CN103648531A - 用于预防或治疗代谢综合症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明旨在提供一种用于预防或治疗代谢综合症的方法，其可以通过抑制巨噬细胞浸润进入脂肪组织中在上游停止代谢综合症中类似多米诺效应的疾病链。本发明提供了一种用于预防或治疗代谢综合症的方法，该方法包括将AIM抑制剂施用到对象的步骤。

Description

用于预防或治疗代谢综合症的方法
技术领域
本发明涉及一种预防或治疗代谢综合征的方法，该方法包括将AIM抑制剂施用到对象。
背景技术
通常，已知诸如糖尿病、高血脂症、高血压和肥胖症的与生活方式相关的疾病经常聚集于一个人。尽管这些疾病有分别成为动脉硬化症的风险，但是当聚集时，风险变得非常高。因此，已经提出了多个名称以表示这些疾病聚集的病理。
目前，用标准名称-代谢综合症来表示包括糖尿病、高血脂症、高血压、肥胖症和胰岛素抗性作为基本构成要素的疾病概念，其中，这些疾病经常聚集于一个人并使导致动脉硬化疾病的风险变高。
通常，在代谢综合症中，内脏脂肪型肥胖症，即腹腔内过量聚集中性脂肪的肥胖症，是核心病理。由肥胖症引起的胰岛素抗性相继引发高血压、糖尿病、高血脂症等，它们的聚集和联系引发动脉硬化疾病。这种现象被比作多米诺效应，近些年提出了“代谢多米诺”的概念。
也就是说，就像一旦开始倾倒就难以恢复的多米诺效应一样，一系列病理朝一个方向行进，并且长期地以持续的方式慢性地引发各种疾病。
代谢综合征的治疗不以症状的减缓为目的，而是以预防各种疾病尤其是后来可能引发的动脉硬化疾病的起始为目的。
如上所述，在代谢多米诺的概念下，由于一旦开始，行进就难以恢复到原来的状态，所以期望在上游抑制行进。
迄今进行的研究已经阐明，在代谢综合征中，当过量的中性脂肪聚集在腹腔内的脂肪细胞中时，由于发生来自脂肪细胞的脂肪细胞因子的分泌量异常、血液游离脂肪酸的增加以及脂肪组织的慢性炎症，所以诸如胰岛素抗性、糖尿病、高血脂症、高血压等与生活方式相关的疾病以及继发的疾病像链式反应一样被引发。
因此，在代谢综合症的预防或治疗中，优选考虑以诸如脂肪细胞因子的分泌、血液游离脂肪酸和脂肪组织的慢性炎症的上游事件为目标。
在它们之中，已经阐明脂肪组织的慢性炎症的发生是由于伴随肥胖症浸润进入脂肪组织的巨噬细胞增加（参见，例如，非专利文献1和2）。
巨噬细胞的活化状态包括两种：M1和M2。M1也被称作经典活化巨噬细胞，并表现出使诸如TNF-α、IL-6和IL-12等的炎性细胞因子和诱导性一氧化氮合成酶（iNOS）的产生增加。M2也被称作替代活化巨噬细胞，并表现出使炎性细胞因子的产生下降并使诸如IL-10等的抗炎性细胞因子和抑制iNOS活性的精氨酸酶的产生增加。
已知在非肥胖症的情况下，浸润进入脂肪组织的巨噬细胞主要是M2，而随着肥胖症的行进主要是M1（参见，例如，非专利文献3）。
也已经报道，在巨噬细胞特异性PPARγ-缺陷小鼠中，不存在M2并且高脂肪饮食诱发的肥胖症和胰岛素抗性增强（非专利文献4）；巨噬细胞PPARγ的失活导致在正常饮食的不肥胖小鼠的骨骼肌和肝脏中葡萄糖耐受性和胰岛素抗性的下降（非专利文献5）；巨噬细胞特异性Cap（Cbl相关蛋白质）缺陷小鼠表现出脂肪组织中巨噬细胞浸润的下降以及由高脂肪饮食负荷（high-fat diet loading）导致的胰岛素抗性的表达减弱（非专利文献6）；等等。因此，暗示了浸润进入脂肪组织的巨噬细胞M1在胰岛素抗性的表达中发挥着重要的作用。
脂肪组织的慢性炎症在代谢综合症的发生中的深度参与与许多代谢综合症患者是高敏CRP阳性的报道一致，这表明轻度炎症的存在以及具有抗炎作用的水杨酸和噻唑烷药剂的施用改善了胰岛素抗性。
此外，同野生型小鼠相比，在CCR2（C-C趋化因子受体2）敲除小鼠中，对与肥胖症相关的脂肪细胞因子的产生的异常控制（abnormal control）得到改善，其中，CCR2敲除小鼠表现出巨噬细胞进入脂肪组织的浸润的下降（非专利文献7）。因此，认为浸润进入脂肪组织的巨噬细胞也参与脂肪细胞因子的产生的瓦解控制（collapsed control）。
综上所述，认为在代谢综合症的预防或治疗中，通过以浸润进入脂肪组织的炎性巨噬细胞为目标，能够在诸如脂肪组织中的慢性炎症和脂肪细胞因子产生的瓦解控制的代谢多米诺的最上游的位点停止代谢多米诺的行进。
然而，还未阐明伴随肥胖症的巨噬细胞诱导进入脂肪组织的机制。
例如，报道已经证明了巨噬细胞诱导效率在单核细胞趋化因子MCP-1敲除小鼠和CCR2敲除小鼠中降低，但是该效率依据报道而变化。另外，也有报道表明巨噬细胞的浸润在MCP-1敲除小鼠中得到促进。
因此，存在讨论MCP-1和CCR2与巨噬细胞的诱导之间的因果关系的空间，至少它们不被认为是明确的（必要的）和基本的因素。
自然，还没有发现通过抑制巨噬细胞浸润进入脂肪组织的基本原因来在代谢多米诺的最上游中止代谢多米诺行进的方法。
同时，本发明人已经发现来自组织巨噬细胞的巨噬细胞凋亡抑制因子（AIM）（参见非专利文献9）。AIM是可溶性蛋白质，是清道夫受体富含半胱氨酸（SRCR）超家族的成员。AIM首先作为保护巨噬细胞免受各种凋亡诱导剂影响的凋亡抑制因子被发现（参见非专利文献9）。
因为AIM的结构具有3个SRCR结构域，与CD5的细胞外结构域相似，所以AIM也称作CD5L（CD5-相似）。
[文献列表]
非专利文献
非专利文献1：Weisberg,S.P.等人,J.Clin.Invest.,2003,112:1796-1808
非专利文献2：Xu,H.等人,J.Clin.Invest.,2006,116:115-124
非专利文献3：Lumeng,C.N.等人,J.Clin.Invest.,2007,117:175-184
非专利文献4：Odegaard,J.L.等人,Nature,2007,447:1116-1121
非专利文献5：Hevener，A.L.等人,J.Clin.Invest.,2007,117:1658-1669
非专利文献6：Lesniewski,L.A.等人,Nature Med.,2007,13:455-462
非专利文献7：Weisberg,S.P.等人,J.Clin.Invest.,2006,116:115-124
非专利文献8：Kanda,H.等人,J.Clin.Invest.,2006,116:1494-1505
非专利文献9：Miyazaki,T.等人,J.Exp.Med.189,413-422(1999)
非专利文献10：Arai,S.等人,Cell Metab.1,201-213(2005)
发明内容
技术问题
本发明旨在提供一种用于预防或治疗代谢综合症的方法，其可以通过抑制巨噬细胞浸润进入脂肪组织中在上游停止代谢综合症中类似多米诺效应的疾病链。
技术方案
在本发明者对AIM进一步研究过程中，我们发现在动脉粥样硬化病变中，巨噬细胞内吞脂质并产生AIM，由于产生的AIM支持病变部位巨噬细胞的凋亡抑制，所以产生的AIM也参与动脉硬化症的发展。另外，我们已经制备了AIM缺陷小鼠，并证实了AIM缺陷显著地减轻了动脉硬化症（Arai,S.等人,Cell Metab.1,201-213（2005））。
同时，本发明者已经发现，如在下述参考示例中所示，AIM也在浸润进入肥胖脂肪组织的巨噬细胞中表达。另外，我们发现：在存在AIM的情况下，前脂肪细胞分化成为成熟脂肪细胞受到抑制；在存在AIM的情况下，在成熟脂肪细胞中引起脂滴的分解（脂解作用）；在存在AIM的情况下，脂肪细胞的尺寸趋于变小；因此，AIM本身作为抗肥胖症药物是有用的。
另外，我们还发现：脂肪组织中产生的AIM结合到细胞表面上的CD36并通过内吞作用进入到脂肪细胞中；产生的AIM结合到细胞中的脂肪酸合酶（FAS）并抑制其活性，即，AIM的直接目标分子是FAS，并且AIM通过抑制FAS活性抑制前脂肪细胞分化成为成熟脂肪细胞并抑制脂滴的分解。
然而，本发明者现在已经发现看起来与上述发现明显相反的现象；即，AIM直接参与代谢综合症的发生。
具体地讲，我们已经通过体内研究证实：伴随肥胖症，AIM的血液浓度增加；即使在AIM敲除小鼠已经变肥胖之后，它们的脂肪组织中也几乎看不到巨噬细胞的浸润；并且通过对AIM敲除小鼠全身施用重组AIM，炎性巨噬细胞浸润进入脂肪组织中。
另外，我们已经通过体内研究证实，炎性巨噬细胞浸润进入脂肪组织中是由脂滴融解的诱导所导致的巨噬细胞的迁移引起的，脂滴融解是通过因肥胖症使AIM血液浓度增加而抑制FAS活性引起的。
另外，我们已经发现，即使在通过采取高脂肪饮食使AIM敲除小鼠变肥胖时，小鼠的葡萄糖代谢也不会下降，因此，即使小鼠变得肥胖，对AIM抑制也可以防止类似多米诺效应的代谢综合症的一系列疾病的后续链式起始和行进，这导致了本发明的完成。
因此，本发明涉及：
[1]一种用于预防或治疗代谢综合症或其相关疾病的方法，该方法包括将AIM抑制剂施用到对象的步骤；
[2]根据上述[1]所述的方法，其中，上述AIM抑制剂降低血液中AIM的稳定性；
[3]根据上述[1]所述的方法，其中，上述AIM抑制剂抑制AIM与CD36之间的结合；
[4]根据上述[1]所述的方法，其中，上述AIM抑制剂抑制AIM进入靶细胞中；
[5]根据上述[1]所述的方法，其中，上述AIM抑制剂抑制AIM从内含体转移到细胞质；
[6]根据上述[1]所述的方法，其中，上述AIM抑制剂抑制AIM结合到脂肪酸合酶（FAS）；
[7]根据上述[1]所述的方法，其中，上述AIM抑制剂抑制AIM的表达；
[8]根据上述[1]-[7]中任意一项所述的方法，其中，上述代谢综合症或其相关疾病是从由代谢综合症、肥胖症、胰岛素抗性、糖尿病、高血脂症、高血压、动脉硬化疾病、肝脏疾病、肝失疏泄、脑血管疾病、局部缺血性心脏病、心力衰竭、痴呆症、脑溢血、神经症、肾脏疾病、脂肪细胞因子分泌异常以及血液游离脂肪酸量异常组成的组中选择的至少一种；
[9]根据上述[1]-[8]中任意一项所述的方法，其中，上述对象是人；
[10]根据上述[1]-[8]中任意一项所述的方法，其中，上述对象是非人类的哺乳动物或鸟类；
[11]根据上述[10]所述的方法，其中，上述对象是狗或猫；
[12]一种用于预防或治疗代谢综合症或其相关疾病的药剂，该药剂包括从以下组中选择的至少一种：
抗AIM抗体；
抗CD36抗体；
对AIM基因具有RNAi效应的双链核酸；
AIM基因的反义核酸；
AIM基因的核酶；
结合到抗AIM抗体而不抑制FAS活性的蛋白质；
结合到CD36而不抑制FAS活性的蛋白质；
结合到FAS而不抑制FAS活性的蛋白质；以及
可溶CD36；
[13]根据上述[12]所述的治疗药剂，其中，上述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体或者抗体片段；
[14]根据上述[12]或[13]所述的治疗药剂，其中，上述结合到FAS而不抑制FAS活性的蛋白质结合到从由DH、ER、TE和CC组成的组中选择的至少一个结构域；
[15]根据上述[12]或[13]所述的治疗药剂，其中，上述结合到抗AIM抗体而不抑制FAS活性的蛋白质选自于由AIM片段、AIM变异体或其片段以及AIM嵌合蛋白质或其片段组成的组；
[16]根据上述[12]或[13]所述的治疗药剂，其中，上述结合到CD36而不抑制FAS活性的蛋白质选自于由AIM片段、AIM变异体以及AIM嵌合蛋白质组成的组；
[17]根据上述[12]或[13]所述的治疗药剂，其中，上述结合到FAS而不抑制FAS活性的蛋白质选自于由AIM片段、AIM类似物、AIM变异体以及AIM嵌合蛋白质组成的组；
[18]根据上述[15]-[17]中任意一项所述的治疗药剂，其中，上述AIM片段选自于包含AIM蛋白质的功能域及其保守区域的片段；
[19]根据上述[12]-[18]中任意一项所述的治疗药剂，其中，上述代谢综合症或其相关疾病是从由代谢综合症、肥胖症、胰岛素抗性、糖尿病、高血脂症、高血压、动脉硬化疾病、肝脏疾病、肝失疏泄、脑血管疾病、局部缺血性心脏病、心力衰竭、痴呆症、脑溢血、神经症、肾脏疾病、脂肪细胞因子分泌异常以及血液游离脂肪酸量异常组成的组中选择的至少一种；
[20]根据上述[12]-[19]中任意一项所述的治疗药剂，其中，上述对象是人；
[21]根据上述[12]-[19]中任意一项所述的治疗药剂，其中，上述对象是非人类的哺乳动物或鸟类；
[22]根据上述[21]所述的治疗药剂，其中，上述对象是狗或猫；
[23]一种用于预防或治疗代谢综合症或其相关疾病的方法，该方法包括施用根据上述[12]-[22]中任意一项所述的治疗药剂的步骤；
[24]一种生产AIM抑制剂的方法，该方法包括：
用蛋白酶处理AIM以获得AIM片段的步骤，以及
通过其中固定有结合到AIM的功能域或保守区域的抗AIM抗体的亲和柱纯化上述AIM片段的步骤。
发明效果
根据本发明的方法，可以通过抑制AIM来抑制巨噬细胞浸润进入肥胖个体的脂肪组织中以在上游停止代谢综合症的致命疾病组的链式起始。
附图说明
图1示出了肥胖小鼠和正常小鼠的血液AIM浓度的测量结果。
图2示出了使用抗巨噬细胞单克隆抗体（F4/80）等检测巨噬细胞浸润进入肥胖AIM+/+小鼠和肥胖AIM-/-小鼠的内脏脂肪组织中的结果。
图3示出了在对AIM-/-小鼠全身施用rAIM3周后使用抗巨噬细胞单克隆抗体（F4/80）等检测巨噬细胞浸润进入内脏脂肪组织中的结果。
图4示出了巨噬细胞迁移能力的测量结果。
图5是示出了用HFD饲喂12周之后的AIM+/+小鼠和AIM-/-小鼠的解剖学结果的照片。
图6示出了用HFD饲喂12周之后的AIM+/+小鼠和AIM-/-小鼠的体重和总脂肪量的结果。
图7示出了在饲喂HFD之前对AIM+/+小鼠和AIM-/-小鼠执行葡萄糖耐受性测试的结果。
图8示出了在饲喂HFD之后对AIM+/+小鼠和AIM-/-小鼠执行葡萄糖耐受性测试的结果。
图9示出了在饲喂HFD之前对AIM+/+小鼠和AIM-/-小鼠执行胰岛素耐受性测试的结果。
图10示出了在饲喂HFD之后对AIM+/+小鼠和AIM-/-小鼠执行胰岛素耐受性测试的结果。
图11示出了在饲喂HFD之后对AIM+/+小鼠和AIM-/-小鼠执行胰岛素敏感性测试的结果。
图12示出了使用抗巨噬细胞单克隆抗体、抗小鼠AIM多克隆抗体和抗IL-6抗体对从正常小鼠（未饲喂高脂肪饮食的小鼠）和肥胖小鼠的内脏脂肪组织制得的切片染色的结果。
图13示出了在3T3-L1细胞培养期间施用rAIM的时间表。
图14示出了按照图13中示出的时间表在第12天用红油O（oil-red-O）对细胞染色的结果。
图15示出了按照图13中示出的时间表在第12天通过定量实时PCR测量脂肪细胞标记的表达结果。
图16A示出了施用rAIM并用红油O染色的成熟脂肪细胞的结果。图16B示出了脂滴的尺寸，图16C示出了每单位面积的包含脂滴的细胞的数目。
图17示出了通过对成熟脂肪细胞施用rAIM并测量培养上清液中的丙三醇和游离脂肪酸获得的测量结果。
图18示出了通过对成熟脂肪细胞施用rAIM并通过定量实时PCR测量脂滴形成相关基因的表达获得的测量结果。
图19示出了在施用HFD20天后AIM+/+小鼠和AIM-/-小鼠的脂肪组织切片的HE染色的结果。
图20A示出了通过对分化或未分化3T3-L1细胞施用rAIM并针对AIM、PPARγ2和DAPI对细胞染色获得的结果。图20B示出了基于图20A的结果根据PPARγ2的表达水平对细胞分类并计算每100个每种细胞中包含rAIM的细胞的数目而获得的测量结果。图20C示出了通过对3T3-L1细胞施用rAIM并针对AIM和内含体或者AIM和溶酶体对细胞染色获得的结果。
图21示出了使用金纳米粒子对AIM标记之后与图20的样品相同的样品的电子显微镜观察的结果。
图22示出了通过使用CD36中和抗体处理3T3-L1细胞并检测rAIM对内吞作用的影响获得的结果。
图23示出了通过对CD36+/+小鼠和CD36-/-小鼠静脉注射rAIM并对从脂肪组织制得的切片针对AIM和巨噬细胞进行染色而获得的结果。
图24示出了通过注射对AIM-/-小鼠的脂肪组织直接施用用HA-标签标记的rAIM、使用脂肪组织通过抗HA抗体执行免疫共沉淀并通过免疫印记检测沉淀物中的FAS而获得的结果。
图25示出了通过使用抗Flag抗体或抗HA抗体的免疫共沉淀来证实用HA标签标记的rAIM和用FLAG标签标记的FAS在HEK293T细胞中的结合而获得的结果。
图26示出了通过用Flag标签标记FAS的每个结构域、在稳定地表达AIM-HA的HEK293T细胞中进行表达并通过使用抗Flag抗体或抗HA抗体的免疫共沉淀来证实FAS和AIM的结合而获得的结果。
图27示出了在存在或不存在rAIM（5μg/ml）并存在C75（25μM）的情况下处理6天的3T3-L1细胞的FAS活性的测量结果。
图28示出了AIM+/+小鼠和AIM-/-小鼠的脂肪组织中的FAS活性的测量结果。
图29示出了在之前3小时通过局部注射到脂肪中施用rAIM或BSA的AIM-/-小鼠的脂肪组织的FAS活性的测量结果。
图30示出了人源AIM的氨基酸序列和小鼠AIM的氨基酸序列及其之间的共有序列。
图31是示出FAS结构的概念图。
图32示出了用HFD喂饲12周的AIM+/+小鼠和AIM-/-小鼠的内脏脂肪量和皮下脂肪量的变化的测量结果。
图33示出了AIM-/-小鼠5周（在5周内，每周对小鼠施用HFD以及rAIM或BSA两次）的体重变化的测量结果。
图34示出了AIM-/-小鼠5周（在5周内，每周对小鼠施用HFD以及rAIM或BSA两次）的内脏脂肪量和皮下脂肪量的变化的测量结果。
图35示出了在图33和图34中示出的实验之后的AIM-/-小鼠的内脏脂肪中的脂肪细胞标记等的mRNA水平的测量结果。
图36示出了通过免疫印迹对狗、猫和小鼠的血清中的AIM蛋白的检测结果。
图37示出了通过基于FSP27表达的筛选获得的低分子量化合物的AIM抑制活性的评价结果。
图38示出了通过基于FSP27表达的筛选获得的低分子量化合物的AIM抑制活性的评价结果。
图39示出了通过基于FSP27表达的筛选获得的抗AIM抗体的AIM中和活性的评价结果。
图40示出了经全面医学检查的大约550个患者的血液AIM浓度的测量结果。
图41示出了随意选择的BMI为18-25或不小于35的献血者（包括外国人）的血液AIM浓度的测量结果。
具体实施方式
本发明的用于预防或治疗代谢综合症及相关疾病的方法包含将AIM抑制剂施用到对象的步骤。
在本说明书中，代谢综合症是表现为一系列疾病链的概念，该一系列疾病链通常从内脏脂肪型肥胖症（内脏脂肪积累）开始，然后通过脂肪组织的慢性炎症、来自脂肪细胞的脂肪细胞因子的分泌异常和血液游离脂肪酸的异常量等引起胰岛素抗性，其后引发诸如糖尿病、高血脂症和高血压等的与生活方式相关的疾病，最后发展为各种动脉硬化疾病。疾病链的下游可以包括肝脏疾病、肝失疏泄、脑血管疾病、局部缺血性心脏病、心力衰竭、痴呆症、脑溢血、神经症和肾脏疾病等。
在本说明书中，代谢综合症及相关疾病包括基于在代谢综合症的发作或行进的机制中以及在代谢综合症的发作或行进的过程中产生的各种异常的任何疾病、症状和异常。例如，他们包括但不限于代谢综合症、肥胖症、胰岛素抗性、糖尿病、高血脂症、高血压、动脉硬化疾病、肝脏疾病（包括脂肪肝、肝癌）、肝失疏泄、脑血管疾病、局部缺血性心脏病、心力衰竭、痴呆症、脑溢血、神经症、肾脏疾病、脂肪细胞因子分泌异常和血液游离脂肪酸量异常。
在本说明书中，以最广泛的意义和方式使用代谢综合症及相关疾病的预防或治疗，例如，胰岛素抗性的预防、延迟或改善；代谢综合症及相关疾病的发作的预防、延迟或改善；与代谢综合症及相关疾病有关的一种或多种症状的缓解；代谢综合症及相关疾病的诊断标准中的各项值的改善；等等。
作为代谢综合症的诊断标准的项的示例包括作为腹部肥胖的指标的腰部直径、血清甘油三酯值、HDL胆固醇值、血压、空腹血糖水平、葡萄糖耐量、胰岛素抗性和尿白蛋白质含量等。
在本说明书中，AIM抑制剂表示通过抑制AIM蛋白质的功能或表达来抑制机体中AIM蛋白质活性的物质。其示例包括但不限于低分子量化合物、高分子量化合物、肽、蛋白质和核酸等。
在本说明书中，如上所述，“AIM”是作为SRCR超家族的成员的可溶性蛋白质。作为一个示例，在图30中示出了人类AIM和小鼠AIM的氨基酸序列。
如下述的示例10中所示，在大部分健康个体（经过全面健康检查而无需医疗看护的个体）中，血液AIM浓度是5-20μg/mL。此外，如示例11中所示，具有35或更高BMI的对象与具有18-25BMI的对象相比，表现出显著高的血液AIM浓度。
本发明的AIM抑制剂可以抑制任何种类的AIM。例如，人类、人类之外的哺乳动物（例如，小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猫、猪、牛、马、猴）以及鸟类等中的AIM同源蛋白质的抑制剂也相当于本发明的AIM抑制剂。本领域普通技术人员可以从高水平的序列相似性和功能分析来评价其他哺乳动物或鸟类中的蛋白质是否是AIM的同源蛋白质。例如，小鼠AIM和人类AIM之间的氨基酸序列的同源性高达大约80%。另外，对于小鼠AIM和人类AIM，SRCR结构域中的共有序列（在具有SRCR结构域的诸如CD5、CD6等的其他分子中保守的氨基酸序列）完全相同。
作为示例，在SEQ ID NO:1、22、23、24和25中分别示出了人类、黑猩猩、狗、小鼠和大鼠的AIM的氨基酸序列。
另外，本发明的AIM抑制剂可以抑制AIM的类似物或变异体。AIM的类似物和变异体的示例包括具有其中经过缺失、取代或添加一个至几个氨基酸的AIM的氨基酸序列并且保持AIM的功能的蛋白质。本领域普通技术人员可以通过高水平的序列相似性或功能分析来确定某个蛋白质是否是AIM的类似物或变异体。
在本发明中，AIM的受AIM抑制剂抑制的功能是指将巨噬细胞浸润进入脂肪组织中的功能以及对于巨噬细胞浸润进入脂肪组织中所需的并且由AIM直接或间接地表现的任何功能。对于巨噬细胞浸润进入脂肪组织中所需的并且由AIM直接或间接地表现的任何功能的示例包括在脂肪细胞表面上导致结合到CD36的功能；通过内吞作用导致进入脂肪细胞中的功能；在脂肪细胞中导致结合到FAS的功能；导致抑制FAS的酶活性的功能；导致促进脂滴融解的功能；通过脂滴融解引发巨噬细胞迁移的功能；等等。
通过抑制AIM的这些功能中的任何功能，可以防止巨噬细胞浸润进入脂肪组织中，巨噬细胞浸润进入脂肪组织中导致脂肪组织和整个机体的慢性炎症。因此，即使是肥胖症，也不引发胰岛素抗性，并可以在上游停止代谢综合症疾病的链式发作。
（抑制AIM功能的AIM抑制剂）
抑制AIM的功能的AIM抑制剂通过直接或间接地作用于AIM来抑制AIM的全部功能或部分功能。抑制AIM功能的机制的示例包括但不限于降低血液中AIM的稳定性、抑制AIM与CD36的结合、抑制AIM进入靶细胞中、抑制AIM从内含体转移到细胞质中以及抑制AIM与FAS的结合等。
当施用降低血液中AIM的稳定性的抑制剂时，AIM在短时间内被降解，而未发挥其功能。
当施用抑制AIM与CD36结合的AIM抑制剂时，可以抑制AIM通过内吞作用进入靶细胞中，由此可以抑制AIM的功能。
作为抑制AIM与CD36结合的物质，可以使用抑制蛋白质之间结合的任何物质，例如可以使用抗AIM抗体和抗CD36抗体。如下述的参考示例中所示，施用抗CD36抗体可以抑制AIM进入靶细胞中。对于抗AIM抗体，将AIM对CD36的结合位点识别为抗原决定基的抗体是优选的。对于抗CD36抗体，识别CD36对AIM的结合位点的抗体是优选的。
本说明书中的“抗体”也包括抗体片段，并可以是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)2抗体、scFv、双特异性抗体以及合成抗体等。
可以根据本领域普通技术人员已知的方法生产这些抗体。例如，可以通过从用AIM免疫的非人类的哺乳动物中分离产生抗体的细胞，将产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞等融合以产生杂交瘤细胞，并纯化由杂交瘤细胞产生的抗体来获得抗AIM的单克隆抗体。另外，可以从用AIM免疫的动物的血清等中获得多克隆抗体。
这里使用的用于免疫的AIM可以是全长或片段，并且本领域普通技术人员可以合适地确定。当使用片段时，它优选地包含对CD36的结合位点。
另外，当能够获得有效地抑制AIM对CD36的结合的非人源的单克隆抗体时，也可以通过基因重组的方法生产抗体。例如，从产生抗AIM单克隆抗体的杂交瘤细胞通过标准方法来制备总RNA，使用市售的试剂盒制备编码抗AIM抗体的mRNA，并使用逆转录酶合成cDNA，由此可以获得编码抗AIM抗体的DNA。将包含该DNA的表达载体转染到合适的宿主细胞中并在合适的条件下培养宿主细胞以表达抗AIM抗体。
另外，还可以使用上述cDNA作为模版通过PCR方法来获得编码抗AIM抗体的CDR区域的DNA。利用编码CDR区域的DNA，可以根据常规方法通过基因重组方法来生产人源抗体和人源化抗体。例如，通过PCR方法来合成编码来源于非人源抗体的CDR区域的DNA和设计为连接到人源抗体的骨架区的DNA，再连接到编码人源抗体的恒定区的DNA，由此可以获得编码人源抗体的DNA。
根据已知的方法（利用限制酶的方法等）将这样的DNA***到表达载体（例如，质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒（AAV）、诸如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒等的植物病毒、粘粒、YAC、来源于EBC的附加体）中，将表达载体转染到合适的宿主细胞中以产生转化子。表达载体还可以包含调节抗体基因表达的启动子、复制起始点和选择标记基因等。可以根据宿主细胞和载体的种类合适地选择启动子和复制起始点。
然后，在合适的条件下培养转化子以表达抗AIM抗体的人源抗体。
例如，可以使用诸如哺乳动物细胞（CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、HeLa细胞、Vero细胞等）、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞（酵母、曲霉等）的真核细胞以及诸如大肠杆菌（E.Coli）、枯草芽孢杆菌等的原核细胞作为宿主细胞。
可以通过已知方法（例如，使用蛋白质A等的亲和柱、其他的色谱柱、过滤、超滤、盐析、透析等）的合适的组合来分离和纯化表达的抗体。
当本发明的抗AIM抗体是诸如Fab片段、F(ab’)2抗体和scFv等的低分子量的抗体时，也可以根据上述的方法，使用编码低分子量抗体的DNA表达抗体。另外，也可以通过使用诸如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等的酶的处理来生产抗体。
也可以使用结合到抗AIM抗体并且不抑制FAS活性的蛋白质作为抑制AIM和CD36结合的AIM抑制剂。这样的蛋白质与AIM竞争性地结合到CD36，并且抑制由于AIM结合到CD36而对FAS活性的抑制。
结合到抗AIM抗体并且不抑制FAS活性的蛋白质的示例包括AIM片段、AIM变异体或其片段以及AIM嵌合蛋白质或其片段。
然而，AIM片段不受具体限制，只要它包含AIM的部分肽，例如，可以使用包含AIM功能域或保守区域的5-150个氨基酸的片段。
可以使用具有AIM的经过缺失、取代或添加1-10个氨基酸的氨基酸序列并且不抑制FAS活性的蛋白质作为AIM变异体。
AIM嵌合蛋白质是指部分人源AIM蛋白质和来源于其他动物（例如小鼠）的AIM蛋白质的嵌合蛋白质。
结合到抗AIM抗体并且不抑制FAS活性的蛋白质还包括AIM变异体或AIM嵌合蛋白质的片段。
通过常规方法获得编码蛋白质的DNA并通过基因重组的方法使DNA表达蛋白质，这样可以表达结合到抗AIM抗体并且不抑制FAS活性的蛋白质。为了增加对CD36的亲和力和在血液中的稳定性，可以视情况改变和修改氨基酸序列。必要时，可以将蛋白质表达为与其他蛋白质和肽的融合蛋白质。
另外，也可以通过生产每个全长蛋白质并用蛋白酶处理该蛋白质来获得AIM片段、AIM变异体的片段和AIM嵌合蛋白质的片段。
另外，也可以使用结合到CD36而不抑制FAS活性的蛋白质作为抑制AIM和CD36的结合的AIM抑制剂。这样的蛋白质与AIM竞争性地结合到CD36，并且抑制因AIM结合到CD36而对FAS活性的抑制。
结合到CD36而不抑制FAS活性的蛋白质的示例包括AIM片段、AIM变异体或其片段以及AIM嵌合蛋白质或其片段。
当施用抑制AIM进入靶细胞中的AIM抑制剂时，可以抑制AIM结合到靶细胞中的FAS并抑制其酶活性的功能。
另外，抑制AIM从内含体转移到细胞质中的AIM抑制剂还抑制AIM结合到靶细胞中的FAS并抑制其酶活性的功能。
当施用抑制AIM和FAS的结合的AIM抑制剂时，可以直接抑制AIM对FAS的作用，例如，可以使用结合到FAS并且不抑制FAS活性的蛋白质。这样的蛋白质与AIM竞争性地结合到FAS，并且抑制因AIM结合到FAS而对FAS活性的抑制。
对于这种的蛋白质，优选结合到从DH、ER、TE和CC组成的组中选择的至少一个FAS结构域的蛋白质。
结合到FAS并且不抑制FAS活性的蛋白质的示例包括AIM片段、AIM变异体或其片段以及AIM嵌合蛋白质或其片段。
可以通过利用AIM抑制前脂肪细胞分化成为成熟脂肪细胞、引起脂肪细胞中的脂滴融解以及减小脂肪细胞的尺寸等事实的筛选方法从候选化合物中容易地选择上面解释的抑制AIM的功能的AIM抑制剂。
例如，可以通过包括以下步骤的筛选方法容易地选择AIM抑制剂：
（i）在用于分化成为脂肪细胞的条件下培养前脂肪细胞，并且仅将AIM或AIM与候选化合物加入培养基；
（ii）评价上述前脂肪细胞向脂肪细胞的分化；以及
（iii）选择与仅加入AIM相比，在与AIM一起加入时增加分化诱导效率的候选化合物。
例如，可以使用脂肪细胞中脂滴的产生以及脂肪细胞标记、前脂肪细胞标记和/或间充质干细胞标记的表达作为指标来执行步骤（ii）。
另外，可以通过包括以下步骤的筛选方法容易地选择AIM抑制剂：
（a）培养脂肪细胞，并且仅将AIM或AIM与候选化合物加入培养基；
（b）评价上述脂肪细胞中的脂滴融解；以及
（c）选择与仅加入AIM相比，在与AIM一起加入时降低脂滴融解效率的候选化合物。
例如，可以使用脂肪细胞的培养上清液中的丙三醇或游离脂肪酸的量、脂滴形成相关基因的表达等作为指标来执行步骤（b）。
另外，可以通过包括以下步骤的筛选方法容易地选择AIM抑制剂：
（1）培养脂肪细胞，并且仅将AIM或AIM与候选化合物加入培养基；
（2）评价上述脂肪细胞的尺寸；以及
（3）选择与仅加入AIM相比，在与AIM一起加入时增加脂肪细胞的尺寸的候选化合物。
例如，可以通过细胞的伊红染色来执行步骤（2）。
另外，AIM抑制剂包括以下步骤：
在候选化合物的存在或不存下在包括AIM的培养基中培养脂肪细胞或前脂肪细胞；以及
评价在上述培养之后被摄入上述细胞中的AIM。
例如，可以在细胞培养步骤之后通过固定细胞、赋予渗透性、加入被标记的以允许检测的抗AIM抗体以及温育细胞来检测摄入细胞中的AIM。
当在候选化合物的存在下细胞中的所述摄入减少时，可以评价该候选化合物通过抑制AIM进入细胞中抑制了AIM的功能。
另外，AIM抑制剂包括以下步骤：
在候选化合物存在或不存在下在包括AIM的培养基中培养脂肪细胞或前脂肪细胞；以及
评价在上述细胞中AIM和FAS的结合。
例如，可以通过制备细胞裂解液、使用抗AIM抗体进行免疫沉淀以及使用抗FAS抗体对免疫沉淀物进行免疫印迹来确定AIM和FAS的结合。
当在候选化合物的存在下AIM与FAS的结合减少时，可以评价该候选化合物通过抑制AIM和FAS的结合来抑制AIM的功能。
可以使用下面的化合物作为抑制AIM的功能的低分子量化合物。
Figure BDA00002769287400181
如下述示例中所示，证实这些化合物显著地抑制了最初由AIM加入引发的脂滴形成相关基因FSP27mRNA的表达的明显降低，并且抑制了AIM的功能。
还可以使用在下述示例9中产生的中和抗体（克隆11、12和17）作为抑制AIM的功能的分子。这些中和抗体也被证实显著地抑制了最初由AIM加入引发的脂滴形成相关基因FSP27mRNA的表达的明显降低。
（抑制AIM表达的AIM抑制剂）
抑制AIM表达的AIM抑制剂通过降低AIM在巨噬细胞中的表达水平来抑制AIM的全部功能或部分功能。
抑制AIM表达的AIM抑制剂的示例包括对AIM基因具有RNAi作用的双链核酸、反义核酸、核酶以及编码它们的核酸。
RNAi作用是由双链核酸引发的抑制序列特异性基因表达的机制。因为RNAi作用具有非常高的目标特异性并利用最初在体中存在的基因表达抑制机制，所以它是高度安全的方法。
例如，可以使用siRNA作为具有RNAi作用的双链核酸。当将siRNA用于哺乳动物细胞时，它是通常具有大约19-30个碱基，优选地大约21-25个碱基的双链RNA。另外，也可以使用能够被酶（Dicer）切割成siRNA的更长的双链RNA作为本发明的AIM抑制剂。
具有RNAi作用的双链核酸通常具有与靶核酸的一部分互补的一个碱基序列以及与其互补的另一个序列。具有RNAi作用的双链核酸通常在每个3’端具有两个突出的碱基（突出部分），但是也可以是不具有突出部分的平末端类型。例如，25个碱基的平末端RNA的优势在于它最小化干扰素应答基因的激活、防止有义链引起的脱靶效应并且在血清中表现出非常高的稳定性，25个碱基的平末端RNA还适合于体内使用。
可以根据已知的方法基于靶基因的碱基序列设计具有RNAi作用的双链核酸。另外，具有RNAi作用的双链核酸也可以是双链RNA、DNA-RNA嵌合型双链核酸、人工核酸或具有各种修饰的核酸。
反义核酸具有与靶基因（基本上是作为转录产物的mRNA）互补的碱基序列，通常是具有10个碱基长-100个碱基长，优选地15个碱基长-30个碱基长的单链核酸。当将反义核酸导入细胞中时，通过与靶基因杂交抑制基因的表达。只要反义核酸提供了对靶基因表达的抑制作用，它可以不与靶基因完全互补。本领域普通技术人员可以通过使用已知的软件等合适地设计反义核酸。反义核酸可以是DNA、RNA和DNA-RNA嵌合体中的任何核酸，或者可以被修改。
核酶是催化水解靶RNA的核酸分子，由具有与靶RNA互补的序列的反义区域和负责切割反应的催化中心区域组成。本领域普通技术人员可以根据已知的方法合适地设计核酶。核酶通常是RNA分子，也可以作为DNA-RNA嵌合体型分子使用。
编码上述具有RNAi作用的双链核酸、反义核酸和核酶中的任何一种的核酸也可以用作本发明的AIM抑制剂。当将包含这样的核酸的载体导入巨噬细胞中时，表达表现出抑制AIM表达的作用的具有细胞内RNAi作用的双链核酸、反义核酸和核酶。
对于编码具有RNAi作用的双链核酸的核酸，可以使用编码双链中的每个链的DNA，或者也可以使用编码单链核酸（其中，双链核酸通过环连接）的DNA。在后一种情况下，通过细胞内转录获得单链RNA，并且其互补部分在分子内杂交以形成发夹型结构。这种RNA称作shRNA（短发夹RNA）。当将shRNA转移到细胞质中时，酶（Dicer）切割环以形成表现出RNAi作用的双链的RNA。
在本发明中的用于预防或治疗代谢综合症的方法中，将上述AIM抑制剂施用到对象。
本说明书中的“对象”包括可以受到因AIM导致巨噬细胞浸润进入脂肪组织中而发生的代谢综合症侵袭的任何生物体，而不受具体限制。例如，可以是人类、人类之外的哺乳动物（例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪、牛、马、猴）和鸟类等。
例如，小鼠AIM和人类AIM表现出大约80%的高氨基酸序列同源性。另外，小鼠AIM和人类AIM在SRCR结构域中具有完全相同的共有序列（在具有SRCR结构域的诸如CD5、CD6等的其他分子中也保守的氨基酸序列），本发明的方法被认为对其他动物也有效。
另外，近年来，诸如狗、猫等的宠物由于太多高脂肪饲喂和缺少运动而具有代谢综合症的问题。因此，本发明的方法对于这些动物也特别地有用。
本发明的方法优选地用于血液AIM浓度高于正常水平的对象。如下述示例中所示，血液AIM浓度随着肥胖而增加。
另一方面，本发明人迄今已经发现，当血液AIM浓度是中低浓度时，AIM抑制脂肪组织中前脂肪细胞分化成为脂肪细胞，并促进脂滴融解。
从这些发现中，我们可以说，当血液AIM浓度是中低时，AIM在脂肪组织中表现出抗肥胖的作用，但是在高浓度时，AIM将巨噬细胞引入脂肪组织中并引发脂肪组织的炎症。
因此，当将AIM抑制剂用作预防或治疗代谢综合症的试剂时，对象的血液AIM浓度优选高于正常水平。
在本发明中，可以全身或局部、口服或肠道外施用AIM抑制剂。例如，可以选择诸如滴注等的静脉注射、肌肉注射、腹腔内注射、皮下注射、栓剂、灌肠剂和口服肠道剂等，可以根据病人的年龄和症状选择合适的施用方法。
另外，本发明的AIM抑制剂可以包含诸如防腐剂、稳定剂等的药学上可接受的载体。药学上可接受的载体是指可以与AIM抑制剂（活性成分）一起施用到对象的物质。药学上可接受的载体不受具体限制，只要它是药理上和药学上可接受的。其示例包括但不限于水、盐水、磷酸缓冲液、葡萄糖、丙三醇、诸如乙醇等的药学上可接受的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、可水溶葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、***树胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、双甘油、丙三醇、丙二醇、矿脂、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露醇、山梨醇、乳糖、表面活性剂、赋形剂、调味剂、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮液、等渗剂、粘合剂、分散剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等。
可以将本发明的AIM抑制剂制成药物制剂的常见形式。使用上述载体合适地制备药物制剂。药物制剂的形式不受具体限制，可以根据治疗目的合适地选择和使用药物制剂的形式。其代表性示例包括片剂、丸剂、散剂、溶液剂、悬液、乳剂、颗粒剂、胶囊剂、栓剂、注射剂（液体、悬浮液或乳状液）等。可以通过通常使用的方法生产这些制剂。
当本发明的AIM抑制剂包含核酸时，可以通过将核酸封入诸如脂质体、聚合物胶束、阳离子载体等的载体中而制成。另外，也可以使用诸如精蛋白的核酸载体。另外，还优选将抗体等结合到载体以靶向患部。此外，还能够通过将胆固醇等结合到核酸来增强血液滞留。另外，当本发明的AIM抑制剂包含编码siRNA等并在施用后在细胞中表达的核酸时，也可以将核酸***到诸如逆转录酶病毒、腺病毒、日本血凝病毒等的病毒载体或诸如脂质体等的非病毒载体中，并导入细胞内。
另外，本领域技术人员可以根据活性成分的种类合适地确定包含在本发明的AIM抑制剂中的活性成分的量。例如，在诸如抗AIM抗体等的抗体的情况下，剂量可以是但不限于0.025-50mg/kg，优选地0.1-50mg/kg，更优选地0.1-25mg/kg，进一步优选地0.1-10mg/kg或0.1-3mg/kg。
另外，本发明的AIM抑制剂还优选地与具有与AIM抑制剂相同的作用和效果的其他药剂（例如，抗动脉硬化药物、降脂药物和FAS抑制剂等）联合施用。可以与AIM抑制剂联合施用的药剂的示例包括但不限于从普罗布可、贝特类、他汀类、阿司匹林和昔布类组成的组中选择的至少一种抗动脉硬化药物，以及从C75、C93、浅蓝菌素、PHS11A、2-辛酸、乳酶素和由以下式（1）表示的化合物（其中，R1是氢原子或甲基或其药理上可接受的盐）组成的组中选择的至少一种FAS抑制剂。
式（1）
Figure BDA00002769287400231
只要表现出叠加或协同效应，则联合施用不受施用的两种或多种药剂中每种药物的施用期和剂量的限制，它们可以同时或单独施用。
如上所述，迄今AIM蛋白质已被认为引起对分化成脂肪细胞的抑制并引起脂滴融解（脂解作用），它本身表现出抗肥胖的作用。如下述示例中所示，现在已经确认AIM蛋白质引发巨噬细胞浸润进入脂肪组织中。另外，研究表明，当将AIM蛋白敲除时，即使在内脏脂肪型肥胖症中，葡萄糖代谢也未加剧。
因此，根据本发明的用于预防或者治疗代谢综合症的方法，施用AIM抑制剂防止M1巨噬细胞浸润进入脂肪组织中，以防止脂肪组织和整个机体的慢性炎症，因此，可以在其上游停止如多米诺效应般行进的疾病链。因此可以基本上预防和治疗代谢综合症。
本发明还包括AIM抑制剂的生产方法。
AIM抑制剂的生产方法包括用蛋白酶处理AIM以产生AIM的部分肽的步骤以及通过亲和柱纯化所述部分肽的步骤，在亲和柱中固定有结合到AIM的功能域或保守区域的抗AIM抗体。
示例
以下将基于不被解释为限制的示例详细地解释本发明。
示例1.血液AIM浓度因肥胖症增加
测量肥胖小鼠和正常小鼠的血清AIM浓度，其中，通过对C57BL.6（B6）小鼠施用高脂肪饮食（HFD，脂肪热量：60%）20周制备肥胖小鼠。图1中示出了结果。
与正常小鼠（瘦的）的血清AIM浓度相比，肥胖小鼠（肥胖的）的血清AIM浓度是正常小鼠的4倍或更高。
示例2.通过AIM诱导巨噬细胞浸润进入脂肪组织中
从用HFD喂食而变胖的AIM-/-小鼠和AIM+/+小鼠收集内脏脂肪组织，用抗巨噬细胞单克隆抗体（F4/80）、抗小鼠AIM多克隆抗体（SA-1）和抗IL-6抗体（MP520F3，R&D体系）对由脂肪组织制得的石蜡切片染色。
图2中示出了结果。如图2中所示，浸润进入正常小鼠（AIM+/+）的脂肪组织中的M1巨噬细胞表达AIM，但是在AIM敲除的小鼠（AIM-/-）中几乎没有发现巨噬细胞浸润进入脂肪组织中。
如上所述，AIM具有抑制巨噬细胞凋亡的功能。因此，当在AIM敲除小鼠的脂肪组织中没有检测到巨噬细胞时，有可能是巨噬细胞浸润进入脂肪组织中并发生凋亡。为了确认这种可能性，测量了肥胖的AIM敲除小鼠和肥胖的正常小鼠的脂肪组织中的巨噬细胞的凋亡。结果，它们的水平没有差异（数据未示出）。
因此，确认在脂肪组织中没有检测到巨噬细胞是由于巨噬细胞没有浸润进入脂肪组织中。
然后，通过静脉注射（50μg/机体/注射）对AIM敲除小鼠全身施用rAIM。在持续施用3周之后，用抗巨噬细胞单克隆抗体（F4/80）对由内脏脂肪组织制得的切片染色。
图3中示出了结果。如图中所示，观察到对AIM敲除小鼠全身施用rAIM引起巨噬细胞浸润进入脂肪组织中。
上述结果表明AIM引起巨噬细胞浸润进入脂肪组织中，因此，即使是内脏脂肪型肥胖症，对AIM抑制也可以抑制巨噬细胞浸润进入脂肪组织中。
示例3.巨噬细胞迁移机制的说明
分析小鼠巨噬细胞系RAW264.8（1×105/孔，24小时）的迁移能力。
使用CytoSelectTM96孔细胞迁移分析仪（CELL BIOLABS有限公司，5mm，荧光版）。图4中示出了结果。示出了通过从各RFU值减去背景（仅有培养基）而获得的值。脂肪酸鸡尾酒（Fatty AcidsCocktail）由肉豆蔻脑酸、软脂酸、油酸和亚油酸组成。
使用通过培养来自分化诱导第8天的成熟3T3-L1脂肪细胞6天而获得的细胞上清液（3T3-L1CM）、通过与rAIM共培养（3T3-L1+AIM CM）而获得的上清液以及通过与C75共培养（3T3-L1+C75CM）而获得的上清液。CM：条件培养基，ND：未检测到。**:p<0.01
如下述参考示例中所示，AIM引起成熟脂肪细胞中的脂滴融解。因此，在培养上清液中释放有来自脂滴的游离脂肪酸和丙三醇。
结合巨噬细胞迁移实验的结果，有力表明血液浓度伴随肥胖症而增加的AIM引起脂肪组织中的脂滴融解，这引起巨噬细胞浸润进入脂肪组织中。
示例4.对肥胖的AIM敲除小鼠的葡萄糖代谢下降的抑制
对野生型小鼠和AIM敲除小鼠施用HFD12周，并在施用前（瘦的）和施用后（肥胖的）通过葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验来测量葡萄糖代谢以及执行胰岛素敏感性试验。
在葡萄糖耐量试验中，在施用葡萄糖（3g/kg机体；腹腔内注射）之后120分钟内每30分钟测量血糖水平，在胰岛素耐量试验中，在施用胰岛素（0.75U/kg机体；腹腔内注射）之后120分钟内每30分钟测量血糖水平。
对用HFD喂饲后的AIM+/+小鼠和AIM-/-小鼠施用胰岛素（0.75U/kg机体；腹腔内注射），2小时后收集组织（白色脂肪组织、腓肠肌和肝脏），纯化蛋白质，并且通过免疫印迹测量磷酸化AKT和磷酸化GSK3β，由此执行胰岛素敏感性试验。
另外，在喂饲HFD之后测量每只小鼠的体重和脂肪总量。
图5示出了喂饲后的解剖学结果，图6示出了体重和脂肪总量的测量结果，图7-图10示出了葡萄糖代谢的测量结果，图11示出了胰岛素敏感性试验的结果。
如图5和图6中所示，喂饲HFD在AIM敲除小鼠（AIM-/-）和正常小鼠（AIM+/+）中都导致内脏脂肪型肥胖。在AIM敲除小鼠中，体重和脂肪组织量的增加更加显著。
然而，如图7-图10中所示，在肥胖的正常小鼠中，葡萄糖代谢显著下降，但在肥胖的AIM敲除小鼠中，葡萄糖代谢未下降。
另外，如图11中所示，在施用胰岛素之后，在AIM-/-小鼠中表达磷酸化AKT和磷酸化GSK3β，这证实通过胰岛素受体的信号转导起作用，即，胰岛素敏感性正常。另一方面，在野生型小鼠中没有检测到磷酸化AKT和磷酸化GSK3β，因此证实存在胰岛素抗性。
另外，通过高胰岛素正葡萄糖钳夹试验也证实AIM-/-小鼠具有正常的胰岛素敏感性（数据未示出）。
上述结果证明了在肥胖的AIM敲除小鼠中，巨噬细胞没有浸润进入脂肪组织中，因此抑制了脂肪组织和全身的炎症反应，并且胰岛素敏感性没有下降。
从肥胖的AIM敲除小鼠或肥胖的正常小鼠分离出胰腺中的胰岛，通过施用葡萄糖测量胰岛素的产生和分泌。结果发现两者之间没有差异。因此，证实了葡萄糖耐受性的差异不是基于胰岛素的产生或分泌，而是基于胰岛素敏感性的差异。
参考示例1.脂肪组织中的巨噬细胞中AIM的表达
从瘦小鼠（瘦的）和肥胖小鼠（肥胖的）收集内脏脂肪组织，其中，瘦小鼠通过对野生型B6小鼠饲喂普通饲料而得到，肥胖小鼠通过饲喂高脂肪饮食（HFD，脂肪热量60%）20周而得到，用抗巨噬细胞单克隆抗体（F4/80）、抗小鼠AIM多克隆抗体（SA-1）和抗IL-6抗体（MP520F3，R&D体系）对由脂肪组织制得的石蜡切片双染色。
图12示出了用荧光显微镜观察染色切片结果的一个示例。
肥胖小鼠脂肪组织中的巨噬细胞用抗巨噬细胞抗体染色，也用AIM特异性抗体染色（在肥胖的左侧）。因为AIM阳性巨噬细胞对IL-6（在肥胖的右侧）也呈阳性，所以它被认为是炎性巨噬细胞（M1）。
另一方面，从瘦小鼠收集的脂肪组织中的巨噬细胞对AIM和IL-6均呈阴性。
为了证实AIM在脂肪细胞中不表达，将来自肥胖小鼠的脂肪组织（附睾脂肪组织，被用作典型的内脏脂肪组织）用胶原酶处理之后进行分离，通过RT-PCR检测AIM的表达。然而，在纯化的脂肪细胞中没有发现AIM的表达。另外，用胰岛素、DEX和IBMX处理3T3-L1细胞，检测AIM的表达。结果，未发现表达。
上述结果证实了浸润进入脂肪组织中的巨噬细胞强烈地表达AIM。
参考示例2.AIM对前脂肪细胞分化成为脂肪细胞的抑制作用
[通过脂滴形成评价]
为了检测由浸润进入脂肪组织中的巨噬细胞产生的AIM对周围脂肪细胞的作用，执行实验以在3T3-L1前脂肪细胞分化成为成熟脂肪细胞的培养过程中加入AIM。
如图13中所示，按照四个时间表A-D培养3T3-L1细胞。在（A）中，不施用AIM，在（B）中，从分化诱导刺激开始持续10天（第2天-第12天）施用AIM，在（C）中，仅在分化诱导刺激的起始阶段（第2天-第4天）施用AIM，在（D）中，仅在分化诱导之前的克隆扩增阶段（第-2天-第2天）施用AIM。
对于AIM，使用重组的小鼠AIM蛋白质（rAIM）。通过在无血清培养基（FreeStyleTM293表达培养基；Invitrogen）中培养用表达小鼠AIM的载体（pCAGGS-mAIM-HA质粒）转染的来自人的HEK293T细胞来制备rAIM。在下面示出的其他参考示例中，使用的AIM是相似的rAIM蛋白质。通过将AIM以5μg/ml的浓度加入培养基来施用AIM。
另外，如图13中所示，通过培养4天（第-2天-第2天）来首先扩增3T3-L1细胞，之后在包含胰岛素、***（DEX）和异丁基甲基黄嘌呤（IBMX）的培养基中培养2天（第2天-第4天）以开始分化诱导刺激，在包含胰岛素的培养基中进一步培养2天（第4天-第6天）来诱导3T3-L1细胞的分化。
在分化诱导刺激期（第2天-第6天）之后，在不含这些分化诱导刺激因子的培养基中连续地培养细胞。然后用红油O对处于从分化诱导刺激开始那天起第10天（第12天）的细胞染色，观察3T3-L1细胞分化成为成熟脂肪细胞的状态。
图14示出了4个时间表A-D的各染色细胞的显微照片。
如图14中所示，当按照时间表C仅在分化诱导刺激的起始阶段（第2天-第4天）施加AIM时，几乎观察不到具有脂滴的细胞，3T3-L1细胞的分化几乎被完全抑制。换言之，在前述分化诱导物的存在下，AIM抑制3T3-L1细胞的分化。
即使在制备培养基之后使用纯化柱从包含分化诱导物和AIM的培养基中除去AIM时，所述分化诱导物分化3T3-L1细胞的能力也未失去（数据未示出）。因此，认为在分化诱导物和AIM之间不存在实质性的化学相互作用。
另外，当按照时间表B从分化诱导刺激开始持续10天（第2天-第12天）施用AIM时，几乎观察不到具有脂滴的细胞，3T3-L1细胞的分化几乎被完全抑制。另外，确认了AIM的这种分化抑制作用依赖于AIM的浓度（数据未示出）。当将施用于3T3-L1细胞的AIM的浓度降低至1μg/ml和0.1μg/ml时，AIM的分化抑制作用也下降。
另外，死细胞的数量没有由于施加AIM而增加。因此，认为AIM对分化的抑制没有引起细胞死亡，而使分化成为成熟脂肪细胞的3T3-L1细胞的数量降低。
另一方面，当按照时间表D仅在分化诱导之前（第（-2）天-第2天）施加AIM时，确认了几乎所有细胞都具有脂滴，并且几乎所有3T3-L1细胞都分化成为成熟脂肪细胞，就像按照时间表A不施加AIM的情况一样。即，即使仅在分化诱导之前施加AIM时，3T3-L1细胞分化成为成熟脂肪细胞也未受到抑制。然而，当从分化诱导之前直至分化诱导期和分化诱导期之后（第（-2）天-第12天）连续地施加AIM时，3T3-L1细胞向脂肪细胞的分化被完全抑制（数据未示出）。
当将人源rAIM用于AIM的施加时，来自小鼠的3T3-L1细胞的分化受到类似的抑制，这表明AIM的功能在人类和小鼠之间是可互换的。
[通过脂肪细胞标记的表达进行评价]
在从分化诱导刺激开始的第10天（第12天）回收按照图13中示出的时间表A-D培养的细胞，并使用7500快速实时PCR（7500FastReal-Time PCR）***（Invitrogen；CA，USA）通过ΔΔCT方法测量脂肪细胞标记（C/EBPα、PPARγ1、PPARγ2、CD36、Glut4）在mRNA水平的表达。表1中示出了使用的引物。
表1
f-PPARY1 CAAGAATACCAAAGTGCGATCAA(SEQ ID NO：2)
r-PPARY1 GAGCTGGGTCTTTTCAGAATAATAAG(SEQ ID NO：3)
f-PPARY2 CCAGAGCATGGTGCCTTCGCT(SEQ ID NO：4)
r-PPARY2 CAGCAACCATTGGGTCAGCTC(SEQ ID NO：5)
f-C/EBPα AGCAACGAGTACCGGGTACG(SEQ ID NO：6)
r-C/EBPα TGTTTGGCTTTATCTCGGCTC(SEQ ID NO：7)
f-CD36 TTGTACCTATACTGTGGCTAAATGAGA(SEQ ID NO：8)
r-CD36 CTTGTGTTTTGAACATTTCTGCTT(SEQ ID NO：9)
f-Glut4 GACGGACACTCCATCTGTTG(SEQ ID NO：10)
r-Glut4 GCCACGATGGAGACATAGC(SEQ ID NO：11)
图15中示出了结果。表明按照时间表A和D，脂肪细胞标记得到表达并且前脂肪细胞分化成为脂肪细胞。另一方面，按照其中与分化诱导刺激同时施用AIM的时间表B和D，脂肪细胞标记的表达受到抑制，表明向脂肪细胞的分化受到抑制。该结果与时间表A和D中形成脂滴以及时间表B和D中未形成脂滴是一致的。
如上所述，AIM抑制前脂肪细胞分化成为脂肪细胞。另外，通过观察脂滴的形成或者检测脂肪细胞标记、前脂肪细胞标记或间充质干细胞标记，可以容易地检测分化水平。
因此，根据脂滴形成或标记检测，当与单独加入AIM相比，将AIM与候选化合物一起加入使分化诱导效率增加时，可以评价所述候选化合物为抑制AIM的功能的化合物，当分化诱导效率降低时，可以评价所述候选化合物促进了AIM的功能。
参考示例3.AIM对脂肪细胞的脂滴融解的功能
[通过红油O进行评价]
按照图13中E示出的时间表对分化的3T3-L1细胞施用rAIM（5μg/ml）。在施用rAIM之前和施用rAIM之后执行红油O染色。图16A中示出了典型的照片。施用rAIM之后培养6天（rAIM（+）），细胞中的脂滴显著下降。
通过50个脂滴的平均直径确定脂滴的相对尺寸（相对脂滴尺寸）。误差条示出了标准误差。在5个不同区域测量单位面积包含脂滴的细胞的数目，并确定平均值。图16B、图16C中示出了各结果。
脂滴的相对尺寸和包含脂滴的细胞的数目显著下降。
结果表明rAIM引起脂滴融解，脂滴中包含的丙三醇和游离脂肪酸被释放到上清液中。
[通过培养上清液中的丙三醇或游离脂肪酸的量进行评价]
对3T3-L1脂肪细胞施加rAIM（5μg/ml），并在第2天、第4天和第6天测量释放到培养上清液中的丙三醇或游离脂肪酸的量。在施加rAIM之后，用PBS洗涤细胞两次，并在无血清培养基（FreeStyleTM293表达培养基；Invitrogen）中温育5个小时。回收缓冲液，使用丙三醇测定试剂盒和脂肪酸测定试剂盒（都来自Bio Vision有限公司）按照手册执行测量。
图17中示出了结果。当在培养之前加入rAIM时，培养上清液中的丙三醇和游离脂肪酸的量显著增加。
结果表明rAIM引起脂滴融解，包含在脂滴中的丙三醇和游离脂肪酸被释放到上清液中。
[通过脂滴形成相关基因的表达进行评价]
对3T3-L1脂肪细胞施加rAIM（5μg/ml），并在第2天、第4天和第6天使用7500快速实时PCR***（Invitrogen；CA，USA）通过ΔΔCT方法（每次n=3）测量脂滴形成相关基因（FSP27、围脂滴蛋白和脂肪分化相关蛋白（Adipophilin））的mRNA。
类似地，还测量了前脂肪细胞标记PREF-1的mRNA。用GAPDH将测量值标准化。表2中示出了使用的引物。
表2
f-Fsp27 CTGGAGGAAGATGGCACAATCGTG(SEQ ID NO：12)
r-Fsp27 CAGCCAATAAAGTCCTGAGGGTTCA
f-Perilipin TGCTGGATGGAGACCTC(SEQ ID NO：14)
r-Perilipin ACCGGCTCCATGCTCCA(SEQ ID NO：15)
f-Adipophilin AAGCATCGGCTACGACGACAC(SEQ ID NO：16)
r-Adipophilin GGACAGTCTGGCATGTAGTCTGGA(SEQ ID NO：17)
f-GAPDH AACTTTGGCATTGTGGAAGG(SEQ ID NO：18)
r-GAPDH GGATGCAGGGATGATGTTCT(SEQ ID NO：19)
f-PREF1 CGGGAAATTCTGCGAAATAG(SEQ ID NO：20)
r-PREF1 TGTGCAGGAGCATTCGTACT(SEQ ID NO：21)
图18中示出了结果。用第0天1.0的相对表达水平确定相对表达水平。误差条示出了标准误差。
在rAIM处理之后的第2天，脂滴形成相关基因的表达已显著下降。另一方面，在rAIM处理期间，前脂肪细胞标记的表达没有增加。这表明AIM没有导致成熟脂肪细胞的去分化。
如上所述，AIM融解成熟脂肪细胞中的脂滴。通过用显微镜观察、测量培养上清液的丙三醇或游离脂肪酸水平以及测量脂滴形成相关基因的表达等可以容易地检测脂滴融解的水平。
因此，根据培养上清液中丙三醇等的检测，当与单独加入AIM相比，将AIM与候选化合物一起加入使脂滴融解效率下降时，可以评价所述候选化合物为抑制AIM的功能的化合物，当脂滴融解效率增加时，可以评价所述候选化合物为促进AIM的功能。
参考示例4.AIM减小脂肪细胞尺寸的功能
[通过HE染色进行评价]
用高脂肪饮食（HFD）饲喂AIM+/+小鼠（+/+）和AIM-/-小鼠（-/-）（参见非专利文献1）20天，用HE对脂肪组织的切片进行染色。在显微镜的不同区域中，测量50个脂肪细胞的距离，并确定平均值±标准误差。图19A中示出了结果，图19B中示出了典型照片。与AIM+/+小鼠相比，AIM-/-小鼠的脂肪细胞明显大。
如上所述，AIM减小了脂肪细胞的尺寸。通过显微镜可以容易地检测减小的水平。
因此，根据尺寸的测量，当与单独加入AIM相比，将AIM与候选化合物一起加入使细胞尺寸增大时，可以评价所述候选化合物为抑制AIM的功能的化合物，当细胞尺寸减小时，可以评价所述候选化合物为促进AIM的功能。
参考示例5.在细胞表面上通过CD36将AIM摄入脂肪细胞中
将分化的3T3-L1细胞（胰岛素/DEX/IBMX刺激（+））和未分化的3T3-L1细胞（胰岛素/DEX/IBMX刺激（-））与rAIM（5μg/ml）温育3个小时，并利用AIM、PPARγ2和DAPI染色。对于利用PPARγ2染色，使用兔抗PPARγ2多克隆抗体（Abcam plc）。图20A中示出了结果。
上部示出了利用AIM和DAPI对细胞核染色的结果，中部示出了利用AIM和PPARγ2染色的结果，下部示出了利用AIM、PPARγ2和DAPI染色的相衬图像的结果。观察到AIM分散在脂肪细胞的细胞质中。
从下部组所清楚的是，高效表达PPARγ2的细胞包含许多脂滴。高效表达PPARγ2的细胞是充分分化的成熟脂肪细胞。表示为“pre”的右侧示出了未经分化诱导刺激的未分化的3T3-L1前脂肪细胞。
图20B示出了通过根据PPARγ2的表达水平对细胞分类而获得的每100个细胞中包含rAIM的细胞的数目。如图中所示，发现高效表达PPARγ2的成熟脂肪细胞表现出有效的rAIM摄入，而低表达PPARγ2的未充分分化的细胞表现出显著低的rAIM摄入效率。未经分化诱导刺激的前脂肪细胞（pre）表现出不摄入rAIM。
另外，用rAIM对3T3-L1脂肪细胞处理3个小时，利用AIM和内含体（使用FM1-43FX（Invitrogen公司））、AIM和溶酶体（使用Lyso Tracker Red DND-99（Invitrogen公司））进行染色，并在共聚焦显微镜下观察。图20C中示出了结果。
包含到脂肪细胞中的rAIM与内含体共定位，未观察到与溶酶体的共定位。
使用相同的样品，用金纳米颗粒标记AIM，并在电子显微镜下观察。具体地，用多聚甲醛固定经正常羊血清预处理30分钟的细胞，并与SA-1兔抗AIM多克隆抗体（1：600稀释）过夜温育。然后，将它们同与1nm金纳米颗粒（1:200；Nanoprobes有限公司）共价结合的羊抗兔IgG反应。使用HQ银（Nanoprobes有限公司）对细胞进行银增强、锇酸固定、脱水并直接在环氧树脂（Nisshin EM公司）中包埋。制备超薄切片，用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色，用电子显微镜（H-7100；Hitachi有限公司）观察。
图21中示出了结果。E表示内含体，P表示吞噬体或吞噬溶酶体，M表示线粒体，N表示细胞核，LD表示脂滴。
用金纳米颗粒标记的rAIM具有类似内含体的结构，具体地，聚集在其界膜附近（左上）。在细胞膜中，观察到rAIM的内吞作用（中上）。细胞核附近发现一些包含rAIM的颗粒，认为是晚期内含体（右上）。晚期内含体变性，并与rAIM一起释放到细胞质中。
在直径大且形状不规则的吞噬体或吞噬溶酶体、线粒体和脂滴中没有检测到AIM（下部）。
上述结果共同表明，AIM通过内吞作用进入脂肪细胞中，并在细胞中发挥功能。
然后，说明参与AIM摄入的细胞表面分子。由于CD36促进脂蛋白、脂肪酸等的摄入，并且在脂肪细胞和巨噬细胞（AIM发挥作用的目标）中都表达，所以关注CD36。
用CD36中和抗体（Abcam公共有限公司；Clone JC63.1小鼠IgA）处理3T3-L1脂肪细胞以抑制rAIM的内吞作用。图22示出了用中和抗体处理和不用中和抗体处理的典型照片以及每100个细胞中包含rAIM的细胞的数目。
如图中所示，用CD36中和抗体的处理显著地抑制了rAIM的摄入。
然后，对CD36+/+小鼠（野生型）和CD36-/-小鼠（Febbraio等人,J.Biol.Chem.,1999,274:19055-19062）静脉注射rAIM（300μg/小鼠，在PBS中），16小时后杀死小鼠，从脂肪组织制备切片。对切片中的AIM和巨噬细胞F4/80进行染色。图23中示出了结果。
如图中所示，在CD36-/-脂肪细胞中，AIM的信号显著下降，在CD36-/-脂肪细胞中，丧失了摄入rAIM的能力。
这些结果有力表明CD36引起rAIM的摄入。
如上所述，AIM通过细胞表面上的CD36进入脂肪细胞中。例如，通过使用可检测的标记抗AIM抗体使细胞内AIM可视化，可以容易地检测脂肪细胞摄入AIM的水平。
因此，使用这种方法，可以阐明候选化合物抑制AIM的功能的作用机制，并且可以证实所述化合物的效果。
例如，当与单独加入AIM相比，将AIM与抑制AIM的功能的候选化合物一起加入使AIM的细胞内摄入降低时，可以认为所述候选化合物通过抑制AIM的细胞内摄入抑制了AIM的功能。
参考示例6.AIM与FAS的结合
[通过免疫沉淀反应进行评价]
对AIM-/-小鼠的脂肪组织直接注射用HA标签标记的rAIM（在若干个点，总共100μg）。3小时后，为了确定rAIM-HA与内源FAS的结合，使用脂肪组织执行用抗HA抗体的免疫共沉淀。通过免疫印迹（WB）分析沉淀中FAS的存在。
图24中示出了结果。如图中所示，确定FAS和rAIM共沉淀，进入的AIM与细胞质中的FAS结合。
在HEK293T细胞中，用HA标签标记的rAIM和用FLAG标签标记的FAS共表达，通过使用抗Flag抗体或抗HA抗体的共免疫沉淀确定了AIM与FAS的结合。
图25中示出了结果。rAIM和FAS共沉淀，表明了AIM结合到FAS的能力。
然后，检测AIM在FAS中的结合区域。FAS包含酮酰基合成酶（KS）、丙二酰/乙酰转移酶（MAT）、脱水酶（DH）、中心核（CC）、烯酰基还原酶（ER）、酮基还原酶（KR）、酰基载体蛋白（ACP）和硫酯酶（TE）8个结构域。
图31中示出了FAS的结构。
用Flag序列标记FAS每个结构域的N端，并在HEK293T细胞中表达，其中，HEK293T细胞稳定地表达AIM-HA。通过使用抗Flag抗体或抗HA抗体的共免疫沉淀确定AIM-HA与FAS每个结构域的结合。
图26中示出了结果。发现结合到AIM的结构域是ER、DH、TE和CC。
使用由Ohara博士（Kazusa DNA研究机构）提供的cDNA克隆的一部分以及通过RT-PCR和pFLAG-CMV2载体（Sigma）克隆的一些片段来构建编码用FLAG标签标记的全长FAS cDNA（核苷酸：+1-7515）的序列。
通过使用全长FAS cDNA作为模版，亚克隆到pFLAG-CMV2载体来制备编码KS、MAT、DH、CC、ER、KR、ACP或TE的cDNA片段。
[AIM对FAS酶活性的抑制]
检测AIM对脂肪细胞或脂肪组织的FAS活性的影响。通过稍作改变的Kelley方法（Kelley等人,Biochem.J.,1986,235:87-90）测量FAS活性。将3T3-L1脂肪细胞或肥胖小鼠脂肪组织的裂解物与乙酰辅酶A和NADPH（包含0.4mM EDTA的0.2M钙磷酸缓冲液[PH7.0]）混合，将混合物放置在分光光度计比色皿中，并保持在30℃。加入20μl丙二酰辅酶A溶液（0.2mM）以开始酶反应，并以2cm/min的走纸速度（chart speed）测量OD的下降。基于结果，使用摩尔消光系数为6220的氧化NADPH评价FAS酶活性。
首先，测量在存在或不存在rAIM（5μg/ml）并且存在C75（25μM）的情况下处理6天的3T3-L1细胞的FAS活性。图27中示出了结果。另外，图28和图29中分别示出了AIM+/+小鼠和AIM-/-小鼠的脂肪组织的FAS活性以及在之前3小时通过脂肪内局部注射施用rAIM或BSA的AIM-/-小鼠的脂肪组织的FAS活性。
用HFD饲喂所有小鼠20周。溶解（裂解）样品并测量FAS活性。根据使用相同样品执行WB的结果，将数据转换为基于FAS蛋白质的数据。在每个组中，n是6，误差条示出了标准误差。
如图27中所示，rAIM处理显著地抑制了3T3-L1脂肪细胞中的FAS活性。抑制水平与特异性抑制FAS的C75的抑制水平相同。
与AIM+/+小鼠相比，AIM-/-小鼠体内脂肪组织显著增加（图28）。另外，对AIM-/-小鼠的脂肪组织直接施用rAIM降低了FAS活性。
如上所述，AIM结合到FAS并抑制其活性。
通过免疫沉淀反应等可以容易地检测AIM与FAS的结合水平。因此，使用这种方法，可以阐明候选化合物抑制AIM的功能的作用机制，并且可以证实所述化合物的效果。例如，当与单独加入AIM相比，将AIM与抑制AIM的功能的候选化合物一起加入使AIM与FAS的结合下降时，认为所述候选化合物通过抑制AIM与FAS的结合抑制了AIM的功能。
通过测量FAS活性的常规方法可以容易地检测对活性的抑制水平。因此，使用这种方法，可以阐明候选化合物抑制AIM的功能的作用机制，并且可以证实所述化合物的效果。例如，当与单独加入AIM相比，将AIM与抑制AIM的功能的候选化合物一起加入抑制了对FAS活性的抑制时，认为所述候选化合物通过抑制AIM对FAS活性的抑制功能抑制了AIM的功能。
参考示例7.AIM改变体重和脂肪量（体内）
用HFD饲喂AIM+/+小鼠（n=7）和AIM-/-小鼠（n=6）12周，测量内脏脂肪量和皮下脂肪量的改变。图32中示出了结果。内脏脂肪（附睾脂肪组织）和皮下脂肪的增加量在AIM-/-小鼠中更大。
然后，对AIM-/-小鼠腹腔施用（每周两次）rAIM（n=6；300μg/注射/小鼠）5周，同时用HFD饲喂，测量体重和脂肪组织量。图33和34中示出了结果。与施用牛血清蛋白（n=5；300μg/注射/小鼠）的对照相比，rAIM施用组在体重、内脏脂肪和皮下脂肪所有方面的增加明显小。
通过QPCR测量在从rAIM施用组和BSA施用组的小鼠的内脏脂肪组织提取的RNA中的脂肪细胞标记、前脂肪细胞标记和脂滴形成相关基因的mRNA水平。图35中示出了结果。用GAPDH的测量值将测量值标准化，并且通过与施用BSA的脂肪组织的表达水平相对的表达水平示出了测量值。
在rAIM施用组中，内脏脂肪中的FSP27、围脂滴蛋白和脂肪分化相关蛋白的mRNA水平也低。另一方面，PREF-1的mRNA水平通过施用rAIM而增加，但PPARγ2、C/EBPα和GLUT4的mRNA在rAIM施用组和BSA施用组之间未表现出差异。
参考示例8.狗和猫中AIM的表达
通过以下筛选方法寻找AIM抑制剂
<细胞>
3T3-L1（DS Biopharma，产品号为EC86052701）
<试剂>
.培养基
用于传代...DMEM（Invitrogen，产品号为11995-081）/10%CS/PS SM
用于测定...DMEM/10%FBS/青霉素+链霉素
用于分化诱导...DMEM/10%FBS/青霉素+链霉素/1μg/mL胰岛素/1μM***/0.5mM IBMX
.RT-PCR TaqMan基因表达Cells-to-Ct试剂盒(Applied Biosystems，产品号为AM1729)
.探针小鼠FSP27，小鼠GAPDH(Applied Biosystems，产品号为AM1729)
.mAIM
将在37℃下使用自由型CHO表达培养基（Invitrogen，产品号为12651-014）悬浮培养的CHO-S细胞制备为106细胞/mL，加入DMSO至终浓度为1.25%，并在37℃下悬浮培养3小时。将His6标签加至小鼠mAIM的C末端，用表达质粒转染CHO-S细胞，在表达质粒中，mAIM和His6标签连接到CMV或PGK启动子的下游。在37℃下培养细胞2小时之后，改变温度至29℃，当使用CMV启动子时继续培养7天，当使用PGK启动子时继续培养9天，回收培养上清液。将回收的培养上清液用于HisTrap HP柱（5mL，GE Healthcare制造），用20mM咪唑洗涤柱子并用300mM咪唑洗提mAIM。用PBS取代回收的溶液并浓缩以得到纯化的mAIM。
<测试化合物>
.10mM测试化合物，在DMSO中
<方法>
（1）细胞传代
.用PBS（-）洗涤在平皿中培养的细胞，用1/10浓度的胰蛋白酶剥离，在传代培养基中悬浮并对细胞进行计数。
.通常，在10cm平皿中以5×105-1×106个细胞/平皿传代细胞。
.在新的10cm平皿中种植细胞。
对于每隔一天的传代，以2×105个细胞/平皿种植细胞，
对于每隔两天的传代，以1×105个细胞/平皿种植细胞。
（2）分化诱导
-第1天
.用PBS（-）洗涤在平皿中培养的细胞，用1/10浓度的胰蛋白酶剥离，对分析培养基中悬浮的细胞计数。
.将细胞制备成5×104个细胞/mL，并以100μL/孔（5000个细胞/孔）在96孔板（IWAKI）中种植。
-第3天
.制备添加有mAIM（最终浓度400μg/mL）的分化诱导培养基和稀释的测试化合物（终浓度10μM）。
.除去96孔板的培养基，并加入上述分化诱导培养基（100μL/孔）。
-第5天
.除去培养基，用冷却至4℃的PBS（-）以100μL/孔洗涤。
.以25μL/孔加入裂解缓冲液（+1/100DNA酶），通过板震荡仪完全裂解细胞（室温下1分钟）。
.将细胞在室温下静置5分钟。
.以2.5μL/孔加入终止液，通过板震荡仪混合混合物（室温下2分钟）。
（3）RT-PCR测定
在96孔PCR板中制备以下逆转录反应溶液。
Figure BDA00002769287400381
Figure BDA00002769287400391
.逆转录反应
37°C60分钟
95°C5分钟
4°C保持
.在384孔PCR板中制备以下RT-PCR反应溶液。
Figure BDA00002769287400392
.通过ABI7900HT执行RT-PCR反应。
50°C2分钟
95°C10分钟
40个循环的以下反应
95°C15秒
60°C1分钟
用1280种化合物（n=1，10μm）执行初步筛选，并测量FSP27的表达水平（通过GAPD标准化）。取32个数据点（来自每个96孔板的前2个数据点）作为初次筛选结果，其中，该32个数据点表现出不大于(-)AIM+3SD筛选结果的活性。
执行再现性试验（n=3，10μm，4组AIM），选择在所有4组AIM蛋白质中表现出激活的FSP27表达水平（通过GAPD标准化）不小于(+)AIM+3×SD的化合物。选择了以下化合物，按顺序是DST-1，DST-2，DST-3和DST-4。
Figure BDA00002769287400401
图37、图38中示出了DST-1-DST-4的再现性试验的结果。证实了全部化合物显著地抑制由加入AIM引起的FSP27mRNA表达的显著下降，抑制了AIM的功能。
示例9.中和抗体
通过以下材料和方法制备中和抗体。
<动物免疫>
作为抗原，将小鼠AIM（2mg/mL）与等量TiterMax Gold（G-1Funakoshi）混合以得到乳剂。使用两只6周大的雌性Jcl:Wistar大鼠（CLEA Japan有限公司）作为待免疫动物，将50μL施用到后肢足底区域。2周之后，执行相似的施用，并且在2周或更长时间之后对足底区域施用抗原溶液（50μg）以为3天后的细胞融合做准备。
<骨髓瘤细胞>
使用小鼠P3U1作为骨髓瘤细胞，使用通过将谷氨酰胺和丙酮酸加入RPMI1640（11875-119GIBCO）并将FBS（S1560BWT有限公司）加至10%而制备的培养基作为生长培养基。加入适量的青霉素或链霉素作为抗生素。
<细胞融合>
在麻醉下，从大鼠提取心脏血液，无菌地分离腘***，放置于具有#200筛网的烧杯上并通过用硅棒推动制备细胞悬浮液。通过两次离心使用RPMI1640洗涤细胞，并计数。
通过离心收集对数生长期的骨髓瘤细胞、洗涤、制备为相对于淋巴细胞为5:1，并进行混合离心。
使用PEG1500（783641Roche）执行细胞融合。即，将1mL的PEG溶液与细胞团反应3分钟，将反应混合物逐步稀释，并通过离心洗涤。加入培养基，将200μL混合物加入96孔板（15个板），并培养1周。使用添加有HAT补充剂（21060-017GIBCO）并且FBS浓度被调节至15%的用于骨髓瘤细胞的培养基作为培养基。
<收集小鼠腹水>
解冻冷藏保存的细胞，执行生长培养，将1×107个细胞施用到在不少于1周前腹腔施用0.5ml朴日斯烷（42-002COSMO BIO）的裸鼠（BALB/cAJcl-nu/nu CLEA Japan有限公司）的腹腔，并在大约2周之后获得4-12ml腹水。通过离心处理除去固体并将腹水冷藏保存。
<电泳分析>
解冻腹水，用5μm过滤器处理，通过醋酸纤维素薄膜电泳确定包含在腹水中的单克隆抗体的条带。
电泳条件是pH8.6的0.05M巴比妥钠缓冲液（020-13415WakoPure Chemical Industries股份有限公司）、SELECA-V(ADVANTEC)、1mA/cm、25分钟，执行固定，并使用0.1%苯胺黑（2%乙酸）染色。
<抗体检测>
在室温下用rAIM处理每份浓度是200mg/mL的24份抗小鼠AIM大鼠单克隆抗体30分钟，然后以5mg/mL的rAIM终浓度加入分化的3T3-L1脂肪细胞（分化诱导的第4天），并培养24小时。从细胞中分离出RNA，通过定量RT-PCR对FSP27的mRNA量进行定量。
图39中示出了结果。
在克隆11、克隆12和克隆17的3个克隆中，显著地抑制了原本由加入rAIM诱导的FSP27mRNA表达的显著下降。在大鼠IgG对照中和用克隆15的处理中没有被抑制。
示例10.测量经过医学检查的对象的血液hAIM浓度
除了使用人源rAIM作为抗原之外，以与示例9中的方法相同的方法获得抗AIM抗体。
对于获得的克隆，根据布达佩斯条约的规定将AIM-CL-6和AIM-CL-7保藏。保藏号分别是NITE BP-1092和NITE BP-1093。
保藏处：独立行政法人（Incorporated Administrative Agency）技术评价国家机构（National Institute of Technology and Evaluation）专利微生物保藏中心（Patent Microorganisms Depositary）(NPMD：National Institute of Technology and Evaluation,Patent MicroorganismsDepositary；2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,Japan)。
保藏日期：2011年5月2日
使用AIM-CL-6和AIM-CL-7测量经医学检查的大约550个对象的血液hAIM浓度。具体地，使用用于捕获的AIM-CL-6、用于检测的AIM-CL-7和血清（50μL），一式两份执行分析。顺序稀释人源rAIM以建立标准曲线，由此确定浓度。
通过在HEK293T细胞中生产用HA标签标记的人源AIM蛋白质，并使用抗HA抗体从培养上清液中柱纯化该蛋白质来获得人源rAIM。
图40中示出了结果。
示例11.BMI和血液AIM浓度之间的关系
从献血者（包括外国人）中随意选择BMI为18-25或不小于35的献血者，并通过与图6中的方法相似的方法测量血液AIM浓度。通常，BMI越高被认为代谢综合症的风险越高。
图41中示出了结果。与BMI为18-25的献血者相比，在BMI不小于35的献血者中，血液AIM浓度显著要高。这有力表明血液AIM浓度与代谢综合症的风险相关，并且对AIM抑制能够预防或治疗代谢综合症。
[序列表自由文本]
SEQ ID NO:1是人源AIM的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是用于通过实时定量PCR分析PPARγ1表达的正向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:3是用于通过实时定量PCR分析PPARγ1表达的反向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:4是用于通过定量实时PCR分析PPARγ2表达的正向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:5是用于通过定量实时PCR分析PPARγ2表达的反向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:6是用于通过定量实时PCR分析C/EBPα表达的正向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:7是用于通过实时定量PCR分析C/EBPα表达的反向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:8是用于通过实时定量PCR分析CD36表达的正向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:9是用于通过实时定量PCR分析CD36表达的反向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:10是用于通过实时定量PCR分析GLUT4表达的正向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:11是用于通过实时定量PCR分析GLUT4表达的反向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:12是用于通过实时定量PCR分析Fsp27表达的正向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:13是用于通过实时定量PCR分析Fsp27表达的反向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:14是用于通过实时定量PCR分析围脂滴蛋白表达的正向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:15是用于通过实时定量PCR分析围脂滴蛋白表达的反向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:16是用于通过实时定量PCR分析脂肪分化相关蛋白表达的正向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:17是用于通过实时定量PCR分析脂肪分化相关蛋白表达的反向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:18是用于通过实时定量PCR分析GAPDH表达的正向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:19是用于通过实时定量PCR分析GAPDH表达的反向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:20是用于通过实时定量PCR分析PREF1表达的正向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:21是用于通过实时定量PCR分析PREF1表达的反向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:22是黑猩猩AIM的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23是狗AIM的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24是小鼠AIM的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25是大鼠AIM的氨基酸序列。
Figure IDA00002769288400011
Figure IDA00002769288400021
Figure IDA00002769288400031
Figure IDA00002769288400041
Figure IDA00002769288400051
Figure IDA00002769288400061
Figure IDA00002769288400071
Figure IDA00002769288400091
Figure IDA00002769288400101

Claims (24)

1.一种用于预防或治疗代谢综合症或其相关疾病的方法，所述方法包括将AIM抑制剂施用到对象的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述AIM抑制剂降低血液中AIM的稳定性。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述AIM抑制剂抑制AIM与CD36之间的结合。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述AIM抑制剂抑制AIM进入靶细胞中。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述AIM抑制剂抑制AIM从内含体转移到细胞质。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述AIM抑制剂抑制AIM结合到脂肪酸合酶。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述AIM抑制剂抑制AIM的表达。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中，所述代谢综合症或其相关疾病是从由代谢综合症、肥胖症、胰岛素抗性、糖尿病、高血脂症、高血压、动脉硬化疾病、肝脏疾病、肝失疏泄、脑血管疾病、局部缺血性心脏病、心力衰竭、痴呆症、脑溢血、神经症、肾脏疾病、脂肪细胞因子分泌异常以及血液游离脂肪酸量异常组成的组中选择的至少一种。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其中，所述对象是人。
10.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其中，所述对象是非人类的哺乳动物或鸟类。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述对象是狗或猫。
12.一种用于预防或治疗代谢综合症或其相关疾病的药剂，所述药剂包括从以下组中选择的至少一种：
抗AIM抗体；
抗CD36抗体；
对AIM基因具有RNAi效应的双链核酸；
AIM基因的反义核酸；
AIM基因的核酶；
结合到抗AIM抗体而不抑制脂肪酸合酶活性的蛋白质；
结合到CD36而不抑制脂肪酸合酶活性的蛋白质；
结合到脂肪酸合酶而不抑制脂肪酸合酶活性的蛋白质；以及
可溶CD36。
13.根据权利要求12所述的治疗药剂，其中，所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体或抗体片段。
14.根据权利要求12或13所述的治疗药剂，其中，所述结合到脂肪酸合酶而不抑制脂肪酸合酶活性的蛋白质结合到从由DH、ER、TE和CC组成的组中选择的至少一种结构域。
15.根据权利要求12或13所述的治疗药剂，其中，所述结合到抗AIM抗体而不抑制脂肪酸合酶活性的蛋白质选自于由AIM片段、AIM变异体或其片段以及AIM嵌合蛋白质或其片段组成的组。
16.根据权利要求12或13所述的治疗药剂，其中，所述结合到CD36而不抑制脂肪酸合酶活性的蛋白质选自于由AIM片段、AIM变异体以及AIM嵌合蛋白质组成的组。
17.根据权利要求12或13所述的治疗药剂，其中，所述结合到脂肪酸合酶而不抑制脂肪酸合酶活性的蛋白质选自于由AIM片段、AIM类似物、AIM变异体以及AIM嵌合蛋白质组成的组。
18.根据权利要求15-17中任意一项所述的治疗药剂，其中，所述AIM片段选自于包含AIM蛋白质的功能域及其保守区域的片段。
19.根据权利要求12-18中任意一项所述的治疗药剂，其中，所述代谢综合症或其相关疾病是从由代谢综合症、肥胖症、胰岛素抗性、糖尿病、高血脂症、高血压、动脉硬化疾病、肝脏疾病、肝失疏泄、脑血管疾病、局部缺血性心脏病、心力衰竭、痴呆症、脑溢血、神经症、肾脏疾病、脂肪细胞因子分泌异常以及血液游离脂肪酸量异常组成的组中选择的至少一种。
20.根据权利要求12-19中任意一项所述的治疗药剂，其中，所述对象是人。
21.根据权利要求12-19中任意一项所述的治疗药剂，其中，所述对象是非人类的哺乳动物或鸟类。
22.根据权利要求21所述的治疗药剂，其中，所述对象是狗或猫。
23.一种用于预防或治疗代谢综合症或其相关疾病的方法，所述方法包括施用根据权利要求12-22中任意一项所述的治疗药剂的步骤。
24.一种生产AIM抑制剂的方法，所述方法包括：
用蛋白酶处理AIM以获得AIM片段的步骤，以及
通过其中固定有结合到AIM的功能域或保守区域的抗AIM抗体的亲和柱纯化所述AIM片段的步骤。
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