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物治疗敏感性的试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物治疗敏感性的试剂盒中的应用,其特征在于:所述的氟尿嘧啶类药物为5-FU和Capecitabine中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物治疗敏感性的试剂盒中的应用,其特征在于:所述的试剂盒包括检测METTL2 mRNA量的试剂和检测METTL2蛋白量的试剂中的一种或两种。
4.根据权利要求3所述的METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物治疗敏感性的试剂盒中的应用,其特征在于:所述的检测METTL2 mRNA量的试剂为能进行反转录-实时荧光定量PCR的试剂。
5.根据权利要求4所述的METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物治疗敏感性的试剂盒中的应用,其特征在于:所述的能进行反转录-实时荧光定量PCR的试剂包括依据METTL2 mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引物。
6.根据权利要求5所述的METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物治疗敏感性的试剂盒中的应用,其特征在于:所述的能进行反转录-实时荧光定量PCR的试剂还包括依据内参基因mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引物。
7.根据权利要求5和6所述的METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物治疗敏感性的试剂盒中的应用,其特征在于:
所述的依据METTL2 mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引包括核苷酸序列如SEQID NO.1~40所示的20对引物对中的任一对;核苷酸序列如SEQ ID NO.1~40所示的引物名称中第一个数字相同为同一对引物;
所述的依据内参基因mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.41~42所示的引物对。
8.根据权利要求3~7任一项所述的METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物治疗敏感性的试剂盒中的应用,其特征在于:
所述的能进行反转录-实时荧光定量PCR的试剂为组合试剂A和组合试剂B中的至少一种;其中,组合试剂A为依据探针法得到的组合试剂,包括但不限于:依据METTL2 mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引物、依据METTL2 mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的探针、依据内参基因mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引物、依据内参基因mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的探针;所述的探针进一步为TaqMan探针;
组合试剂B为依据染料法得到的组合试剂,包括但不限于:依据METTL2 mRNA设计的用于实时荧光定量PCR的引物、依据内参基因mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引物和染料;所述的染料进一步为SYBR Green。
9.根据权利要求3所述的METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物治疗敏感性的试剂盒中的应用,其特征在于:所述的检测METTL2蛋白量的试剂为能进行WESTERN BLOT的试剂和能进行免疫组化染色的试剂中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物治疗敏感性的试剂盒中的应用,其特征在于:
所述的能进行WESTERN BLOT的试剂包括但不限于:抗METTL2抗体、抗内参蛋白抗体、通用二抗及显色和发光试剂;
所述的能进行免疫组化染色的试剂包括但不限于:抗METTL2抗体、通用二抗及显色试剂。
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CN111518909B (zh) | 2022-07-01 |
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