CN110726844B - 靶向PSMC5基因的siRNA及PSMC5的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了靶向PSMC5基因的siRNA及PSMC5的应用。本发明提供了26S蛋白酶体调节亚基8(PSMC5)作为治疗阿尔茨海默病的新靶点的技术方案，通过抑制PSMC5的表达实现阿尔茨海默病的有效治疗，可为筛选研发抗AD药物提供新的思路和新的方法。本发明还提供了一种靶向PSMC5基因的siRNA，可通过抑制TOLL样受体激活介导的信号通路，抑制小胶质细胞的过度激活，从而保护海马神经元，有效改善和治疗AD；还可对潜在的小胶质细胞过度激活诱导的学习记忆、认知功能障碍类疾病人群的保护治疗作用。本发明可在神经变性疾病及老年医学领域得到广泛的应用，并产生巨大的社会与经济效益。

Description

靶向PSMC5基因的siRNA及PSMC5的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别涉及靶向PSMC5基因的siRNA及PSMC5的应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年性痴呆中最常见的类型，主要临床表现为认知功能减退、生活功能下降及精神行为异常的神经***退行性疾病。目前全球以每年460万新增病例(每7秒新增1例)的速度增长，到2040年全球AD患者将达到8110万。AD已成为仅次于心脏病、癌症、中风而导致老年人残疾和不能独立生活的主要原因，给家庭以及全社会带来严重危害和沉重的负担，防治形势十分严峻。因此，深入研究AD的发病机制，探讨可行的治疗手段对提高国民的健康水平，减轻国家财政负担具有重大的意义。
AD主要以脑组织淀粉样蛋白聚集、细胞内异常磷酸化的tau蛋白聚集形成神经纤维缠结(NFTs)、神经元丢失和小胶质细胞激活为主要病理特征。引起AD的病因迄今未十分明确，发病机制错综复杂。迄今为止，AD的各种临床治疗策略包括胆碱酯酶抑制剂、改善脑血流促进脑代谢、抗氧化、***治疗等均不能阻止病程的进展和解决中枢胆碱能神经元进行性减少这一根本问题。因此，目前所有的临床治疗基本无效或甚微，AD的有效防治陷入了困境。
小胶质细胞活化在AD发病机制中起着非常重要的作用。小胶质细胞广泛分布于中枢神经***，作为中枢神经***内的主要的免疫细胞，其在神经元的生存和整个生命活动中起着支持、营养、保护和修复等重要作用，是神经***不可缺少的成分。正常的情况下，小胶质细胞处于一种静息状态，当神经***受损时小胶质细胞可被激活，并可以进一步活化成巨噬细胞样小胶质细胞。Aβ活化的小胶质细胞介导的免疫炎性反应能引起AD患者海马神经元的细胞凋亡，进而逐渐出现认知功能减退。在AD发病的早期其主要作用的是Aβ寡聚体，而在维持AD患者脑内持久的炎症反应主要是纤维形式的Aβ。而不同聚集形式作用不同的原因可能在于它们结构的不同，而活化小胶质细胞需要的结构可能是β转角结构而不是β纤维。小胶质细胞还与AD患者老年斑形成具有密切关系。在老年斑中，聚集的Aβ位于核心位置，在Aβ沉积周围发现有活化的小胶质细胞，长期活化的小胶质细胞通过分泌的各种细胞因子可能加剧老年斑的形成，进而促进神经元纤维缠结。流行病学研究发现，长期服用NSAIDs的老年人AD发生率明显降低。动物实验结果显示，给予NSAIDs后，AD模型动物脑内Aβ沉积和活化的小胶质细胞的数量均明显减少，脑内炎性反应明显减轻。因此，以抑制小胶质细胞活化为靶点，抑制/减轻神经炎症反应，调控海马神经元-小胶质细胞神经网络的平衡，从而改善和阻断AD的进展，目前已成为防治AD的一个有效策略。
PSMC5又称之为S8，为26S蛋白酶体调节亚基8(26S proteasome regulatorysubunit 8)是泛素-蛋白酶体途径重要的调节亚基，具有分子伴侣样活性。1995年Lee在酵母双杂交试验中分离鉴定出PSMC5，1997年Hoyle运用荧光原位杂交技术对其进行定位，PSMC5由406个氨基酸组成，845.6KD大小，染色体定为在17q24-q25，该基因编码ATPase酶的亚基，是ATP酶多A家族中的一员。
目前尚未见任何关于PSMC5对小胶质细胞活化影响、改善和阻断AD的进展的相关报道。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供26S蛋白酶体调节亚基8(PSMC5)作为靶点在筛选或制备用于抑制小胶质细胞过度激活的药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供26S蛋白酶体调节亚基8(PSMC5)作为靶点在筛选或制备预防和/或治疗阿尔茨海默病、帕金森病或多发性硬化药物中的应用。
本发明的再一目的在于提供一种靶向PSMC5基因的siRNA。
本发明的又一目的在于提供所述的靶向PSMC5基因的siRNA或重组表达载体的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
26S蛋白酶体调节亚基8(PSMC5蛋白)作为靶点在筛选或制备用于抑制小胶质细胞过度激活的药物中的应用。所述的药物是抑制PSMC5表达水平的药物，发明人首次发现了下调PSMC5可有效抑制小胶质细胞的活化。
26S蛋白酶体调节亚基8(PSMC5蛋白)作为靶点在筛选或制备预防和/或治疗阿尔茨海默病、帕金森病或多发性硬化药物中的应用；优选为在筛选或制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物中的应用。通过下调PSMC5的表达水平，抑制TOLL样受体激活介导的信号通路，抑制炎症因子的释放和表达，抑制/减轻神经炎症反应，调控海马神经元-小胶质细胞神经网络的平衡，从而纠正学习记忆、认知功能障碍，提高运动协调能力，改善和阻断与小胶质细胞过度活化引起的疾病的进展。
一种靶向PSMC5基因的siRNA，所述的siRNA的正义链或反义链如下所示：
正义链：5’-GCAGUGGACUCCGUCAAUATT-3’(SEQ ID NO.1)，
反义链：5’-UAUUGACGGAGUCCACUGCTT-3’(SEQ ID NO.2)。
所述的siRNA经Blast Search检索确认与PSMC5以外的人类已知基因序列无同源性；能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，高效沉默PSMC5。
所述的siRNA干扰的靶序列位于PSMC5基因的mRNA编码序列的第56到76个碱基之间，即5’-GCAGUGGACUCCGUCAAUATT-3’。
所述靶向PSMC5基因的siRNA可交由生物技术公司合成得到。
含有编码所述的靶向PSMC5基因的siRNA的核苷酸序列的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。
所述的靶向PSMC5基因的siRNA或含有编码所述的靶向PSMC5基因的siRNA的核苷酸序列的重组表达载体在制备抑制小胶质细胞的活化药物中的应用。
所述的靶向PSMC5基因的siRNA或含有编码所述的靶向PSMC5基因的siRNA的核苷酸序列的重组表达载体在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病、帕金森病或多发性硬化药物中的应用；优选为在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
一种预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物，所述的药物以PSMC5基因为靶点，抑制PSMC5基因的表达水平。
所述的药物活性成分优选为所述的靶向PSMC5基因的siRNA或含有编码所述的靶向PSMC5基因的siRNA的核苷酸序列的重组表达载体。
所述的药物可以含有一种或者多种药学上可以接受的载体。
所述的载体优选为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂等。
所述的药物可以进一步制成片剂、颗粒剂、胶囊、口服液或注射剂等多种形式，各种剂型的药物可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供了治疗阿尔茨海默病的新靶点——26S蛋白酶体调节亚基8(PSMC5)，通过抑制PSMC5的表达实现阿尔茨海默病的有效治疗。
(2)本发明还提供了一种下调PSMC5表达的siRNA干扰片段，该siRNA对PSMC5的干扰效果显著，通过抑制TOLL样受体激活介导的信号通路，抑制炎症因子的释放和表达，抑制/减轻神经炎症反应，调控海马神经元-小胶质细胞神经网络的平衡，从而纠正学习记忆、认知功能障碍，提高运动协调能力，改善和阻断AD的进展。
(3)本发明的PSMC5siRNA还可应用于包括对潜在的小胶质细胞过度激活诱导的学习记忆、认知功能障碍类疾病人群的保护治疗作用。
(4)本发明的PSMC5siRNA可用于作为预防和/或治疗AD方面的生物制剂，其能够在神经变性疾病及老年医学领域得到广泛的应用，并产生巨大的社会与经济效益。
附图说明
图1是不同PSMC5siRNA的干扰效率分析图。
图2是PSMC5siRNA抑制LPS诱导BV2细胞NO生成的结果分析图。
图3是PSMC5siRNA减少LPS诱导BV2细胞IL-1β生成的结果分析图。
图4是不同PSMC5siRNA抑制LPS诱导BV2细胞PSMC5蛋白表达的结果分析图。
图5是腹腔注射LPS对小鼠学习和记忆能力的影响的结果分析图。
图6是腹腔注射LPS对小鼠在避暗实验的影响的结果分析图。
图7是腹腔注射LPS对小鼠爬杆实验的影响的结果分析图。
图8是通过侧脑室注射PSMC5siRNA1在各个时间点PSMC5表达水平的Western blot结果图；其中，第一行为注射PSMC5siRNA1，第二行为GAPDH内参对照组。
图9是PSMC5siRNA对I-κBa蛋白水平的影响结果图。
图10是PSMC5siRNA对LPS诱导BV2小胶质细胞Toll样受体4mRNA的影响结果分析图。
图11是PSMC5siRNA对LPS诱导BV2小胶质细胞炎症因子的影响的结果分析图。
图12是BV2小胶质细胞与原代海马神经元共培养的示意图。
图13是PSMC5siRNA抑制BV2活化介导的原代海马神经元的损伤的结果分析图。
图14是PSMC5siRNA抑制BV2活化介导的海马神经元的凋亡的细胞形态显微镜照片图。
图15是PSMC5siRNA对LPS诱导的学习记忆障碍小鼠在定位航行实验中的影响的结果分析图。
图16是PSMC5siRNA对LPS诱导的学习记忆障碍小鼠在爬杆实验中的影响的结果分析图。
图17是PSMC5siRNA对LPS诱导的学习记忆障碍小鼠在避暗实验中的影响的结果分析图。
图18是PSMC5siRNA对LPS诱导的学习记忆障碍小鼠血清中释放的促炎因子的影响的结果分析图。
图19是PSMC5siRNA对LPS诱导的学习记忆障碍小鼠血清中释放的抑炎因子的影响的结果分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中使用的试剂均从市场渠道购买得到。
实施例1高效沉默PSMC5siRNA最佳序列筛选
通过荧光定量PCR检测检测PSMC5mRNA的表达量，分析干扰效率；Griess reagent法检测BV2小胶质细胞(购自北京协和医学院细胞资源中心，细胞编号：3111C0001CCC000063)上清液NO2-含量，ELISA试剂盒竞争法测定BV2细胞上清液IL-1β含量，及Western blot法检测BV2细胞PSMC5蛋白的表达，筛选出最佳干扰序列。
1.BV2细胞培养
BV2细胞培养于含有10％胎牛血清的完全DMEM培养基中，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养。
2.PSMC5siRNA靶点的选择、设计及合成
根据小鼠PSMC5已知序列，将其编码区用RNAi设计软件设计出4条靶向沉默的干扰序列(PSMC5siRNA1,PSMC5siRNA2,PSMC5siRNA3,PSMC5siRNA4)及1个阴性对照序列(PSMC5siRNA NC)。四个靶点分别起始于56、273、388、653，具体如表1所示。
表1靶点序列表
Figure BDA0001733277680000061
设置如下组别进行后续检测：
(1)PSMC5siRNA实验组
PSMC5siRNA1,PSMC5siRNA2,PSMC5siRNA3,PSMC5siRNA4分别转染细胞。
(2)CONTROL组
阴性对照序列(PSMC5siRNA NC)转染细胞。
(3)LPS组
将BV2小胶质细胞20×104cells/well接种于6孔板内，1000ng/mL LPS刺激24h后，收集细胞上清液进行相应检测。
LPS溶液的配置：将LPS溶于3mL双蒸水中，配制成3mg/mL的母液，0.22μm微孔滤膜滤过，除菌分装于-20℃保存备用。
3.细胞转染
(1)细胞铺板：转染前一天将培养瓶中BV2细胞用0.25％胰蛋白酶消化，5×104cells/孔接种至24孔培养板中，24h后进行转染；
(2)将含有10％胎牛血清的完全DMEM培养基换成DMEM；
(3)A:取1μL/孔lip2000(使用前摇匀)，溶解于50μL Opti-mem无血清培养基，混匀室温放置5min；
(4)B:分别将2μL/孔、2.5μL/孔、3μL/孔的PSMC5siRNA FAM(包括PSMC5siRNA1～4、PSMC5siRNA NC，通过常规方法连接荧光基团FAM后分别进行研究)溶于50μL Opti-mem无血清培养基中；
(5)将A、B两管混合成C，室温孵育20min，以形成siRNA-转染试剂混合物；
(6)将C加入含有细胞及DMEM的孔中，轻轻摇晃孔板，使之混合均匀；
(7)在37℃、5％CO2培养箱中培养，4～6h后可将DMEM换成含有10％胎牛血清的完全DMEM培养；
(8)转染6小时后可使用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效率，只有转染成功的BV2细胞能可见FAM绿色荧光。
4.荧光实时定量PCR检测干扰效率
选择
Figure BDA0001733277680000071
Premix Ex TaqII试剂盒(试剂盒购自TAKARA公司)通过Tli RNaseHPlus法进行Real Time PCR，具体操作按照试剂盒说明书进行。
5.Griess reagent法测细胞上清液中NO含量
将BV2小胶质细胞20×104cells/well接种于6孔板内，通过步骤3细胞转染操作使PSMC5siRNA(lip2000:PSMC5siRNA＝1:2.5)作用24h后，加LPS(1000ng/mL)刺激后24h，收集细胞上清液，用Griess reagent法测细胞上清液中NO含量，具体操作按照试剂盒说明书进行，试剂盒购自Promega公司，货号为G2930。
6.酶联免疫吸附分析(ELISA)法测细胞上清液中IL-1β的含量
将BV2小胶质细胞20×104cells/well接种于6孔板内，通过步骤3细胞转染操作使PSMC5siRNA(lip2000:PSMC5siRNA＝1:2.5)作用24h后，加LPS(1000ng/mL)刺激后24h，收集细胞上清液，用ELISA法测细胞上清液中IL-1β的含量。试剂盒购自eBioscience公司，具体操作按照试剂盒说明书进行。
7.Western blot法测细胞PSMC5蛋白含量
将BV2小胶质细胞20×104cells/well接种于6孔板内，通过步骤3细胞转染操作使PSMC5siRNA(lip2000:PSMC5siRNA＝1:2.5)作用24h后，用PBS洗三遍，进行细胞蛋白提取、SDS-PAGE凝胶电泳、孵育抗体、显影、结果分析。其中，PSMC5抗体购自Cell SignalingTechnology公司，货号#13392。
PSMC5siRNA的干扰效率情况如图1统计结果所示，在转染四组不同序列PSMC5siRNA后的BV2小胶质细胞，与未转染的BV2小胶质细胞相比较，PSMC5mRNA的表达量均有所下降(P<0.01，P<0.05)，说明PSMC5siRNA有效地在抑制了BV2小胶质细胞PSMC5基因的mRNA表达。在四组siRNA之中，PSMC5siRNA1组的BV2小胶质细胞PSMC5mRNA的表达量下降最为明显(P<0.01)，差异具有统计学意义。
如图2统计结果所示，与CONTROL组相比较，LPS组能刺激BV2小胶质细胞NO生成(P﹤0.01)。PSMC5siRNA1组(P﹤0.01)、PSMC5siRNA2组(P﹤0.05)和PSMC5siRNA4组(P﹤0.01)BV2小胶质细胞，在转染PSMC5siRNA后，可明显抑制LPS导致BV2小胶质细胞活化所引起的NO生成，其中PSMC5siRNA1组抑制作用最为显著(P﹤0.01)。
如图3统计结果所示，与CONTROL组相比较，LPS能刺激BV2小胶质细胞IL-1β生成(P﹤0.01)。PSMC5siRNA1组(P﹤0.01)、PSMC5siRNA2组(P﹤0.01)、PSMC5siRNA3组(P﹤0.01)和PSMC5siRNA4组(P﹤0.01)BV2小胶质细胞，在转染PSMC5siRNA后，可明显抑制LPS导致BV2小胶质细胞活化所引起的IL-1β生成，其中PSMC5siRNA1组抑制作用最为显著(P﹤0.01)。
如图4统计结果所示，在转染四组不同序列PSMC5siRNA后的BV2小胶质细胞，与未转染的BV2小胶质细胞相比较，PSMC5蛋白的表达量均有所下降，说明PSMC5siRNA有效地在抑制了BV2小胶质细胞PSMC5表达。四组之中，PSMC5siRNA1组的BV2小胶质细胞PSMC5蛋白的表达量下降最为明显(P<0.01)，差异具有统计学意义。
综上所述，不同siRNA的干扰效率有所差异，PSMC5siRNA1(mus 56)干扰效率最佳，PSMC5siRNA1与其他3组siRNA之间对炎症因子的抑制及PSMC5的表达等均差异显著；后续实验以此干扰片段进行研究。
实施例2 AD动物模型的建立和PSMC5siRNA治疗剂量、时间的确定
采用9～11周的C57/6J雄性小鼠，腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)500μg/kg或750μg/kg。采用Morris水迷宫和避暗实验评价小鼠的认知功能，爬杆试验检测小鼠的运动协调性。
1.腹腔注射LPS对小鼠定位航行实验及空间探索实验的影响
我们通过设置如下组别，观察寻找平台的潜伏期用来评价小鼠记忆能力和空间认知的能力。
①正常对照组，腹腔给药生理盐水(0.1mL/10mg/d)，连续7天，给药后6h进行行为学测试。
②腹腔给药LPS(500μg/kg)组，连续7天，给药后6h进行行为学测试。
③腹腔给药LPS(750μg/kg)组，连续7天，给药后6h进行行为学测试。
(1)定位航行实验
在给药前，小鼠连续接受7天的训练，于第8天开始腹腔注射LPS，注射后6h开始进行水迷宫实验。在每天的水迷宫实验中，都随机的选取一个象限轻轻地将小鼠头部面向水池壁，尾部朝向水池中央放入水中。记录小鼠寻找到隐蔽平台所需的时间，作为潜伏期(s)。若小鼠在60s内未能找到平台，实验者需引导其至平台并停留10s，即潜伏期60s。
(2)空间探索实验
用于测量小鼠对平台空间位置的准确记忆，即记忆保持能力。于正式实验的第7天撤除平台，从平台所在象限的对立象限放入小鼠，让其在水中自由游泳60s，记录下小鼠在这段时间内穿过平台的次数及在平台象限内停留的时间。
结果如图5及表2所示，与正常对照组相比，LPS 500μg/kg组和750μg/kg组小鼠的逃避潜伏期增加(P<0.01)。在空间探索实验中，穿越平台的次数和在目标象限停留时间被用来测量动物的记忆储存及提取再现，于第7天撤除平台后，LPS 500μg/kg组和750μg/kg组小鼠在60s内穿越目标象限的次数和停留时间减少，差异具有统计学意义(P<0.01)。
表2腹腔注射LPS对小鼠空间探索实验的影响
Figure BDA0001733277680000091
*P<0.05,**P<0.01vs Saline group；#P<0.05,##P<.01vs LPS(750μg/kg)group.
2.腹腔注射LPS对小鼠避暗实验的影响
小鼠属夜行动物，喜好黑暗的地方逃避光亮之地。若小鼠在暗处给予电刺激，小鼠会被迫逃回亮处，并获得记忆。据此特性，人们设计此实验，检测小鼠的学习记忆能力。
具体方法为：给药前三天对小鼠进行训练，将小鼠头部背着洞口放入明室，打开闸门，不通电，让小鼠在明暗室两边自由穿梭3min。第3天，同样方法让小鼠适应环境3min后，插上电源通电，设定时间为5min，电压为39v。第4天，对小鼠进行腹腔注射LPS，6h后进行逃避实验。记下小鼠第一次受到电击后立即逃到安全的明室所用时间为逃避潜伏期(s)，还有5min内进入暗室的次数。5min后整个实验结束。
结果如图6所示，连续腹腔注射LPS 7天的小鼠在避暗实验中，与正常对照组相比，小鼠逃避潜伏期(见图6A)明显缩短(P<0.05)，而错误次数(见图6B)明显增加(P<0.05)。
3.腹腔注射LPS对小鼠爬杆实验的影响
爬杆实验所用的道具杆长60cm，粗1cm，外面缠2层纱布，于给药前五天对动物进行训练，腹腔注射LPS后6h进行爬杆实验，记录下小鼠爬完杆长上半部分所用的时间、下半部分所用的时间和全长所用的时间。3s内完成上述的某一动作记为3分、6s内完成记为2分、超过6s完成记为1分。最后将3次的得分相加为总分。
结果如图7所示，连续7天腹腔注射LPS后小鼠在爬杆试验中出现运动不协调，行动迟缓甚至跌落的现象，而正常对照组全程运动流畅。
4.侧脑室注射PSMC5siRNA的剂量、时间的确定
1.25％三溴乙醇(15μL/kg)腹腔注射小鼠进行麻醉后，将其固定在脑立体定位仪上，碘伏消毒头部皮肤，正中切开约1cm切口，参照小鼠脑立体定位图谱进行侧脑室注射不同体积的PSMC5siRNA1(浓度为1.16×109TU/mL)，以相同处理方式注射10μL的PSMC5siRNANC(lip2000:PSMC5siRNA＝1:2.5转染得到)作为对照(Control)。利用Western blot法摸索侧脑室注射PSMC5siRNA1的剂量、时间。
从图8可看出，侧脑室注射PSMC5siRNA1后，第3天PSMC5的表达量已开始下降，于第14天达到高峰，而第14天和第21天没有明显差异，且注射10μL最为明显。
实施例3 PSMC5siRNA应用于被激活的BV2小胶质细胞
将BV2小胶质细胞20×104cells/well接种于6孔板内，实验分为以下五组：
(1)Control组：不作任何处理；
(2)LPS组：LPS作用浓度为1000ng/mL；
(3)PSMC5siRNA+LPS组：转染为PSMC5siRNA 1+LPS；
(4)NC+LPS组：转染阴性对照序列PSMC5siRNA NC+LPS。
(5)NC组：转染阴性对照序列PSMC5siRNA NC。
转染方法同实施例1。
通过Griess reagent法检测LPS诱导BV2细胞NO释放，具体操作步骤及方法同实施例1。
通过酶联免疫吸附分析(ELISA)法测细胞上清液中IL-1β、PGE2、TNF-α的含量：将BV2小胶质细胞20×104cells/well接种于6孔板内，通过细胞转染操作使PSMC5siRNA(lip2000:PSMC5siRNA＝1:2.5)作用24h后，加LPS(1000ng/mL)刺激后24h，收集细胞上清液，用ELISA法测细胞上清液中IL-1β的含量。其中，IL-1β、TNF-α试剂盒购自eBioscience公司；PGE2试剂盒购自R&D公司，具体操作按照试剂盒说明书进行。
图9是PSMC5siRNA对I-κBa蛋白水平的影响结果图，其中，Control为第一条带灰度值比上第二条带灰度值的数值定位1.0,5.0为与Control灰度值的比值。
图10是PSMC5siRNA对LPS诱导BV2小胶质细胞Toll样受体4mRNA的影响结果分析图，以Control的比值作为参数1。
由图9～10可知，PSMC5siRNA1作用后可明显抑制LPS刺激BV2小胶质细胞I-κBa蛋白的降解，减少p65的核转移，降低小胶质细胞Toll样受体4(TLR-4)的表达。
由图11可知，抑制PSMC5的表达可在mRNA以及蛋白水平上明显抑制LPS诱导BV2小胶质细胞IL-1β、PGE2、NO、TNF-α的表达。
实施例4 PSMC5siRNA对小胶质细胞与神经元共培养体系中神经元活力、形态学的影响
从C57/6J乳鼠脑组织中提取得到原代海马神经元，具体提取步骤参见文献SingerCA,Figueroa-Masot XA,Batchelor RH,et al:The mitogen-activated protein kinasepathway mediates estrogen neuroprotection after glutamate toxicity in primarycortical neurons.J Neurosci 19:2455-2463,1999.，提取得到的原代海马神经元均已经过鉴定。
BV2小胶质细胞与原代海马神经元共培养：将BV2小胶质细胞接种于transwell双层培养皿的上室内，原代海马神经元接种于transwell双层培养皿的下室，进行共培养。根据实验要求，BV2小胶质细胞以2×105cell/well密度接种在24孔细胞transwell共培养培养板上室内(细胞A)，海马神经元以2×105cell/well密度接种在24孔细胞transwell共培养培养板下室(细胞B)，进行共培养，示意图如图12所示。
待二者细胞长满70～80％后，进行PSMC5siRNA1干扰，干扰的方法类似实施例1，通过步骤3细胞转染操作使PSMC5siRNA1(lip2000:PSMC5siRNA＝1:2.5)作用24h后，加LPS(1000ng/mL)刺激24h。
(1)Control组：不作任何处理；
(2)LPS组：LPS作用浓度为1000ng/mL；
(3)siRNA PSMC5：转染为PSMC5siRNA 1+LPS；
(4)NC组：转染阴性对照序列PSMC5siRNA NC。
由图13可知，在LPS刺激BV2小胶质细胞释放的炎症因子损伤下，海马神经元细胞存活率明显下降，而通过PSMC5siRNA1干扰下调PSMC5后，海马神经元细胞的存活率显著升高。
图14是激光共聚焦显微镜采集到的细胞图，MAP2显示的是海马神经元，Hoechst显示的是细胞核，TUNEL显示的是凋亡的细胞，Merged是MAP2图和Hoechst图及TUNEL的合并，即三种颜色均染上说明为凋亡的海马神经元。由图14可知，在LPS刺激BV2小胶质细胞释放炎症因子的损伤作用下，海马神经元凋亡小体明显增多，计数100个细胞中有41个细胞凋亡。经PSMC5siRNA1处理后，海马神经元凋亡小体显著减少，计数100个细胞中仅有8个细胞凋亡，与LPS组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例5 PSMC5siRNA应用于AD的治疗效果
实验动物采用SPF级C57BL/6J雄性小鼠，随机分为6组：
(1)正常对照组(Control组)，不给予任何处理；
(2)腹腔给药生理盐水+侧脑室给药生理盐水组(Saline组)，腹腔给药生理盐水(0.1mL/10mg/d)，连续腹腔给药7天，侧脑室给药1天，每次给药后6h进行行为学测试；
(3)腹腔给药LPS(750μg/kg)组(LPS组)，连续7d，每次给药后6h进行行为学测试；
(4)侧脑室注射PSMC5siRNA+腹腔给药LPS组(siRNA PSMC5+LPS组)，于腹腔给药LPS前7天进行侧脑室注射PSMC5siRNA1(浓度为1.16×109TU/mL的浓度，注射10μL)，腹腔给药LPS(750μg/kg)6h后进行行为学测试；
(5)侧脑室注射PSMC5siRNA1组(siRNA PSMC5组)，于腹腔给药LPS前7天进行侧脑室注射PSMC5siRNA1(浓度为1.16×109TU/mL的浓度，注射10μL)，每天都进行行为学测试；
(6)侧脑室注射PGC+腹腔给药LPS组(PGC+LPS组)，于腹腔给药LPS前7天进行侧脑室注射PGC(浓度1.96×109TU/mL)10μL，腹腔给药LPS(750μg/kg)6h后进行行为学测试。(PGC为干扰片段阴性对照，由合元生物技术(上海)股份有限公司合成)
参照实施例2的小鼠定位航行实验、空间探索实验、小鼠避暗实验进行行为学测试，对小鼠血清中的促炎因子和抑炎因子进行检测，结果如图15～19所示。
图15的定位航行实验显示，随着天数的增加，各组间小鼠寻找到平台的时间均逐渐缩短。但是腹腔给药LPS从第1d开始，小鼠的逃避潜伏期与腹腔给药生理盐水组相比，明显延长，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。而在PSMC5siRNA1后腹腔注射LPS，发现逃避潜伏期明显缩短，差异具有显著意义(P＜0.01)。而单独侧脑室给予PSMC5siRNA1组的小鼠，随着训练天数的延长，逃避潜伏期缩短，和正常对照组相比，差异没有显著差异(P＜0.05)，说明侧脑室给予PSMC5siRNA1对小鼠的学习记忆能力没有明显影响。
图16结果显示，连续7d腹腔给药LPS，小鼠在爬杆实验中出现运动不协调，迟疑，行动迟缓的现象，正常对照组和腹腔给予生理盐水组则全程运动流畅。(P＜0.01)。PSMC5siRNA+LPS组连续腹腔给药LPS，和LPS组比较，差异具有统计学意义(P＜0.01)。
图17结果显示，逃避实验中，连续7d腹腔给药LPS组的小鼠逃避潜伏期与正常对照组和生理盐水组相比明显缩短，错误次数明显增多(P＜0.01)。单独侧脑室给予PSMC5siRNA1组的逃避潜伏期和错误次数与正常对照组和腹腔注射生理盐水组相比，差异没有显著性。而PSMC5siRNA 1+LPS组和LPS组比较，逃避潜伏期明显增加，错误次数也明显降低(P＜0.01)，但与正常对照组和生理盐水没有明显差异(P＞0.05)。提示腹腔给药LPS，可使小鼠的逃避潜伏期明显缩短，错误次数增加，而PSMC5siRNA1能延长LPS腹腔给药后小鼠的逃避潜伏期，减少其的错误次数。
图18～19为侧脑室给予PSMC5siRNA1后，观察LPS诱导的学习记忆障碍小鼠血清中TNF-α、IL-1β、PGE2、NO、IL-4和IL-10浓度的变化。我们发现腹腔给药LPS后，小鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-1β、PGE2、NO和正常对照组及腹腔给予生理盐水组相比有明显的升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)。而抑炎因子IL-4和IL-10的浓度明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)。同时，PSMC5siRNA1+LPS组和正常对照组及腹腔给予生理盐水组相比，促炎因子降低(图18)抑炎因子升高(图19)(P＜0.05,0.01)。
由此可见，本发明的PSMC5siRNA可以抑制由LPS诱导的小鼠学习记忆损伤，并减少其引起的促炎因子(TNF-α、IL-1β、PGE2、NO)的释放，同时还可以增加其抑炎因子(IL-4、IL-10)的释放。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 靶向PSMC5基因的siRNA及PSMC5的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcaguggacu ccgucaauat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uauugacgga guccacugct t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccauccugag ggcaaauuut t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaauuugccc ucaggauggt t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccuaacaagg uggacccuut t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaggguccac cuuguuaggt t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcucugaacu gguacagaat t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
uucuguacca guucagagct t 21

Claims (9)

1.PSMC5蛋白作为靶点在筛选或制备用于抑制小胶质细胞过度激活的药物中的应用。
2.PSMC5蛋白作为靶点在筛选或制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
3.一种靶向PSMC5基因的siRNA，其特征在于，所述的siRNA的正义链或反义链如下所示：
正义链：5’-GCAGUGGACUCCGUCAAUATT-3’，
反义链：5’-UAUUGACGGAGUCCACUGCTT-3’。
4.含有编码权利要求3所述的靶向PSMC5基因的siRNA的核苷酸序列的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。
5.权利要求3所述的靶向PSMC5基因的siRNA或权利要求4所述的含有编码所述的靶向PSMC5基因的siRNA的核苷酸序列的重组表达载体在制备抑制小胶质细胞的活化药物中的应用。
6.权利要求3所述的靶向PSMC5基因的siRNA或权利要求4所述的含有编码所述的靶向PSMC5基因的siRNA的核苷酸序列的重组表达载体在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
7.一种预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物，其特征在于：
所述的药物以PSMC5基因为靶点，抑制PSMC5基因的表达水平；
所述的药物的活性成分为靶向PSMC5基因的siRNA或含有编码所述的靶向PSMC5基因的siRNA的核苷酸序列的重组表达载体；
所述的siRNA的正义链或反义链如下所示：
正义链：5’-GCAGUGGACUCCGUCAAUATT-3’，
反义链：5’-UAUUGACGGAGUCCACUGCTT-3’。
8.根据权利要求7所述的预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物，其特征在于：
所述的药物含有一种或者多种药学上可以接受的载体。
9.根据权利要求7所述的预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物，其特征在于：
所述的药物进一步制成片剂、颗粒剂、胶囊、口服液或注射剂。
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