CN114392266B

CN114392266B - 包含PPARγ抑制剂的药物组合物及其应用

Info

Publication number: CN114392266B
Application number: CN202210075688.4A
Authority: CN
Inventors: 潘颖; 李瑞满; 刘海智; 韩小雪; 邱迪
Original assignee: First Affiliated Hospital of Jinan University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Jinan University
Priority date: 2022-01-22
Filing date: 2022-01-22
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2042-01-22
Also published as: CN114392266A

Abstract

本发明提供了一种包含PPARγ抑制剂的用于促进神经元分化和治疗神经元分化障碍的药物组合物及其应用。本发明对PPARγ在高糖环境下神经元分化过程中的作用及机制进行明确揭示。发现PPARγ与细胞自噬活动存在调节作用，其能够介导细胞自噬过程，进而抑制神经元分化，影响神经***正常发育；而在干扰PPARγ后则可以显著降低细胞内PPARγ的表达，同时明显抑制细胞的自噬过程，进而促进神经元的分化。揭示了PPARγ调控高糖环境下神经元分化的新机制，为临床干预和治疗妊娠糖尿病引起的相关神经性疾病提供了切实的实验证据和研究方向。

Description

包含PPARγ抑制剂的药物组合物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种包含PPARγ抑制剂的药物组合物及其应用，特别是涉及一种包含PPARγ抑制剂的用于促进神经元分化和治疗神经元分化障碍的药物组合物及其应用。

背景技术

糖尿病是由遗传和环境等多种因素相互作用而引起的一组代谢综合征，以慢性高血糖为主要临床特征。妊娠合并糖尿病是妊娠期最常见的内科并发症之一，长期的高血糖状态导致眼底肾脏等的全身微血管病变；心、脑等大血管病变和神经病变等慢性进行性改变。随着社会经济的发展，妊娠合并糖尿病的患者日益增加。

妊娠合并糖尿病对孕妇及胎儿造成的影响，随着母体血糖升高出现的时间及孕期血糖水平密切相关。在孕早期可能导致胎儿先天畸形、流产、早起生长受限等并发症。常见的胎儿畸形有：神经管畸形、心脏畸形、肾脏畸形、消化道畸形以及唇腭裂等。在孕中、晚期可能出现巨大儿、肺发育延迟、中枢神经***发育迟缓、宫内死胎等。由于妊娠期母体糖代谢紊乱，有碍于胎儿脑部的正常发育，新生儿脑发育成熟程度落后于同龄儿，严重的可能出现各种新生儿行为智力障碍。

大量研究表明，在出生以后的神经发育过程中也出现一系列的问题，学者认为这种后果归因于小儿在孕期暴露于糖代谢紊乱的环境而导致的脑发育异常及脑损伤，大多表现为：运动落后、肌张力异常、语言和动眼功能障碍、社会适应能力差、注意力不集中、记忆障碍等。成年后出现肥胖、糖耐量异常，进而出现糖尿病、代谢综合征等严重影响生活的疾病。

高血糖往往会引起严重并发症，例如在糖尿病性神经病、肾病和视网膜病的发生中起重要作用。糖尿病性神经病是长时间暴露于高葡萄糖导致的神经元损伤。最近的研究则表明，预计到2030年，将会有大约2-3千万的人患有糖尿病性神经病。糖尿病性神经病是一种多功能疾病，由于多重信号通路的同时参与，其发病机理异常复杂。

自噬（Autophagy）是一种溶酶体降解的整体途径，参与长寿蛋白和细胞质细胞器的回收。其收到丝氨酸/苏氨酸激酶mTOR的负调控，是细胞生长和代谢的关键过程，其最终可产生大分子来维持细胞体内稳态。截止目前为止，已经鉴定出超过30种自噬相关（Atg）基因，这些基因在真核生物中高度保守，例如Atg蛋白家族、LPC-I、LPC-II、Beclin-1、p62等等。在诱导自噬时，Beclin、LC3-I向LC3-II的转化指示自噬体的形成，因此被广泛用作自噬体形成的标记。该途径在很大程度上取决于溶酶体的活性，自噬体的溶酶体降解中的任何缺陷都可能导致其积累，损害细胞功能，并可能通过蛋白酶激活而导致细胞死亡。

神经元分化对于胎儿大脑发育至关重要，而自噬水平则严重影响神经元由干细胞向神经元的分化。胚胎干细胞是早期胚胎中存在的多能干细胞，具有分化为主要胚层的能力。自噬水平的调控对于干细胞分化及其关键，电子显微镜观测显示不健康的干细胞分化时有受损的自噬体形成，表明自噬途径受阻，体积减小蛋白质降解。关键基因比如自噬基因Ambra1的纯合突变也引起小鼠胚胎致死，其在胚胎干细胞中的功能缺陷导致严重的神经管缺陷，所有这些都与自噬功能障碍和失调有关。

现有的研究表明高糖可抑制神经干细胞的分化，但其具体分子机制尚不明确，而自噬活动在神经干细胞分化过程中的作用则需要进行进一步研究。因此研究及阐明糖尿病神经病的发展和进展及其以发病机制为导向的药物治疗靶点的关键分子途径具有十分重要的意义，对于临床预防妊娠糖尿病引起的神经性病变具有重要的理论指导作用。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中所存在的上述问题，从而针对糖尿病尤其是妊娠糖尿病中高糖与神经元分化、糖尿病性神经病等的相关功能和机制进行了深入研究，揭示了通过调控目标靶点PPARγ的活性从而有效调节由于高糖导致的神经元分化障碍的新机制，为临床干预和治疗妊娠糖尿病引起的相关神经性疾病提供了切实的实验证据和科学依据。

为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。

本发明第一方面提供了一种用于促进神经元分化的药物组合物，包括PPARγ抑制剂。

作为优选地，所述PPARγ抑制剂选自基于PPARγ基因设计的shRNA（shPPARγ）。

作为优选地，所述shPPARγ选自shPPARγ-1、shPPARγ-2、shPPARγ-3中的一种或多种；所述shPPARγ-1、shPPARγ-2、shPPARγ-3的序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示。

本发明第二方面提供了一种治疗神经元分化障碍的药物组合物，包括PPARγ抑制剂。

作为优选地，所述神经元分化障碍为糖尿病性神经元分化障碍。

作为优选地，所述糖尿病性神经元分化障碍为妊娠糖尿病性神经元分化障碍。

本发明第三方面提供了PPARγ抑制剂在制备抑制高糖诱导的细胞自噬的药物中的应用。

本发明第四方面提供了PPARγ抑制剂在制备治疗神经元分化障碍的药物中的应用。

本发明第五方面提供了PPARγ抑制剂在制备促进神经元分化的药物中的应用。

过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）是一种II型核受体家族，包括三个同种型（α，β/δ和γ）。PPAR在组织中普遍表达，呈现细胞类型和发育阶段特异性。它们的转录活性受类固醇和脂质代谢产物的调节，并且每个成员负责脂质和能量代谢的独特基因子集。PPAR的活性还受翻译后修饰的调控。在中枢神经***（CNS）中，PPAR在所有神经细胞类型中均表达，PPAR调节许多生理过程，例如能量代谢，氧化还原稳态，自噬，细胞周期和分化等。在急性或慢性中枢神经***损伤后，PPARs参与包括神经炎症、抗氧化反应和生存/神经退行性机制在内的各种途径的调节。到目前为止，大多数研究都涉及γ同型，而很少涉及PPARα和β/δ的作用。对于PPARγ是否参与神经元分化调节，是否参与高糖诱导的自噬调节，现有研究中则鲜有报道。

本发明发明人为了阐明妊娠合并糖尿病引起的高血糖症对胎儿神经***发育的影响，进行了大量研究，发现高糖显著诱导自噬分子Beclin-1表达，抑制p62的表达；且PPARγ的表达水平显著升高。这些结果表明，高糖环境可诱导神经干细胞前体细胞发生自噬，诱导其死亡，阻碍其向神经元分化，而且PPARγ参与了该调控过程。进一步地研究发现，通过对PPARγ进行抑制，能够有效恢复GFAP和Tuj1的水平，并下调Beclin-1的表达水平，使得P62和LC3 II/LC3 I的水平趋向正常，充分证明了PPARγ对于高糖诱导产生的细胞自噬活动和神经元分化的调节作用，即通过抑制PPARγ活性能够显著抑制细胞自噬过程，促进神经元分化，避免由于高糖导致的神经性疾病的发生。

本发明相对于现有技术具有如下技术效果：

（1）本发明对妊娠高血糖对神经元分化的影响进行了深入研究，发现了高糖可以显著诱导自噬分子的表达，抑制神经元分化，影响胎儿神经***正常发育；

（2）本发明明确了PPARγ所介导的高糖条件下对神经元分化影响具体作用机制，即高糖环境下会使得PPARγ表达水平显著增高，从而诱导神经干细胞前体细胞发生自噬，诱导其死亡，阻碍其向神经元分化，进而神经***发育；

（3）本发明发现通过对PPARγ表达的抑制，能够有效恢复GFAP和Tuj1的水平，并下调Beclin-1的表达水平，使得P62和LC3 II/LC3 I的水平趋向正常，显著抑制细胞自噬过程的发生，进而促进神经元的分化；揭示了通过调控目标靶点PPARγ的活性从而有效调节由于高糖导致的神经元分化障碍的新机制，为临床干预和治疗妊娠糖尿病引起的相关神经性疾病提供了切实的实验证据和科学依据。

附图说明

图1为P19小鼠神经干细胞样细胞向神经元分化模型图。

图2为高糖对神经元干细胞中Tuj1蛋白表达的影响示意图。

图3为高糖对神经元干细胞中Tuj1蛋白表达的影响定量结果示意图。

图4为高糖对神经元干细胞中Tuj1 mRNA表达的影响定量分析结果示意图。

图5为高糖对神经元干细胞中GFAP蛋白表达的影响示意图。

图6为高糖对神经元干细胞中GFAP蛋白表达的影响定量分析结果示意图。

图7为高糖对神经元干细胞中GFAP mRNA表达的影响定量结果示意图。

图8为高糖对神经元干细胞凋亡影响流式结果示意图。

图9为高糖对神经元干细胞凋亡影响定量分析结果示意图。

图10为高糖对细胞自噬相关生物标记物表达影响结果示意图。

图11为高糖对细胞自噬相关生物标记物表达影响定量分析结果示意图。

图12为shPPARγ对神经元干细胞中PPARγ蛋白表达影响结果示意图。

图13为shPPARγ对神经元干细胞中PPARγ蛋白表达影响定量分析结果示意图。

图14为shPPARγ-1对高糖环境下神经元干细胞中Tuj1和GFAP蛋白表达影响结果示意图。

图15为shPPARγ-1对高糖环境下神经元干细胞中Tuj1和GFAP蛋白表达影响定量分析结果示意图。

图16为shPPARγ-1对高糖环境下细胞自噬相关生物标记物表达影响结果示意图。

图17为shPPARγ-1对高糖环境下细胞自噬相关生物标记物表达影响定量分析结果示意图。

图18为shPPARγ-1对高糖环境下P19细胞分化影响结果示意图。

图19为shPPARγ-1对高糖环境下P19细胞分化影响定量分析结果示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在无特别说明的情况下，本发明上下文中所列出的包括P19神经干细胞样细胞等细胞工具均市售获得并根据细胞生物学中的常规方法进行培养。所有细胞系均通过中国典型培养物保藏中心（武汉）的短串联重复分析鉴定，并使用PCR检测试剂盒（上海BiothriveSci）验证是否存在支原体污染，同时在液氮中冷冻保存并用于后续实验。本发明所使用的试剂中，均通过市售获得。本发明所使用的实验方法和技术，例如P19细胞培养、Westernblot、分子克隆、PCR、免疫荧光染色、激光共聚焦、流式细胞术及动物实验等均为本领域的常规方法和技术。

生物学实验重复中选择具有代表性的结果呈现在上下文附图中，数据按照图示中规定的以mean±SD和mean±SEM展示。所有实验至少重复三次。数据采用GraphPad Prism5.0或SPSS 20.0软件进行分析。采用t检验或方差分析比较两组或两组以上的平均值差异。p＜0.05被认为是一个显著的差异。

实施例1 高糖环境对神经元干细胞分化的影响

（1）向P19小鼠神经干细胞样细胞中加入视黄酸（RA），构建P19细胞向神经元的分化模型（如图1所示）；

（2）将步骤（1）细胞模型分为两组，其中组1为对照组，通过正常条件进行培养（正常葡萄糖，5mM），组2为高糖组，给予高糖培养条件（高浓度葡萄糖，30mM），从而模拟妊娠高血糖症，观测高糖对神经元干细胞分化的影响；

（3）在给予高糖后，分别在诱导细胞分化后的第3天、第5天和第7天通过Westernblot检测两组细胞中Tuj1和GFAP的mRNA及蛋白表达水平，分析细胞生长情况。

结果如图2-7所示。结果显示，在进行高糖处理后，处于高糖环境下的P19细胞中，无论是神经元特异表达的Tuj1还是胶质神经元的标记物GFAP的mRNA或是蛋白表达水平均出现了明显下调，差异具有统计学意义。从而证明高糖环境能够对神经元细胞的分化过程产生明显的抑制作用。

进一步地，利用流式细胞仪对P19细胞进行分析发现，高糖组的细胞存活率明显低于正常对照组（参见图8-9），差异具有统计学意义。从而证明了高糖能够显著诱导神经元干细胞的凋亡。

实施例2 高糖对细胞自噬功能的影响

（1）向P19小鼠神经干细胞样细胞中加入视黄酸（RA），构建P19细胞向神经元的分化模型；

（3）在给予高糖后，分别在诱导细胞分化后的第7天通过Western blot检测两组细胞中P62、Beclin-1和PPARγ的蛋白表达水平。

结果如图10-11所示。结果显示，高糖处理环境下的神经元细胞内PPARγ和Beclin-1水平显著上调，P62水平显著降低，差异具有统计学意义。在细胞自噬过程中，P62水平往往与自噬活性密切相关，P62水平升高通常被认为是自噬活性受到抑制的标志，P62水平降低则意味着自噬过程的发生。Beclin-1同样为自噬体形成过程中的一个必须分子，其能够介导其他自噬蛋白定位于吞噬泡，从而调控自噬体的形成与成熟，在自噬过程中Beclin-1的表达水平往往会显著升高。由上述结果可以明确，高糖环境可以显著诱导自噬分子Beclin-1的表达，同时抑制P62的表达。上述结果共同表明了，高糖环境可以诱导神经干细胞前体细胞发生自噬，诱导其死亡，阻碍其向神经元的分化，而PPARγ则可能为该过程的关键调控因子之一。

实施例3 PPARγ抑制剂对神经元分化的调节作用研究

（1）针对PPARγ的mRNA序列设计并合成了shRNA，分别为shPPARγ-1（序列如SEQID NO：1所示）、shPPARγ-2（序列如SEQ ID NO：2所示）、shPPARγ-3（序列如SEQ ID NO：3所示）；

（2）随后将针对PPARγ设计的干扰序列装载至pLK.0慢病毒载体上，基因测序鉴定装载是否成功。然后将P19细胞以1×10⁵/ml密度接种到10cm培养皿中，第二天更换培养基为OPTI-MEM培养基；

（3）分别取shPPARγ-1、shPPARγ-2、shPPARγ-3和shNC载体按质粒和转染试剂质量体积1:2的比例进行转染，6小时后更换培养基为完全培养基；

（4）提取转染有shPPARγ-1、shPPARγ-2、shPPARγ-3以及shNC（空载体）的P19细胞的蛋白，利用Western blot检测其中PPARγ蛋白表达水平。

结果如图12-13所示。结果显示，对于转染有shPPARγ-1和shPPARγ-3的P19细胞，其细胞内PPARγ蛋白活性得到了显著抑制，其相对于空载体组差异具有统计学意义，从而证明shPPARγ-1和shPPARγ-3能够对PPARγ的表达及活性产生明显的抑制作用。

随后，对高糖环境下shPPARγ对神经元分化相关蛋白的作用进行研究，具体步骤如下：

（2）将步骤（1）细胞模型分为四组，其中组1为对照组，通过正常条件进行培养（正常葡萄糖，5mM），组2为高糖组，给予高糖培养条件（高浓度葡萄糖，30mM），组3为转染有空白载体（shNC）的P19细胞，并用高糖条件进行培养（高浓度葡萄糖，30mM），组4为转染有shPPARγ-1的P19细胞，并用高糖条件进行培养（高浓度葡萄糖，30mM）；

（3）在给予高糖后，分别在诱导细胞分化72h后通过Western blot检测两组细胞中Tuj1和GFAP的蛋白表达水平。

结果如图14-15所示。结果显示，高糖条件下，组2和组3细胞内神经元特异表达的Tuj1及胶质神经元的标记物GFAP的蛋白表达水平均受到明显抑制；而组4细胞在转染shPPARγ-1对PPARγ进行有效抑制后，Tuj1及GFAP的表达活性均获得显著上调，甚至高出于空白对照组1，其中组4与组2或组3的水平差异均具有统计学意义。

进一步地，对高糖环境下shPPARγ对自噬功能的作用进行研究，具体步骤如下：

（3）在给予高糖后，分别在诱导细胞分化72h后通过Western blot检测两组细胞中PPARγ、Beclin-1、LC3 I、LC3 II和P62的蛋白表达水平。

结果如图16-17所示。结果显示，组2和组3细胞内PPARγ、Beclin-1、LC3 II水平明显上调，LC3 I和P62水平明显下调，LC3 II/LC3 I比值明显升高，从而可以明确在组2和组3细胞内自噬程度显著增高。而在转染有shPPARγ的组4细胞中，PPARγ、Beclin-1、LC II水平明显下调，LC3 I和P62水平明显上调，LC3 II/LC3 I比值明显降低趋于正常，甚至低于空白对照组1，由此可以明确shPPARγ能够显著抑制细胞内的自噬过程。

高糖处理环境下的神经元细胞内PPARγ和Beclin-1水平显著上调，P62水平显著降低，差异具有统计学意义。

高糖条件下，组2和组3细胞内神经元特异表达的Tuj1及胶质神经元的标记物GFAP的蛋白表达水平均受到明显抑制；而在转染shPPARγ-1对PPARγ进行有效抑制后，Tuj1及GFAP的表达活性均获得显著上调，甚至高出于空白对照组1，其中组4与组2或组3的水平差异均具有统计学意义。

更进一步地，对高糖环境下shPPARγ对高糖环境下神经元分化的作用进行研究，具体步骤如下：

（1）将P19细胞以1×10⁵/ml接种到10cm的培养皿中，用含5%胎牛血清和0.5μM反式视黄酸的αMEM 培养P19细胞诱导液；

（2）第二天更换诱导液并连续培养四天诱导P19细胞分化；

（3）在第四天时用胰蛋白酶消化细胞团并吹打成单个细胞，并使用Neurobasal和B27成熟神经元培养基培养细胞。

结果如图18-19所示。结果显示：高糖条件下，P19细胞分化为阳性神经元的百分比降低，而在转染shPPARγ-1对PPARγ进行有效抑制后，P19细胞分化为阳性神经元的占比得以恢复。这提示高糖抑制P19细胞向神经元的分化，而抑制PPARγ则会恢复P19细胞分化神经元的潜能。

综合上述结果，本发明对PPARγ在高糖环境下神经元分化过程中的作用及机制进行明确揭示。发现PPARγ与细胞自噬活动存在调节作用，其能够介导细胞自噬过程，进而抑制神经元分化，影响神经***正常发育；而在干扰PPARγ后则可以显著降低细胞内PPARγ的表达，同时明显抑制细胞的自噬过程，进而促进神经元的分化。揭示了PPARγ调控高糖环境下神经元分化的新机制，为临床干预和治疗妊娠糖尿病引起的相关神经性疾病提供了切实的实验证据和研究方向。

以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 暨南大学附属第一医院(广州华侨医院)

<120> 包含PPARγ抑制剂的药物组合物及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagctgaccc aatggttgct gatta 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccaagaatac caaagtgcga tcaaa 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccactatgga gttcatgctt gtgaa 25

Claims

1.PPARγ抑制剂在制备治疗糖尿病性神经元分化障碍的药物中的应用，其特征在于，所述PPARγ抑制剂选自基于PPARγ基因设计的shPPARγ-3，所述shPPARγ-3的序列如SEQID NO：3所示。

2.PPARγ抑制剂在制备促进糖尿病患者神经元分化的药物中的应用，其特征在于，所述PPARγ抑制剂选自基于PPARγ基因设计的shPPARγ-3，所述shPPARγ-3的序列如SEQ IDNO：3所示。